A szérum amiloid P lerakódása a membránszerű glomerulopátia érzékeny és specifikus jellemzője maszkos IgG-kappa lerakódásokkal

Kapcsolatfelvétel: emily.li@wecistanche.com

Christopher P. Larsen1, Shree G. Sharma1, Tiffany N. Caza1, Daniel J. Kenan1, Aaron J. Storey2, Ricky D. Edmondson2, Christian Herzog2 és John M. Arthur2

KULCSSZAVAK:glomerulonephritis; maszkolt lerakódások; tömegspektrometria; membránszerű glomerulopathia; subepiteliális lerakódások

A Cistanche javíthatja a veseműködést

A membránszerű glomerulopathia maszkolt IgG-kappa lerakódásokkal (MGMID) a glomerulonephritis egy nemrégiben leírt mintája, egyedülálló kórszövettannal. A mintázatot subepiteliális és/vagy mesangiális jellemziimmunislerakódások, amelyek "maszkosak", az immunglobulin festéshez rutin immunfluoreszcenciával, de erősen festődnek az IgG és a kappa könnyű lánc számára proteázos emésztés után. A glomerulonephritis ilyen mintájában szenvedő betegek leggyakrabban olyan fiatal nők, akiknél proteinuria és homályos autoimmun betegség, például alacsony titerű antinukleáris antitestek szerepelnek. Itt összehasonlítottuk a kilenc MGMID vesebiopsziából származó lézerbefogású mikroboncolt glomerulusok tömegspektrometriás profilját nyolc biopsziával, amelyek a membrános glomerulopathia egyéb mintáit mutatták. Az MGMID-ben a legjelentősebben megnövekedett fehérje a szérum amiloid P volt. Az immunfestés azt mutatta, hogy az MGMID glomerulusaiban IgG-vel kolokalizált szérum amiloid P, de nem PLA2R-asszociált membrános glomerulopathiában. A szérum amiloid P pozitív volt mind a 32 MGMID biopszia glomerulusaiban, de negatív volt más típusú membranosus glomerulopathiák biopsziáiban, mint például a PLA2R és THSD7A esetében. A 173 biopszia közül négy glomeruláris szérum amiloid P festődésű biopszia nem felelt meg az MGMID vagy az amiloidózis kritériumainak. Mind a négy, pozitív szérum amiloid P festődésű biopszia glomerulopathiás membrános mintázatot mutatott IgG kappa lerakódásokkal, amelyek csak a "maszkolás" hiányában különböztek az MGMID-től. Így a glomeruláris lerakódásokon belüli pozitív festődés a szérum amiloidra vonatkozóan a glomerulonephritis egy egyedülálló formáját azonosítja, amely valószínűleg a betegség közös patofiziológiai mechanizmusával rendelkezik.

A maszkolt IgG-kappa lerakódásokkal járó membránszerű glomerulopathia (MGMID) a glomerulonephritis 2014-ben leírt kórszövettani mintája, amely az első leírása volt az úgynevezett maszkolt glomeruláris lerakódásoknak.1 Ennek a betegségnek a jellegzetes hisztopatológiája magában foglalja a mesangialis és a subepiteliális lerakódásokat. lerakódások IgG kappa korlátozással. Érdekes módon, bár a 3. komplement komponens (C3) festődése gyakran nyilvánvaló a fagyasztott szövetek rutinszerű immunfluoreszcenciájával, az Ig-festés gyakran elfed, ami azt jelenti, hogy hamis negatív festődést mutat rutin immunfluoreszcenciával, de pozitív festődést, ha proteázos emésztés után paraffinba ágyazott szöveten megismétlik. Így, hacsak a patológus nem tart fenn magas gyanakvást erre az entitásra vonatkozóan, tévesen C3 glomerulopathiaként diagnosztizálható. Más entitások, amelyekről leírták, hogy ezt a maszkoló jelenséget mutatják a glomeruláris lerakódásokban, közé tartozik a membranoproliferatív glomerulonephritis maszkolt monotípusos Ig-lerakódásokkal és a krioglobulinémiás glomerulonephritis.2,3

Azok a betegek, akikben a biopszia során MGMID-t találtak, leggyakrabban fiatal nők<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>95 százaléka) negatív volt a monoklonális Ig-ekre szérumfehérje-elektroforézissel, és nem észleltek olyan esetet, amely összefüggésben állna mögöttes hematológiai rosszindulatú daganattal.4

Feltételezték, hogy az MGMID-ben szenvedő betegek közös klinikopatológiai leletei a betegségüket kiváltó közös molekuláris patofiziológiai mechanizmusra utalhatnak. Ennek az entitásnak az első jelentésében az volt a szándékunk, hogy meghatározzunk egy kohortot a további elemzéshez.1 Itt leírjuk a protein szérum amiloid p komponens (SAP) jelenlétét, amely egyedülállóan megtalálható az MGMID glomerulusok lerakódásaiban. Az SAP immunfestése a glomeruláris lerakódásokban egy érzékeny és specifikus technika az MGMID diagnosztizálására, amely egyben patogén betekintést is nyújt.

1. ábra|A szérum amiloid P-komponens (SAP) szignifikánsan feldúsul a maszkolt IgG-kappa-lerakódásokkal rendelkező, membranosus-szerű glomerulopathiában szenvedő betegek mikrodisszekált glomerulusaiban. A statisztikai elemzéshez a MaxQuant (Max Planck Biokémiai Intézet, Planegg, Németország) normalizált intenzitáson alapuló abszolút kvantifikációs értékeit használtuk. A szaggatott vonalak a hajtásváltozás és a P-érték heurisztikus határértékeit ábrázolják. (a) Egy vulkándiagram, amely 3 foszfolipáz A2 receptor (PLA2R) pozitív membrános esetet hasonlít össze másokkal, 2 fehérjét azonosít, amelyek egyértelműen kiugróak a jobb felső negyedben. (b) A 2 thrombospondin 1. típusú domént tartalmazó 7A (THSD7A)-pozitív membrános esetet másokkal összehasonlító vulkándiagram két olyan fehérjét azonosít, amelyek egyértelműen kiugróak, és a THSD7A mutatja a legnagyobb hajtásváltozást. (c) A membránszerű glomerulopathia mintáit maszkolt IgG kappa lerakódásokkal összehasonlító vulkándiagramon az összes többi típusú membrános esettel összehasonlítva 6 fehérjét azonosítanak, amelyek egyértelműen kiugró értékek a jobb felső negyedben. C6, 6. komplement komponens; C7, 7. komplement komponens; CFHR1, a komplement H-faktorral rokon protein 1; HP1BP3, heterokromatin protein 1 kötő fehérje 3; HPRT1, hipoxantin-foszforibozil-transzferáz 1; IGHG3, Ig nehéz állandó gamma 3.

EREDMÉNYEK

Mikrodisszekciós glomerulusok lézeres befogása tömegspektrometriája

A 9 MGMID-esetből származó lézeres befogásos mikrodisszekált glomerulusok tömegspektrometriás analízisét 8 membranosus glomerulopathiás (MG) esettel hasonlították össze, köztük 3 esetben foszfolipáz A2 receptor (PLA2R)-pozitív MG-vel, 2 esetben pedig 1-es típusú trombospondin (7A domént tartalmazó) esettel. THSD7A) – pozitív MG, és 3 esetben lupus MG. Ebben az elemzésben összesen 1695 fehérjét azonosítottak. Elvbizonyítási analízist végeztünk annak tesztelésére, hogy az MG betegség patogenezisében részt vevő fehérjék kimutathatók-e tömegspektrometriával. Minden ismert membrántípus esetében a fehérje differenciális abundanciát összehasonlítottuk a többi csoporttal normalizált intenzitáson alapuló abszolút kvantifikációs (iBAQ) értékek segítségével. A statisztikai analízist Welch-féle t-próbával végeztük, és az eredményeket egy vulkán diagramon vizualizáltuk. A PLA2R szignifikánsan nagyobb volt a PLA2R-hez kapcsolódó MG esetekben, és a legerősebb hajtásváltozást mutatta (1a. ábra). A THSD7A mutatta a legerősebb hajtásváltozásokat a THSD7A-hoz kapcsolódó MG-ben, bár nagyobb P-értékkel, a csoport alacsony mintamérete miatt (n ¼ 2; 1b. ábra). Összességében ez az alapelv-analízis kimutatta, hogy a lézerrel rögzített mikrodisszekciós glomerulusok tömegspektrometriája képes azonosítani azokat a fehérjéket, amelyek jelentősek a membranosus glomerulopathiában előforduló betegségek patogenezisében.

Ezt követően ezzel a megközelítéssel azon fehérjék azonosítására törekedtünk, amelyek potenciálisan részt vesznek az MGMID patogenezisében. Összesen 6 fehérje volt szignifikánsan nagyobb mennyiségben az MGMID mintákban a többi csoporthoz képest (1. táblázat). A legnagyobb változást mutató fehérje az SAP volt (1c. ábra). A fennmaradó fehérjék IgG Kappa-ból, 3 komplementfehérjéből és a heterokromatin-1-kötő fehérjéből 3 (HP1BP3) álltak. Az SAP-t tekintették a legjobb jelöltnek, mivel minden MGMID mintában kimutatták, és a legnagyobb eltérést mutatta a bőségben a nem MGMID mintákhoz képest. Az IgG kappa lerakódásokkal járó membránszerű glomerulopathia eseteiből származó, lézeres rögzítéssel mikrobontott glomerulusokban tömegspektrometriával azonosított összes Ig az S1 kiegészítő táblázatban látható. Az S2 kiegészítő táblázat tartalmazza az összes olyan fehérje mintavételezéséből származó spektrális számlálást, amely MGMID-mintákban 1 $ log2-rel megnövekedett mennyiséget és #0,1 P-értéket mutatott.

Cistanchejavíthatvesefunkció

SAP festés membránszerű glomerulopathia esetén

Az SAP fehérje elleni poliklonális nyúl antitest (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) erős pozitív festődést mutatott a konfokális analízissel IgG-vel kolokalizálódó MGMID-es esetek glomeruláris alapmembránja mentén. Az SAP nem mutatott kolokalizációt IgG-vel a PLA2R-hez kapcsolódó MG glomerulusaiban (2. ábra). A HP1BP3 elleni poliklonális nyúl antitestet 4 biopsziában teszteltük MGMID-vel, és mind a 4 esetben negatív festődést mutatott a glomeruláris lerakódásokban.

Összesen 211-en végeztek SAP-festéstvesebiopsziákglomerulonephritissel (2. táblázat). Összesen 36 immuntípusú lerakódásos eset festődött SAP-ra pozitívan. A pozitív festődésű esetek mindegyike bizonyos kórszövettani jellemzőket mutatott, beleértve a mezangiális és szubepitheliális lerakódásokat IgG kappa restrikcióval, és fénymikroszkóppal nem endokapilláris vagy membranoproliferatív elváltozásokat. Az SAP minden esetben negatív volt, olyan maszkolt lerakódásokkal, amelyek nem MGMID voltak, beleértve 3 esetben a krioglobulinémiás glomerulonephritist és 3 esetben a maszkolt membranoproliferatív glomerulonephritist. Negatív volt mind a 19 monoklonális Ig-lerakódásos glomerulonephritis (PGNMID) esetében, beleértve az IgG1 kappa (4 eset), IgG2 lambda (1 eset), IgG 3 kappa (8 eset) és IgG3 lambda (6 eset) esetét. ). Mind a 30 poliklonális membrános glomerulopathia (PLA2R, THSD7A, lupus és szegmentális) esete SAP-ra negatív volt. A glomerulonephritis további formáit is tanulmányozták, amelyek negatívak voltak. A fertőzéssel összefüggő glomerulonephritisek közül 7 pozitív IgG festődést mutatott, és 6 esetben szubepitheliális púpos lerakódások mutatkoztak. Ahogy az várható volt, mind a 6 amiloidózisos eset pozitív festést mutatott az amiloid lerakódásokban. A foltos lerakódási mintázat azonban éles ellentétben állt az MGMID esetén jelenlévő szemcsés festődéssel. A különféle vesebetegségek SAP-festésén lévő glomerulusok reprezentatív mikrofelvételei az S1 kiegészítő ábrán láthatók.

Mind a 32, korábban MGMID-ként azonosított eset SAP-pozitív volt. Ezenkívül a glomerulusokban 25 monotípusos IgG-lerakódást mutató membranosus glomerulopathia esetéből 4-ben pozitív SAP-festődés mutatkozott, amely rutinszerűen nem takarta el.

immunfluoreszcencia, ebből 13 esetből 4 IgG1 kappa, 2 esetből 0 IgG1 lambda, 5 esetből 0 IgG2 kappa, 4 esetből 0 IgG3 kappa és {{ 12}} 1 esetből IgG4 kappa. Összességében az SAP-pozitív glomerulopathiák 36-ból 32-t (89 százalék) elfedtek és az MGMID kategóriába soroltak, míg a 36-ból a másik 4-et (11 százalék) leleplezték, és MG-nek diagnosztizálták IgG1 kappa-lerakódásokkal. A monotípusos membrános glomerulopathiában szenvedő betegek, akik nem álcáztak, de pozitívak voltak SAP-ra, átlagos életkoruk 33 év volt, a nő-férfi arány 4:0. A monotípusos membrános glomerulopathiában szenvedő esetek, amelyek nem takartak el, de SAP-ra negatívak voltak, átlagos életkoruk 59,3 év volt, a nő-férfi arány 15:4.

1. táblázat|A fehérjék szignifikánsan megnövekedtek a betegek glomerulusaibanmembránszerű glomerulopathiamaszkolt IgG kappa lerakódásokkal, amint azt a tömegspektrometria mutatja

A szérum reaktivitása az SAP-ra

22 MGMID-ben szenvedő, 12 PLA2R-pozitív membrános glomerulopathiában szenvedő beteg és 6 normál kontroll beteg szérumát tesztelték az IgG SAP-reaktivitásra enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) segítségével. Bár minden csoportban volt némi eltérés a betegek között, nem volt szignifikáns különbség az IgG SAP-reaktivitásában a csoportok között (S2 kiegészítő ábra).

2. ábra|Az IgG és a szérum amiloid P-komponens (SAP) kolokalizációja. (a–c) Membránszerű glomerulopathiával diagnosztizált beteg vesebiopsziás mintáján végzett immunfluoreszcencia kísérletek maszkolt IgG-kappa lerakódásokkal, szemcsés glomeruláris alapmembrán festődést mutatnak (a) SAP és (b) IgG esetén. (c) Az SAP és az IgG erős kolokalizációja a glomeruláris alapmembrán lerakódásokban. (d–f) A 3 foszfolipáz A2 receptor-pozitív membrános glomerulopathiában szenvedő beteg vesebiopsziás mintáján végzett immunfluoreszcens kísérletek (d) negatív glomeruláris alapmembrán festődést mutatnak SAP-ra és (e) pozitív granuláris glomeruláris alapmembrán festődést IgG-re. (f) Ebben a 3 foszfolipáz A2 receptorhoz kapcsolódó membranosus glomerulopathiában szenvedő betegnél hiányzik a kolokalizáció. A kép megtekintésének optimalizálásához tekintse meg a cikk online változatát a 2. táblázatban|A szérum amiloid p komponens (SAP) festésének eredményei vesebiopsziában

AA, amiloid A; AL, amiloid könnyű lánc; C3, 3. komplement komponens; GBM, glomeruláris alapmembrán; MG, membrános glomerulopathia; MGMID, membránszerű glomerulopathia maszkolt IgG kappa lerakódásokkal; MPGN, membranoproliferatív; glomerulonephritis; PGMNID, proliferatív glomerulonephritis monoklonális IgG kappa lerakódásokkal; PLA2R, foszfolipáz A2 receptor; THSD7A, 1-es típusú trombospondin domént tartalmazó 7A.

VITA

Az MGMID a glomerulopathia egy nemrégiben leírt és egyedülálló mintája, amelyet szubepitheliális és mezangiális lerakódások jellemeznek, amelyek paraffin IF hatására IgG kappa-ra festődnek (3. ábra). A glomerulopathia ilyen mintájában szenvedő betegek általában fiatal nők (életkor<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">

Az SAP egy 25-kDa pentamer fehérje a pentraxin családon belül, amelyet az APCS gén kódol, és bőségesen előfordul a szérumban és a glomeruláris alapmembrán komponenseként.5 Bár az SAP pontos funkciója nem tisztázott, ismert. kölcsönhatásba léphet a plazmában a fehérjék széles skálájával, beleértve a komplement komponenseket, apolipoproteineket, valamint a koaguláció és proteolízis szabályozóit.6 Stabil kalciumfüggő kölcsönhatásokat alakít ki ligandjaival, beleértve a fehérjéket, lipoproteineket és DNS-t, megvédve őket a lebomlástól. Az SAP a veleszületett immunválaszban részt vevő oldható mintázatfelismerő molekulaként működik, amely számos kórokozóval és károsodással összefüggő molekuláris mintázatot ismer fel, beleértve a mikrobiális komponenseket és az apoptotikus sejttörmeléket.7 Az SAP kölcsönhatása patogénnel vagy károsodással összefüggő molekuláris molekulákkal A mintázatok elősegítik az apoptotikus sejttörmelék komplement által közvetített kiürülését az 1q (C1q) komplement komponenshez való közvetlen kötődés és a klasszikus komplement útvonal aktiválása révén. A komplement aktiválása ellenére az SAP-ról ismert, hogy immunregulációt kölcsönöz, csökkentve a neutrofilitástgyulladása szöveteken belül a csökkent endothel adhézió,8 csökkent elasztázfunkció,9 és a szövetekbe való visszajutás csökkentése révén.10 Az SAP-ról is ismert, hogy a plazmában a DNS-hez és a kromatinhoz való fő kötőfehérje.11

Betegségek esetén az SAP leginkább arról ismert, hogy az amiloidózis lerakódásainak része. Bár kevésbé tanulmányozott, arra is bizonyíték van, hogy szerepet játszhat az autoimmun betegségek humán és állati modelljeiben. SAP antitesteket azonosítottak a betegeknélautoimmunbetegségek, és a csökkent SAP-expresszióról kimutatták, hogy elősegítiautoimmunitásegérmodellekben. A szisztémás lupus erythematosusban szenvedő betegek 44 százalékában azonosítottak SAP elleni antitesteket, az antitest-titerek korrelálnak a betegség aktivitásával.12 Az SAP-hiány spontán autoimmunitás kialakulásához vezet az autoimmunra hajlamos C57BL/6 egerekben és a nem autoimmun egerekben. hajlamos 129/Sv egerek, amikor keresztezték C57BL/6 egerekkel (129/Sv x C57BL/6 F2)13, de nem egyedül a 129/Sv törzzsel, ami arra utal, hogy a mögöttes genetikai érzékenységre lehet szükség az SAP-hiány autoimmunitás indukálásához. az egerek antinukleáris antitesteket, anti-egyszálú DNS-t, anti-kétszálú DNS antitesteket és reumás faktorokat mutatnak. Fejlesztik a proliferatívimmuniskomplex-mediált glomerulonephritis, gyakrabban nőstényekben.13 A lupus nephritis egérmodelljében, ahol a glomerulonephritist aktivált saját DNS-nek a szérumba történő injektálásával váltják ki, a plazmidvektorral végzett SAP génterápia csökkentette a kettős szálú DNS antitestek termelődését , immunkomplex lerakódás és vesegyulladás, valamint megakadályozta a lupus nephritis kialakulását.15

3. ábra|Vesebiopsziás leletek membránszerű glomerulopathiában, maszkolt IgG kappa lerakódásokkal. A 2. ábrán látható biopsziából származó mikrofényképek itt láthatók. (a) Szegmentális tüskék vannak jelen a glomeruláris alapmembránok mentén, Jones methenamin ezüstfestéssel (eredeti nagyítás × 400). (b) Az elektronmikroszkópos vizsgálat a glomeruláris alapmembrán mentén szubepitheliális lerakódásokat tár fel (eredeti nagyítás × 12, 000). (c) A glomerulusok IgG-re negatívak rutin immunfluoreszcenciával friss szöveten (direkt immunfluoreszcencia; eredeti nagyítás × 400). (d) Ugyanabból az esetből származó glomerulusok pozitívan festődnek a paraffinba ágyazott szöveten proteázos emésztés után (közvetlen immunfluoreszcencia; eredeti nagyítás × 400). (e) A glomerulusok kappa és (f) nem lambda festődést mutatnak a proteázzal emésztett paraffinba ágyazott szöveten (közvetlen immunfluoreszcencia; eredeti nagyítás × 400). A kép megtekintésének optimalizálásához tekintse meg a cikk online változatát a www.vese-international.org.

A biopszián észlelt könnyűlánc-korlátozás ellenére jelenleg nincs bizonyíték arra, hogy ez az entitás összefüggésben állna mögöttes limfoproliferatív rendellenességekkel vagy keringő monoklonális Ig-ekkel.4 Így az MGMID nem tekinthető a vese jelentőségű monoklonális gammopathia spektrumán belülinek. idő. Az SAP autoantitestek szerepe szintén bizonytalan. Ellentétben a membrános glomerulopathia más formáival, amelyekben egy fehérje specifikusan jelen van az immunlerakódásokban, mint például a PLA2R-hez társuló betegség16, úgy tűnik, hogy az MGMID-et nem SAP elleni autoantitestek irányítják, mivel nem sikerült kimutatnunk az SAP elleni szérum antitest-reaktivitást MGMID-betegeknél. . Alternatív magyarázat az, hogy az IgG kappa e két fehérje közötti normális kölcsönhatás eredményeként van jelen, nem pedig autoimmun antigén-antitest kölcsönhatás eredményeként, mivel az Ig kappa láncról ismert, hogy a szérum SAP normális interakciójának része. bár hasznos ennek az entitásnak a szöveti diagnosztikájában, a szérumban lévő SAP-antitestek vizsgálata jelenleg nem szolgál noninvazív diagnosztikai módszerként, és ennek a betegségnek a kiváltó oka továbbra is rejtély.

Az MGMID klinikai kimenetele rendkívül változó, a spontán remissziótól a progresszióig a végstádiumig terjed.vesebetegségkiújulással a transzplantációban. A retrospektív elemzés nem mutatott semmilyen összefüggést az alkalmazott kezelés és a klinikai kimenetel között.4 Az SAP ebben a betegségben való részvételének felfedezése potenciálisan hatással van a terápiára. A közvetlenül az SAP-t célzó kezelések ígéretesnek bizonyultak az amiloidózis kezelésében.17,18 Ezenkívül a tömegspektrometriás eredmények azt mutatják, hogy a komplement kaszkádot célzó terápiák hasznosak lehetnek a glomerulonephritis ezen formájának kezelésében, mivel a legtöbb fehérje megnövekedett. az MGMID-ben a glomerulusok komplement kapcsolatban állnak. További vizsgálatokra van szükség a betegség aktivitásának biomarkereinek, valamint a terápiák azonosításához.

Az MGMID biopsziákban a rutin immunofluoreszcenciával végzett immunlerakódások elfedésének oka továbbra is rejtély. Az SAP jelenléte a betétekben új lehetséges magyarázatokat vet fel erre a jelenségre MGMID esetén. Például ismert, hogy az SAP fehérje kölcsönhatásai erősen Ca2-függőek,6 és a vesebiopsziás szövet immunofluoreszcenciához való feldolgozásához használt transzportközegek és pufferek közül sok nem tartalmaz Ca2-t. Ez az in vitro Ca2-hiány az immunlerakódások felbomlását eredményezheti, így azok már nem állnak rendelkezésre immunfluoreszcenciával történő kimutatásra a fagyasztott szöveten. Az immunkomplex lerakódások azonban a formalinnal rögzített szövetben továbbra is kimutathatóak maradnak, a formalin által kiváltott kovalens kémiai kötések eredményeként a fehérjék között a szövetben.

Itt írjuk le először az SAP egyedülálló jelenlétét az MGMID glomeruláris lerakódásaiban. Ezenkívül bemutatjuk a festéstvesebiopsziákAz SAP esetében az MGMID-hez hasonló klinikopatológiai jellemzőkkel rendelkező eseteket, maszkolás nélkül, rutin immunfluoreszcenciával azonosítja. Ezen eredmények alapján úgy véljük, hogy a glomeruláris lerakódásokon belüli pozitív festődés az SAP-ra a glomerulonephritis egy egyedülálló formáját azonosítja, amely a betegség közös patofiziológiai mechanizmusával rendelkezik. Az MGMID közelmúltbeli leírásáig ezeket az eseteket számos különböző kategóriába sorolták, a C3 glomerulopathiától a fertőzéssel összefüggő glomerulonephritisig az atípusos membranosus glomerulopathiáig.1 A diagnosztikai kritériumok gyors fejlődése és a glomerulonephritis ezen formájának megértése rávilágít a tömeg erejére. spektrometria, hogy patofiziológiai betekintést nyújtson az immunmediált glomerulonephritisbe.

MÓD

Vesebiopsziás feldolgozási technikák

Szabványos vesebiopsziás feldolgozási technikákat alkalmaztak, beleértve a fényt, az immunfluoreszcenciát és az elektronmikroszkópot.19,20 Valamennyi fénymikroszkópos mintát hematoxilinnel és eozinnal, Jones methenamin ezüsttel, Masson trikrómmal és periodikus sav-Schiff reagenssel festettek. Az összes direkt immunfluoreszcens metszetet 4 mm-re vágtuk, és flfluoreszceinnel jelölt poliklonális nyúl anti-humán antitestekkel reagáltattuk IgG, IgA, IgM, C3, C1q, fibrinogén, valamint k- és l-könnyű láncok ellen (Dako, Carpenteria, CA) 1 órán át, majd leöblítjük; fedőlemezt vittünk fel vizes rögzítőközeg segítségével. A kiválasztott eseteket flfluoreszceinnel jelölt poliklonális egér anti-humán antitestekre festettük IgG1, IgG2, IgG3 és IgG4 ellen (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). A paraffin immunfluoreszcenciát proteázos emésztés után végeztük a korábban leírtak szerint.2,3 Összesen 9 MGMID biopsziát és 8 összehasonlító kontroll biopsziát választottunk ki más típusú membrános glomerulopathiával a tömegspektrometriás elemzéshez. A vizsgálati protokollt a Solutions Institutional Review Board jóváhagyta, és megfelelt a Helsinki Nyilatkozat elveinek.

Cistanche tudtonizáljavese

Mikrodisszekciós glomerulusok lézeres befogása tömegspektrometriája

A formalinnal rögzített paraffinba ágyazott szövetből származó vesebiopsziás szövetet 10 mm vastagságban Leica PET-membrán keretlemezekre (Leica, Wetzlar, Németország) vágtuk. Ezeket a lemezeket ezután hematoxilinnal megfestettük. A glomerulusokat Leica DM60{{20}}0B mikroszkóppal mikrocentrifugacsövekbe mikropreparáltuk. A mikropreparált glomerulusokat 2%-os nátrium-dodecil-szulfátban és 0,1 M ditiotreitolban lizáltuk 99 fokon 1 órán át, és szűrővel segített minta-előkészítéssel (FASP) feldolgoztuk.21 A tisztított lizátumot Vivacon 500 koncentrátorokra vittük át (MWCO 30 kDa; Sartorius 30 kDa; , Göttingen, Németország). A nátrium-dodecil-szulfátot ismételt mosással távolítottuk el 8 M karbamiddal 0,1 M trisz(hidroxi-metil)-amino-metán/Cl-ben, pH 8,5; a mintákat ezután 0,05 M jódacetamiddal alkileztük. A jód-acetamidot 8 M karbamid/0,1 M trisz(hidroxi-metil)-amino-metán/Cl (pH 8,5) oldattal háromszor, majd 0,05 M ammónium-hidrogén-karbonát-oldattal 3 mosással távolítottuk el. A fehérjéket tripszinnel (szekvenálási fokozat, Promega, Madison, WI) emésztettük 40:1 tömeg/tömeg arányban 37 fokon 16 órán át. A peptideket centrifugálással gyűjtöttük össze, és sómentesítettük a C18-Stage tippeken (Thermo Scientific, Waltham, MA).

Az emésztett peptideket NanoLC-tandem tömegspektrometriával elemeztük Thermo Orbitrap Fusion Lumos tömegspektrométer (Thermo Scientific) alkalmazásával. A peptideket fordított fázisú csapdaoszlopra (Integra-frit, New Objective, Woburn, MA) töltöttük, amely 2,5 mm-es Waters XSelect (Waters Corp., Milford, MA) töltött felületű hibrid gyantát tartalmazott 150 mm-es X 0.075 mm-es analitikai oszlop, amely ugyanazt a fordított fázisú gyantát tartalmazza, mint a csapdában. Ezután egy nanoAcquity ultraperformance folyadékkromatográfiás rendszert (Waters Corp.) használtunk, hogy egy 60-perces gradienst hozzunk létre 98:2 és 60:40 közötti A:B puffer arányban (A puffer ¼ 0,1 százalék hangyasav 0,5% acetonitril; B puffer ¼ 0,1% hangyasav, 99,9% acetonitril).

A peptideket integrált permetezőhegy segítségével (Picofrit, New Objective) eluáltuk az oszlopról, majd elektrospray-vel (20 kV) ionizáltuk, majd tandem tömegspektrometriás analízist végeztünk nagyobb energiájú ütközés által kiváltott disszociáció (HCD) alkalmazásával. A peptid prekurzorok felméréseit 240K felbontással (400 m/z-en) 5×105 ionszám-célponttal végeztük. A tandem tömegspektrometriát 1,6 Th-on végzett kvadrupól izolálással, 30-as normalizált ütközési energiájú HCD fragmentációval és gyors pásztázó tömegspektrometriás analízissel végeztük az ioncsapdában. A kapott tandem tömegspektrometriás adatokat a Swiss Prot és a TREMBLE bejegyzéseket is tartalmazó legújabb Uniprot humán adatbázisban kerestük.

MaxQuant (Max Planck Biokémiai Intézet, Planegg, Németország). Az adatok megjelenítése Scaffold v4.6 (Proteome Software, Portland, OR) segítségével történt. A hamis felfedezési arányt 1 százalékban határozták meg a peptid-spektrum egyezéseknél. A mennyiségi meghatározáshoz a MaxQuant normalizált iBAQ-értékeit használtuk. Az egyes minták iBAQ-eloszlását mediánnal korrigáltuk, hogy ellenőrizzék a terhelési különbségeket. A nullával egyenlő iBAQ értékeket eltávolítottuk az adatkészletből. A statisztikai hipotézisek teszteléséhez 2-minta Welch-t-tesztet végeztünk minden fehérjére, normalizált iBAQ-értékeket használva a 2 csoportra. Ha egy fehérjét csak egy csoportban mutattak ki, akkor a Welch-féle t-próbát 1-mintaként végeztük, nullhipotézisként a legkisebb kimutatott iBAQ-értéket használva.

SAP festés

A formalinban rögzített, paraffinba ágyazott metszeteket 3 mm-re vágva paraffinmentesítettük, és 99 fokon végeztük az antigén-visszakeresést. A metszeteket nyúl poliklonális anti-SAP poliklonális antitesttel (1:400; ThermoFisher, Waltham, MA), majd egy rodaminvörös X-konjugált kecske antinyúl szekunder antitesttel reagáltattuk, amelyet szilárd fázisban adszorbeáltak, hogy minimális keresztreakciót biztosítsunk humánnal. IgG (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Minden esetet pozitív és negatív kontrollokkal futtattunk. A festést standard immunofluoreszcens mikroszkóppal értékeltük. Pozitívnak ítélték, ha a glomerulusokban pozitív granuláris kapilláris hurok festődés volt, és negatívnak, ha nem volt kapilláris hurok

festődés a glomerulusokban. Az IgG és SAP kolokalizációját a glomeruláris alapmembránokban konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk Zeiss LSM 880 konfokális lézer pásztázó mikroszkóppal (Zeiss Microscopy, Jena, Németország). Ehhez az elemzéshez poliklonális (flfluoreszcein-izotiocianáttal konjugált) nyúl anti-humán IgG-t (1:40; Agilent, Santa Clara, CA) reagáltatunk a hővel visszanyert szövettel a fent leírt SAP-festést követően. Negatív kontrollokat végeztünk az antitest-specifitás biztosítása érdekében az elsődleges antitestek elhagyásával. Négy MGMID-esetben teszteltük a HP1BP3 jelenlétét (1:100; Thermo Fisher, Waltham, MA) immunoperoxidázos festéssel.

Az SAP elleni szérum antitestek vizsgálata

Az SAP fehérjét (R & D Systems, Minneapolis, MN; {{0}}SAB-050) karbonát-hidrogén-karbonát pufferben (pH 9,6) 3 ng/ml-re hígítottuk, és egy {{ 6}}lyuk Immulon H2 lemez (Thermo Scientific) egy éjszakán át 4 fokon. A lemezeket háromszor mostuk 200 ml mosópufferrel (1 × foszfátpufferes sóoldat és 0,05% Tween), és blokkoltuk 2 órán át blokkoló pufferrel (1 × foszfátpufferes sóoldat, 0,05%). tween, 1 százalék halzselatin). A lemezeket ezután háromszor mostuk 200 ml mosópufferrel. 20 mikroliter hígított szérumot (1:100 mosópufferben) adtunk lyukanként, és 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. A lemezeket 7-szer mostuk 200 ml mosópufferrel, majd hozzáadtuk a kimutatási antitestet, az anti-humán IgG-HRP-t (Jackson ImmunoResearchLaboratories; 309-035-003). A lemezeket hétszer mostuk 200 ml mosópufferrel. Ezután a 3,3',5,5'-tetrametil-benzidin-peroxidáz szubsztrátot és a Sol B peroxidáz szubsztrátot összekeverjük 1:1 arányban, és 100 ml-t adunk a lemezhez. A reakciót 100 ml 2 M H2SO4 hozzáadásával állítottuk le, majd 20 percig a munkapadon hagytuk, majd 450 nm-en mértük. Annak ellenőrzésére, hogy az SAP fehérje kötődik a lemezhez, nyúl anti-SAP-t (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA1-28361) használtunk sorozathígításban, majd anti-nyúl IgG-HRP-t (Jackson ImmunoResearch Laboratories). ; 111-035-144). A kontroll jó korrelációt mutatott az antitest hígítása és az abszorbancia között, 0,95 átlagos R-négyzet értékkel.

Cistanche a javításértvesefunkció

KÖZZÉTÉTEL

Egyik szerző sem nyilatkozott egymással versengő érdekekről.

KIEGÉSZÍTŐ

ANYAG kiegészítő fájl (PDF)

S1 ábra. Reprezentatív képek a glomeruláris SAP-festődésről különféle vesebetegségekből.

S2 ábra. Anti-SAP szeroreaktivitási vizsgálatok enzimhez kötött immunszorbens vizsgálattal.

S1 táblázat. Valamennyi Ig tömegspektrometriával azonosított lézerfelvétellel mikrodisszekált glomerulusokban a membránszerű glomerulopathia eseteiből IgG kappa lerakódásokkal.

S2 táblázat. Az összes fehérje mintavételével végzett spektrális számlálások 1 $ log2 növekedést mutattak az MGMID mintákban, és a P-érték # 0.1.

IRODALOM

1. Larsen CP, Ambruzs JM, Bonsib SM, et al. Membránszerű glomerulopathia maszkolt IgG kappa lerakódásokkal.VeseInt. 2014;86: 154–161.

2. Messias NC, Walker PD, Larsen CP. Paraffin immunfluoreszcencia a vesepatológiai laboratóriumban: több, mint mentési technika. Mod Pathol. 2015;28:854–860.

3. Larsen CP, Messias NC, Walker PD és mtsai. Membranoproliferatív glomerulonephritis maszkolt monotípusos immunglobulin lerakódásokkal. Kidney Int. 2015;88:867–873.

4. Larsen CP, Boils CL, Cossey LN, et al. A membránszerű glomerulopathia klinikopatológiai jellemzői maszkolt IgG kappa lerakódásokkal. Kidney Int Rep. 2016;1:299–305.

5. Emsley J, White HE, O'Hara BP és munkatársai. A pentamer humán szérum amiloid P komponens szerkezete. Természet. 1994;367:338–345.

6. Poulsen ET, Pedersen KW, Marzeda AM, et al. A szérum amiloid P komponens (SAP) interakciója az emberi plazmában, amely fiziológiás kalciumszintet tartalmaz. Biokémia. 2017;56:896–902.

7. Agrawal A, Singh PP, Bottazzi B és munkatársai. Mintafelismerés pentraxinokkal. Adv Exp Med Biol. 2009;653:98–116.

8. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M és mtsai. A pentraxinok PTX3 és SAP a veleszületett immunitásban, a gyulladás szabályozásában és a szöveti átalakulásban. J Hepatol. 2016;64:1416–1427.

9. Li JJ, McAdam KP. Humán amiloid P komponens: elasztáz inhibitor. Scand J Immunol. 1984;20:219–226.

10. Cox N, Pilling D, Gomer RH. A szérum amiloid P: a veleszületett immunválasz szisztémás szabályozója. J Leukoc Biol. 2014;96:739–743.

11. Kravitz MS, Pitashny M, Shoenfeld Y. Védőmolekulák – C-reaktív fehérje (CRP), szérum amiloid P (SAP), pentraxin3 (PTX3), mannózkötő lektin (MBL) és apolipoprotein A1 (Apo A1), és autoantitestjeik: prevalencia és klinikai jelentősége az autoimmunitásban. J Clin Immunol. 2005;25:582–591.

12. Zandman-Goddard G, Blank M, Langevitz P és munkatársai. A szisztémás lupus erythematosusban szenvedő betegeknél az anti-szérum amiloid P komponens antitestek korrelálnak a betegség aktivitásával. Ann Rheum Dis. 2005;64:1698–1702.

13. Bickerstaff MC, Botto M, Hutchinson WL és munkatársai. A szérum amiloid P komponense szabályozza a kromatin lebomlását és megakadályozza az antinukleáris autoimmunitást. Nat Med. 1999;5:694–697.

14. Gillmore JD, Hutchinson WL, Herbert J és társai. Autoimmunitás és glomerulonephritis egerekben a szérum amiloid P komponens gén célzott deléciójával: SAP-hiány vagy törzskombináció? Immunológia. 2004;112:255–264.

15. Zhang W, Wu J, Qiao B és mtsai. A lupus nephritis javulása szérum amiloid P komponens génterápiával, eltérő mechanizmusokkal a betegség különböző szakaszaiban változott. PloS One. 2011;6:e22659.

16. Beck LH, Bonegio RG, Lambeau G és munkatársai. M-típusú foszfolipáz A2 receptor, mint célantigén idiopátiás membrán nefropátiában. N Engl J Med. 2009;361:11–21.

17. Richards DB, Cookson LM, Berges AC, et al. Az amiloid terápiás clearance-e a szérum amiloid P komponens elleni antitestek által. N Engl J Med. 2015;373:1106–1114.

18. Richards DB, Cookson LM, Barton SV és társai. A szérum amiloid P komponens elleni antitest ismételt adagolása tisztázza az amiloid lerakódásokat szisztémás amiloidózisban szenvedő betegeknél. Sci Transl Med. 2018;10.

19. Walker PD, Cavallo T, Bonsib SM. Gyakorlati irányelvek a vesebiopsziához. Mod Pathol. 2004;17:1555–1563.

20. Walker PD. A vese biopszia. Arch Pathol Lab Med. 2009;133:181–188.

21. Wisniewski JR, Zougman A., Nagaraj N, et al. Univerzális minta-előkészítési módszer proteomanalízishez. Nat Methods. 2009;6: 359–362.