A gomisin N gátolja a melanogenezist a PI3K/Akt és a MAPK/ERK jelátviteli útvonalak szabályozásán keresztül a melanocitákban

Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Absztrakt: Gomisin N, a Schisandra Chinensisben található egyik lignán vegyületről különböző tanulmányok kimutatták, hogy antioxidáns, daganatellenes és gyulladáscsökkentő hatással rendelkezik. Itt számolunk be először a Gomisin N melanogén ellenes hatásáról emlősökben. sejtekben, valamint a zebrahal embrióiban. A Gomisin N szignifikánsan csökkentette a melanintartalmat sejttoxicitás nélkül. Bár nem volt képes módosítani a gomba katalitikus aktivitásáttirozinázin vitro,Gomisin Nleszabályozta a kulcsfontosságú fehérjék expressziós szintjét, amelyek működnekmelanogenezis. A gomisin N leszabályozott melanocortin 1 receptor (MC1R), adenilil-cikláz 2, mikroftalmia-asszociált transzkripciós faktor (MITF), tirozináz,tirozináza tirozinázzal rokon fehérje-1(TRP-1) és a tirozinázzal rokon fehérje-2 (TRP-2). Ezenkívül a Gomisin N-kezelt Melan-A sejtek megnövekedett p-Akt és p-ERK szintet mutattak, ami arra utal, hogy a PI3K/Akt és MAPK/ERK útvonalak aktiválása gátolhatjamelanogenezis. Azt is igazoltuk, hogy a Gomisin csökkentette a melanintermelést az MITF expressziójának visszaszorításával,tirozináz, TRP-1 és TRP-2egér- és emberi sejtekben, valamint fejlődő zebradánembriókban. Összességében arra a következtetésre jutunkGomisin Ngátolja a melanin szintézist azáltal, hogy elnyomja a MITF és a melanogén enzimek expresszióját, valószínűleg a PI3K/Akt és MAPK/ERK útvonalak modulálásával.

Kulcsszavak:Schisandra Chinensis;Gomisin N; lignán;melanogenezis; bőrfehérítés

A cistanche bőrfehérítő funkcióval rendelkezik

1. Bemutatkozás

A melanin egy pigment, amely a legtöbb állati szervben megtalálható, beleértve a bőrt, a hajat, a szemet, a belső fület, a csontokat, a szívet és az agyat [1,2].Melanogenezisegy összetett folyamat, amelyben több jelátviteli útvonal is részt vesz. A melanocortin 1 receptor (MC1R) kulcsfontosságú szabályozómelanogenezisligandumain, például a melanocita-stimuláló hormonon (MSH) és az adrenokortikotrop hormonon (ACTH) keresztül továbbít [3]. A bőr melanint az epidermiszben található melanociták bioszintetizálják, majd átkerülnek a keratinocitákba, ahol fontos szerepet játszanak a bőr védelmében azáltal, hogy elnyelik a napfény UV-sugárzását és megkötik a reaktív szabad gyököket [4,5]. A melanin szintézisét és transzferét a bőrben és a szőrtüszőben a prekurzorok elérhetősége szabályozza [6]. Az L-tirozin és az L-dihidroxi-fenilalanin (L-DOPA), amelyek a melanogén enzimek fő szubsztrátjai, szintén hormonszerű szabályozóként működnek a melanogenezisben [7]. Másrészt a melanin túltermelése olyan nemkívánatos bőrproblémákat eredményez, mint a szeplők és a melasma [8,9]. A melanogenezis befolyásolhatja a normál és rosszindulatú melanociták viselkedését azáltal, hogy módosítja a sejtek rugalmas tulajdonságait [10]. Bár a bőrsejtekben expresszálódó szerotonin és melatonin receptorok kulcsszerepet játszanak a celluláris homeosztázis fenntartásában, a melanin túlzott termelése a kontrollálatlan hormonális változásokon keresztül patológiás állapotokat okozhat a bőrben [11].

Ezért kiterjedt erőfeszítéseket tettek olyan molekuláris mechanizmusok tisztázására, amelyek a melanogenezist a hiperpigmentáris bőrbetegségek kezelésének elsődleges lépéseként szabályozzák. Ezen kívül különféle típusúbőrfehérítésA melaninszintézist gátló szereket növényi és nem növényi kivonatokból azonosították, és kereskedelmi forgalomban kozmetikai készítményekben használták [12,13]. A legszélesebb körben használt fehérítőszerek közé tartozik a hidrokinon, mequinol, arbutin, kojinsav, aszkorbinsav és retinsav [12,14]. Alkalmazásuknak azonban különféle korlátai vannak a hiperpigmentáció akut vagy krónikus tüneteinek kezelésére emberekben. Például a hidrokinont, bár az 1960-as évek óta régóta használják depigmentációra, bőrirritációt és kontakt dermatitiszt okozhat [15,16]. DNS-károsodáshoz is vezet azáltal, hogy fokozza a reaktív oxigénfajták termelését és exogén ochronosis kialakulását emlőssejtekben [17,18]. Egyéb jól ismerttirozinázAz olyan inhibitorok, mint a Kojicsav és az aszkorbinsav, nemcsak rossz bőrbehatolást, stabilitást és fehérítő hatást mutatnak, hanem hosszú távú használat esetén citotoxicitást, dermatitiszt és bőrpírt is okozhatnak [19,20]. Ebben a tekintetben egyre nagyobb szükség van biztonságosabb és hatékonyabb fehérítőszerek kifejlesztésére az emberi bőr hiperpigmentációjának kezelésére. A hagyományos gyógyászatban használt természetes gyógynövények alternatív forrást jelenthetnek az új fehérítőszerek azonosításához, amelyek szabályozzák a kulcsfontosságú lépéseketmelanogeneziskevesebb vagy semmilyen mellékhatással [21].

A Schisandra chinensis, más néven északi finom ízű bogyó, természetesen megtalálható Északkelet-Kínában, Távol-Kelet Oroszországban, Japánban és Koreában [22]. Ezt a növényt régóta használják éjszakai vakság, bőrégés, aszeptikus gyulladás és májbetegségek kezelésére a hagyományos keleti gyógyászatban [23,24]. A S. chinensis gyümölcskivonatról és lignánvegyületeiről kimutatták, hogy különféle farmakológiai hatásokkal rendelkeznek egérsejtvonalakban. Például a Schisandra A és C antioxidatív hatású, míg a Schisandra B antifibrotikus, gyulladásgátló, antioxidáns és anti-apoptotikus hatású [25]. Egy másik lignán vegyületGomisin N(1A. ábra) kimutatták, hogy elnyomja az oxidatív stressz által kiváltott apoptózist azáltal, hogy gátolja a citokróm C felszabadulását a mitokondriumokból a citoplazmába, a kaszpáz 3 és a PARP hasadását, valamint a Ca2 plusz által kiváltott mitokondriális permeabilitás-átmenetet H9c2 patkány szívizomsejtekben [7, 8]. Érdekes módon számos egérmodelleket és humán bőrsejtvonalat használó tanulmány feltárta a S. chinensis terápiás potenciálját a bőrbetegségek kezelésében. Lee et al. beszámoltak arról, hogy a S. chinensis gyümölcs metanolos kivonata enyhítette a kontakt dermatitisz tüneteit azáltal, hogy csökkentette a gyulladást elősegítő citokinek, például a TNF- és az IFN-termelést helyi alkalmazás esetén [8,24]. Kang és mtsai. kimutatták, hogy a Schisandra Fructus vizes kivonat gátolja az IκB aktivációt, ezáltal elnyomja a TNF-, IL-6 és GM-CSF termelődését a HMC-1 [26] humán hízósejtvonalban. hogy a S. chinensis lignans tágabb értelemben is befolyásolhatja a bőrsejtek funkcióit. Ebben a tanulmányban arra törekedtünk, hogy megvizsgáljuk a bőrsejtek feltételezett szerepét.Gomisin N, a S. Chinensis egyik fő lignánvegyülete, a szabályozásábanmelanogenezis, ezáltal értékelve a kozmetikai szerként való lehetséges felhasználását. Itt beszámolunk rólaGomisin Nsejttoxicitás nélkül gátolja a melanin bioszintézist humán és egér sejtekben, valamint zebradán embriókban.

2. Eredmények

2.1. A Gomisin N hatása a melanin képződésére és a sejtek életképességére

A Gomisin N hatásának ellenőrzéséremelanogenezis, különböző koncentrációjú egér melanocitákat kezeltünkGomisin N72 órán keresztül, majd értékelte a melanintartalom változásait. A Gomisin N-kezelés dózisfüggő módon, sejttoxicitás nélkül csökkentette a melanintartalmat mind a normál melanocita sejtvonalban, mind a B16F10 melanoma sejtekben (1B, C ábra). Megfigyeltük, hogy a Gomisin N gátolta az -MSH-indukált melanintermelést B16F10 sejtekben, ami összehasonlítható volt a PTU-kezeléssel kapott eredményekkel [27] (1C. ábra). Annak értékelésére, hogy a melanin csökkentése utánGomisin NA kezelés oka a tirozináz aktivitásának csökkenése, L-DOPAfestési vizsgálatot végeztünk normál humán epidermális melanocita (NHEM) sejtekben. Amint az 1E. ábrán látható, a Gomisin N-nel kezelt NHEM-sejtek csökkent L-DOPA-szintet mutattak a kezeletlen sejtekhez képest. A Gomisin N melanintermelésre gyakorolt ​​gátló hatása azonban nem volt szignifikáns humán melanoma MNT-1 sejtekben (1D. ábra). .

2.2. A Gomisin N hatása a tirozináz aktivitásra

Megvizsgálni, hogy vajonGomisin Ngátoljatirozinázin vitro gomba tirozinázt és B16 melanoma sejtlizátumot használtunk. Pozitív kontrollként Kojic savat, egy jól ismert tirozináz inhibitort alkalmaztunk. A gomba tirozinázzal kezelve, míg a kojicsav jelentősen csökkentette az enzimaktivitást, a Gomisin N nem okozott semmilyen változást az L-DOPA dopakrómmá történő átalakulásában (2A. ábra). Ha azonban B16 melanomasejtekkel kezelték, a Gomisin N csökkenést eredményezett ban bentirozináza sejtlizátum aktivitását dózisfüggő módon (2B. ábra). Ezen túlmenően, ha B16 sejtekben -MSH-val együtt kezelik,Gomisin Nmegfordította a dopakrómképződés -MSH által stimulált növekedését (3C. ábra). Nevezetesen, a gomisin N hatékonyabbnak tűnt a sejtek gátlásában, mint a kojicsav.tirozináz aktivitásB16 sejtek -MSH inger hatására. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a GomisinN egér- és emberi sejtekben megfigyelt melanintermelésre gyakorolt ​​gátló hatása (1. ábra) nem a tirozináz katalitikus aktivitását közvetlenül gátoló funkciója miatt következik be. Azonban továbbra is lehetséges, hogy a Gomisin N szabályozza a tirozináz vagy más olyan fehérjék expresszióját, amelyek kulcsszerepet játszanakmelanogenezis.

2.3. A Gomisin N hatása az MC1R jelátviteli útvonal inaktiválására

Arra törekedtünk, hogy tisztázzuk a GomisinN melanintermelésre kifejtett gátló hatásáért felelős mechanizmust. Ezt okoskodtukGomisin Nszabályozhatja a jelátviteli fehérjéket, amelyekben részt vesznekmelanogenezisés ezáltal gátolja a melanin szintézist. A melanocortin 1 receptor (MC1R) egy amelanocitikus G-fehérjéhez kapcsolt receptor, amely kulcsfontosságú szabályozóként működik a melaninszintézisben. Az MC1R liganduma -MSH vagy az adrenokortikotrop hormon (ACTH) általi aktiválása az adenilil-cikláz szintjének növekedéséhez vezet, ami viszont fokozza az intracelluláris cAMP szintjét [2,3]. Következésképpen a MITF transzkripciós szintje megnő a Protein kinase-C (PKA)/reszponzív elemkötő fehérje (CREB) útvonalon [2,28]. A Gomisin N MC1R jelátviteli útvonalra gyakorolt ​​szabályozó hatásának értékeléséhez ellenőriztük az MC1R és downstream jelátviteli molekuláinak expressziós szintjét Melan-A sejteket Gomisin N-nel kezelve. Megfigyeltük, hogy a Gomisin N jelentősen csökkentette mind az MC1R, mind az adenilil-cikláz 2 fehérjeszintjét. dózisfüggő módon (3A–C. ábra). Ahogy az várható volt,Gomisin NA kezelt sejtek csökkent fehérjeszintet mutattak az MITF és ismert célpontjai, a tirozináz, a TRP-1 és a TRP-2 (3A, D–G ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Gomisin N gátolja a melanint termelő enzimeket azáltal, hogy inaktiválja az MITF-et az MC1R jelátviteli útvonalon keresztül.

2.4. A Gomisin N hatása az Akt és az ERK1/2 foszforilációjára Melan-A sejtekben

Ismeretes, hogy a PI3K/Akt és MAPK/ERK útvonalak részt vesznek a melanogenezisben, a MITF-et transzkripciósan vagy poszt-transzkripciósan szabályozzák [29,30]. Annak értékelésére, hogy a GomisinN befolyásolja-e ezeket a jelátviteli útvonalakat, Western blot analízissel értékeltük az Akt és az ERK1/2 foszforilációs állapotát. Amint a 3H–J ábrán látható, nagy dózisú kezelés (30 µM) aGomisin Nszignifikánsan fokozta mind az Akt, mind az ERK foszforilációját. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a Gomisin N gátló hatása amelanogenezisvalószínűleg összefüggésbe hozható a P13K/Akt és a MAPK/ERK útvonallal.

2.5. A Gomisin N gátolta a melanogenezist a zebrahal embriókban

Ezt követően azt kívántuk megvizsgálni, hogy a Gomisin N hatékony-e a gátlásbanmelanogenezisin vivo. Ebből a célból zebrahal embriókat kezeltünk Gomisin N-vel 72 órán keresztül 1, 10, 20 és 30 µM koncentrációban, majd megmértük a melanogén fehérjék expressziós szintjét. Megfigyeltük, hogy a Gomisin N-kezelés gátolta a melanin képződést fejlődő zebradán embriókban.Gomisin N-kezelt embriók a melanintartalom koncentrációtól függő csökkenést mutattak a kezeletlen kontrollhoz képest (4. ábra). Azt is megállapítottuk, hogy a fehérjeszint atirozináz, MITF, TRP-1 és TRP-2 csökkent a Gomisin N-kezelés hatására (5. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Gomisin N gátolja a melanogenezist in vivo azáltal, hogy szabályozza a MITF transzkripciós faktort és célpontjaittirozináz, TRP-1 és TRP-2.

2.6. A Gomisin N megfordította a rapamicin által kiváltott melanogenezist humán MNT-ben-1

Bár a Gomisin N jelentősen gátoltamelanogenezisMelan-A és B16 sejtekben, valamint inzebrafish embriókban nem figyeltük meg a humán MNT-1 melanomasejtekre gyakorolt ​​hatását. Arra számítottunk, hogy a Gomisin N hatása kimutatható lehet MNT-1 sejtekben olyan körülmények között, ahol a melanogenezist megfelelő inger szabályozza. Kimutatták, hogy a rapamicin melanogenezist indukál azáltal, hogy növeli a tirozináz aktivitást és a MITF, tirozináz, TRP-1 és TRP-2 fehérjeszintjét [31], részben az autofágia aktiválása révén [32]. Figyeltük a szintekettirozinázMITF, TRP-1 és TRP-2 MNT-1 sejtekben Western blot analízissel, Gomisin N andrapamycinnel történő együttes kezelés után. A rapamicin kezelés szignifikánsan indukálta a MITF, TRP-1 és TRP-2 szintet, de nem volt hatással atirozinázszintek (6. ábra). A Gomisin N-kezelés azonban koncentrációfüggő módon jelentősen megfordította a rapamicin MITF-re, TRP-1-ra és TRP-2-ra gyakorolt ​​hatását. A fordított hatásaGomisin Nrapamicinnel szemben ígéretesebb volt 20 és 30 µM koncentrációban, mint 10 µM. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Gomisin N gátoljamelanogenezisa humán MNT-1 melanomasejtekben az MITF transzkripciós faktor és a TRP-1 és TRP-2 célpontjainak szabályozásával.

3. Megbeszélés

A melanin fő funkciója a bőrsejtek UV-sugárzás elleni védelme [33–35]. A hiperpigmentáció, amely a bőr melanin túltermelésének eredménye, nemkívánatos kozmetikai problémákat okoz, és bőrgyulladással és bőrrákkal jár. Több jelentés is javasoltamelanogenezismint fontos célpont a metasztatikus melanoma kezelésében [36,37]. Így egyre nagyobb szükség van olyan anti-melanogén szerek kifejlesztésére, amelyek sejttoxicitás nélkül szabályozzák a melanogenezist [38]. A bőr melanogenezisében számos út vesz részt [39,40]. A ligandum kötődésekor az MC1R fokozza az adenilil-cikláz aktivitását, ami ezt követően növeli a cAMP intracelluláris szintjét [41,42]. A PKA/CREB útvonal cAMP-függő aktivációjáról széles körben beszámoltak arról, hogy fokozza a MITF transzkripciós szintjét, ezáltal fokozza a melaninszintézist [43]. A MITF a három fő melanogén enzim, a tirozináz, a TRP-1 és a TRP-2 fő szabályozójaként működik gerincesekben [3,21,44]. Ezek az enzimek a melanociták melanoszomális membránjában található transzmembrán fehérjék. A tirozináz szabályozza a sebességkorlátozó lépéstmelanogenezisaz L-tirozináz L-DOPA-vá alakításával [23]. A TRP-1 és TRP-2 szintén fontos szerepet játszik a melaninszintézisben, bár funkciójukat nem ismerjük teljesen.

Ebben a vizsgálatban a Gomisin N, a S. chinensis lignánvegyülete depigmentáló hatást mutatott sejttoxicitás nélkül. A gomisin N gátolta a melanin szintézist tenyésztett emlős sejtvonalakban, valamint zebrahal embriókban. A gomisin N hatékonyabbnak tűnt, mint a pozitív kontroll PTU, amely gátolja a melanintermelést a Melan-A sejtekben (1B. ábra). A Gomisin N koncentrációfüggő módon csökkentette a melanintartalmat. A kezeletlen kontrollcsoporthoz képest 10 µM aGomisin Nmintegy 40 százalékkal csökkentette a melanintartalmat, sejttoxicitás nélkül. A 10-µM Gomisin N melanogén-ellenes aktivitása a Melan-A sejtekben a 100-µM PTU-éval volt összehasonlítható. Hasonlóképpen, a Gomisin Nappal erősebbnek tűnt, mint a PTU az -MSH-aktivált B16F10 sejtekben, ahol a 5- és a10-µM Gomisin N hatásai összehasonlíthatóak voltak a 10- és {{12 }}µM PTU (1C. ábra). A Gomisin N-nel kezelt NHEM-sejtek csökkent L-DOPA-szintet mutattak, ami arra utal, hogy a GomisinN gátoljatirozinázaktivitást tenyésztett sejtekben (1E. ábra). Ezek az eredmények arra vezettek bennünket, hogy tovább vizsgáljuk a mögöttes mechanizmust, amellyel a Gomisin N gátolja a melanogenezist.

Megvizsgáltuk, hogy vajonGomisin Nközvetlenül modulálja a katalitikus aktivitásttirozinázin vitro. A kojsavval ellentétben a Gomisin N nem mutatott gátló hatást a gomba tirozináz aktivitására (2A. ábra). Azonban a B16 melanoma sejtlizátumokban a celluláris tirozináz aktivitást jelentősen csökkentette a Gomisin N mind -MSH-kezeléssel, mind anélkül (2B, C ábra). A Gomisin N celluláris tirozináz aktivitásának gátlása -MSH-inger hatására szignifikánsabbnak bizonyult, mint a pozitív kontroll Kojic-sav (2C. ábra).

Feltételeztük, hogy a Gomisin N anti-melanogén funkciója a tirozináz és a tirozinázzal rokon fehérjék (TRP-k) transzkripciós vagy poszt-transzkripciós szabályozásán keresztül valósulhat meg. Ennek validálása érdekében megmértük a jelátviteli molekulák expressziós szintjét az MC1R útvonalon, amely az MC1R útvonal fő meghatározója. a melanintermelés mennyisége és minősége a melanocitákban. Várhatóan megfigyeltük, hogy a Gomisin N csökkentette az MC1R és az adenilil-cikláz 2 szintjét a Melan-A sejtekben (3A–C. ábra). Továbbá,Gomisin Ncsökkentette az MITF és célfehérjéinek, köztük a tirozináznak, a TRP-1-nak és a TRP-2-nak az expresszióját (3A, D–G ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a melanintartalom csökkent szintje a Gomisin N kezelés során az MC1R útvonal deaktiválódásából ered.

Másrészt a PI3K/Akt és a MAPK/ERK útvonalak foszforilálhatják a MITF-et, és ezáltal utólagos transzkripciósan módosíthatják annak aktivitását [45]. Azonban a PI3K/Akt és a MAPK/ERK útvonalak aktiválásának összhatásamelanogenezisellentmondásos. Mind a PI3K/Akt, mind a MAPK/ERK útvonal konstitutívan aktiválódik humán melanómában a felhalmozódott mutációk miatt [46]. A Mel-Ab sejtekben a C2-ceramid által közvetített depigmentáció a p-Akt szintjének csökkenésén keresztül következik be [47]. Számos olyan természetes vegyület létezik, amelyek aktiválják a melanogenezist a p-ERK szint felszabályozásával a B16 melanoma sejtekben [28]. Ezzel szemben arra is bizonyíték van, hogy az emelkedett p-ERK és p-Akt szint gátolja a melaninszintézist [28,48]. A melanogenezis komplexitásának inregulációja részben azzal magyarázható, hogy a foszforiláció fokozza az MITF transzkripciós aktivitását, ugyanakkor indukálja a MITF mindenütt jelenlévő proteoszóma-függő degradációját [26,49–51]. Adataink azt mutatták, hogy mind a p-Akt, mind a p-ERK szintje felemelkedett a Gomisin N-vel kezelt Melan-A sejtekben (3H–J ábra). Ez azt jelenti, hogy a PI3K/Akt és a MAPK/ERK útvonalak hozzájárulhatnak a melanintermelés gátlásához.

Továbbá validáltuk a Gomisin N anti-melanogén aktivitását a zebradán in vivo modellben. A Gomisin N-nel kezelt zebrahal embriók a melanin pigmentációjának jelentős csökkenését mutatták (4. ábra). Ezenkívül a Gomisin N jelentősen csökkentette atirozináz, MITF, TRP-1 és TRP-2 a zebrahal embriók fejlesztésében. Ezek az eredmények együttesen arra utalnakGomisin Ndepigmentációt indukál az MITF és a melanogén enzimek expressziójának in vivo leszabályozásával. A Gomisin N anti-melanogén aktivitását tovább erősítették a rapamicinnel stimulált humán melanoma MNT-1 sejtekben. Bár a Gomisin N csak kismértékű változást eredményezett a melanintartalomban az MNT-1 sejtekben (1D. ábra), hatékonyan megfordította a rapamicin által kiváltott MITF, TRP-1 és TRP-2 növekedését koncentrációfüggő módon (6A, C-E ábra). Összességében a szabályozó hatásaGomisin NMITF-en és a melanogén enzimek reprodukálhatóan megtalálhatók egér- és emberi sejtekben, valamint zebradán embriókban.

Összefoglalva, ez a munka azt sugallja, hogy a Gomisin N nagy potenciállal rendelkezik regénykéntbőrfehérítésügynök. A Gomisin N gátolni látszikmelanogenezisaz MITF expressziójának visszaszorításával az MC1R útvonalon keresztül, ahelyett, hogy közvetlenül módosítaná a katalitikus aktivitást.tirozinázés TRP-k. Bár a részletes mechanizmusok tisztázásra várnak, a Gomisin N által kiváltott depigmentáció valószínűleg összefüggésbe hozható a PI3K/Akt és MAPK/ERK útvonalak aktiválásával (7. ábra).

4. Anyagok és módszerek

4.1. Anyagok

Az RPMI1640-et a Gibco-BRL-től (Gaithersburg, MD, USA) vásároltuk. A Dulbecco-féle módosított Eagle táptalajt (DMEM), a fetális szarvasmarha-szérumot (FBS) és a penicillin-sztreptomicint (PS) a Hyclone-tól (Carlsbad, CA, USA) vásároltuk. A melanocita-tenyésztő tápközeget a PromoCelltől (Heidelberg, Németország) vásároltuk. Fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF), 12-O-tetradekanoil-forbol-13--acetát (TPA), Kojisav, 1-fenil-2-tiokarbamid (PTU), gomba tirozináz, 3,{{ A 9}}dihidroxi-l-fenilalanint (L-DOPA), -MSH-t, dimetil-szulfoxidot (DMSO) és paraformaldehidet a SigmaChemical Co.-tól (St. Louis, MO, USA) vásároltuk.Gomisin NA vegyületet Chul Young Kim (Hanyang Egyetem, Ansan, Korea) biztosította. A rapamicint a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) vásároltuk.

4.2. Sejtkultúra

A B16F10 egér melanoma sejtvonalat a Korean Cell Line Bank (Szöul, Korea) biztosította. Az egér melanocita Melan-A sejteket [52] Dr. Byeong Gon Lee (a SkinResearch Institute, Amore Pacific Co., Yongin) nagylelkű ajándéka. -si, Korea). A humán MNT-1 melanomasejteket Aeyeong Lee (Goyang-si, Korea, Dongguk Egyetem Orvostudományi Kollégiuma) nagylelkűen biztosította. A primer normál humán epidermális melanocitákat (NHEM) a PromoCelltől (Heidelberg, Németország) vásároltuk. A Melan-A sejteket RPMI 1640 tápközegben (Gibco, Carlsbad, CA, USA) tenyésztettük, amelyet 10% FBS-sel, 1% PS-sel és 200 nM TPA-val egészítettünk ki. 10 százalék FBS-sel és 1 százalék PS-sel kiegészített DMEM-et használtunk a Melan-A sejtek és NHEM sejtek fenntartására. Minden sejtet 37 °C-on inkubáltunk 5 százalékos CO2 inkubátorban.

4.3. Melanintartalom mérése

A Melan-A sejteket egy 24-lyukú lemezre oltottuk (1 × 105 sejt/lyuk), majdGomisin N72 órán át inkubáltuk. 72 óra elteltével a melanintartalmat a korábban leírtak szerint mértük [53]. Röviden, a táptalaj eltávolítása után a sejteket háromszor mostuk PBS-sel. Ezt követően nátrium-hidroxid-oldatot (1 ml, 1 N) adtunk mindegyik lyukba a melanin feloldására. A 405 nm-es abszorbanciát mikrolemez-leolvasóval mértük. Ezt a vizsgálatot megismételtük B16F10 sejtekkel (2 × 104 sejt/lyuk) és MNT{10}} sejtekkel ugyanazt a módszert követve.

4.4. Western Blot analízis

A Melan-A sejteket 100 mm-es edényekbe oltottuk (1 × 106 sejt/tál), és 1, 5 vagy 10 µM-os oldattal kezeltük.Gomisin Nhárom napig 37 ◦C-on. A sejteket PBS-sel mostuk, majd kaparóval összegyűjtöttük. A leválasztott sejteket 1 ml PBS-be helyeztük, és 75 00 fordulat/perc mellett 5 percig centrifugáltuk. A felső oldat eltávolítása után a sejtpelleteket lízispufferrel lizáltuk (50 mM Tris-HCl, pH 8.{15}}, 0,1% SDS, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,02% nátrium-azid, 0,5% nátrium-dezoxikolát, 100 µg/ml PMSF, 1 g/ml aprotinin) 24 órán át 4 °C-on. Az összes fehérjét ultracentrifugával extraháltuk 12, 000 fordulat/perc mellett 30 percig 4 °C-on. A fehérjetartalmat Bradford assay-vel mértük. A fehérjéket (30 µg) 10%-os nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) géllel választottuk el, és anitrocellulóz membránra vittük át. A membránt 1 órán át blokkoltuk 5 százalékos sovány tejjel Tris-pufferelt sóoldatban Tween{32}}-ben (TBST), majd 12 órán át 4 ◦C-on inkubáltuk a -tubulint megcélzó elsődleges antitestekkel (Santa Cruz, CA, USA). ), MITF (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), tirozináz (sejtjelzés), ERK (sejtjelzés), foszfo-ERK (sejtjelzés), AKT (sejtjelzés), foszfo-AKT (sejtjelzés), MC1R ( Santa Cruz), adenilil-ciklázok 2 (Santa Cruz), TRP-1 (Santa Cruz) és TRP-2 (Santa Cruz). Az elsődleges antitestek eltávolítása után a membránokat háromszor mostuk TBST-vel, és másodlagos antitesttel inkubáltuk. antitestek (nyúl anti-kecske IgG-HRP; egér anti-nyúl HRP, Santa Cruz) 1 órán át. A membránokat fokozott kemilumineszcenciás reagenssel kezeltük a ChemiDoc XRS plus képalkotó rendszer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) segítségével. A sávok denzitometriás elemzését Image MasterTM 2D Elite szoftverrel (3.1-es verzió, GE Healthcare, Chicago, IL, USA) végeztük.

4.5. Tirozináz aktivitási vizsgálat

A Gomisin N gomba gátló hatásának becslésetirozinázaktivitást, a tirozinázt 1, 5 vagy 10 µM-tal inkubáltukGomisin Nvagy a pozitív kontroll Kojic sav. Minden mintát metanolban oldottunk. Az L-DOPA-t (8,3 mM) és a gomba tirozinázt (125 U) 80 mM foszfátpufferrel (pH 6,8) hígítottuk. Minden mintából 40 µl-t és 120 µl L-DOPA-t kevertünk össze egy 96-lyukú lemezen, majd hozzáadtunk 40 µl hígított gomba tirozinázt. A lemezeket ezután 15 percig inkubáltuk, és az abszorbanciát 490 nm-en mértük mikrolemez-leolvasóval.

TirozinázA B16 melanoma sejtlizátumokban mért aktivitást -MSH-kezeléssel vagy anélkül, Ohguchi és mtsai. [54], kis módosításokkal. A sejtlizátumot a Western-blot elemzési részben leírtak szerint készítettük el. A felülúszóban lévő összes fehérjét Bradford-teszttel mértük, standardként szarvasmarha-szérumalbumint használva [55]. Egyenlő mennyiségű fehérjét hígítottunk és használtunk fel a tirozináz aktivitási vizsgálathoz.

gátolja a tirozináz aktivitást

4.6. L-DOPA festés NHEM sejtekben

Az NHEM sejteket egy {{0}}lyukú lemezre oltottuk, és 72 órán át Gomisin N-nel inkubáltuk. A sejteket 4% paraformaldehiddel fixáltuk 40 percig, majd 0,1% Triton X{-val kezeltük. {6}} 2 percig. L-DOPA-t (0,1 százalék) adtunk minden egyes lyukhoz, majd 2 órán át inkubáltuk. Az oldat eltávolítása után a sejteket kétszer mostuk PBS-sel. A képek mikroszkóppal készültek.

4.7. Zebrahal kísérletek

A zebrafish embriókat a Zebrafish Resource Banktól (Daegu, Korea) szereztük be. Az embriókat Gomisin N-vel kezeltük 72 órán keresztül. Depigmentáló hatása aGomisin Nzebrahal embrióin sztereomikroszkóp alatt figyelték meg. Western blot analízishez a Gomisin N-nel kezelt embriókat lízispufferrel lizáltuk, amelyből az összes fehérjét a fent említett módon állítottuk elő.

5. Következtetések

Eredményeink alátámasztják azt a nézetet, hogy a Gomisin N nagy potenciállal rendelkezik funkcionális élelmiszerként ésbőrfehérítésügynök.Gomisin Na S. Chinensis egyik fő lignánvegyülete. Valójában. A Chinensis egy gyógynövényből készült gyógyszer, amelyet számos emberi betegség gyógyítására használnak. Azonban további epidemiológiai vizsgálatok szükségesek a Gomisin N biztonságosságának bizonyításához a bőrön. Következésképpen az in vivo vizsgálatok és a klinikai vizsgálatok világosabban igazolhatják a GomisinN hatékonyságát. Összefoglalva, ez a tanulmány azt sugalljaGomisin NLehetséges hipo-pigmentáló szer és természetesbőrfehérítésjelölt a kozmetikai iparban.

a cistanche javítja a fehérítést

Hivatkozások

1. Alaluf, S.; Atkins, D.; Barrett, K.; Blount, M.; Carter, N.; Heath, A. Az epidermális melanin hatása az emberi bőrszín objektív mérésére. Pigment Cell Res. 2002, 15, 119–126. [CrossRef] [PubMed]

2. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, Kr. e. Askarian-Amiri, ME Signaling Pathways in Melanogenesis. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef] [PubMed]

3. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Melanin pigmentáció emlősök bőrében és hormonális szabályozása. Physiol. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [CrossRef] [PubMed]

4. Herrling, T.; Jung, K.; Fuchs, J. A melanin szerepe a szabad gyökök elleni védelemben a bőrben és szerepe a haj szabadgyökök indikátoraként. Spectrochim Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2008, 69, 1429–1435. [CrossRef] [PubMed]

5. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Roszkowski, K.; Filipiak, J.; Slominski, AT A melanomametasztázisok melanintartalma befolyásolja a sugárterápia kimenetelét. Oncotarget 2016, 7, 17844–17853. [CrossRef] [PubMed]

6. Slominski, A.; Wortsman, J.; Plonka, PM; Schallreuter, KU; Paus, R.; Tobin, DJ Hajtüsző pigmentáció.J. Investig. Dermatol. 2005, 124, 13–21. [CrossRef] [PubMed]

7. Slominski, A.; Zmijewski, MA; Pawelek, J. L-tirozin és L-dihidroxi-fenilalanin, mint a melanociták működésének hormonszerű szabályozói. Pigment Cell Melanoma Res. 2012, 25, 14–27. [CrossRef] [PubMed]

8. Lee, AY A melasma patogenezisének közelmúltbeli fejlődése. Pigment Cell Melanoma Res. 2015, 28, 648–660. [CrossRef][PubMed]9. Speeckaert, R.; van Gele, M.; Speeckaert, MM; Lambert, J.; van Geel, N. A hiperpigmentációs szindrómák biológiája. Pigment Cell Melanoma Res. 2014, 27, 512–524. [CrossRef] [PubMed]

10. Slominski, RM; Zmijewski, MA; Slominski, AT A melanin pigment szerepe a melanomában. Exp. Dermatol.2015, 24, 258–259. [CrossRef] [PubMed]11. Slominski, A.; Wortsman, J.; Tobin, DJ A bőr szerotoninerg/melatoninerg rendszere: Helyet biztosít a nap alatt. FASEB J. 2005, 19, 176–194. [CrossRef] [PubMed]

12. Sarkar, R.; Arora, P.; Garg, KV Cosmeceuticals a hiperpigmentációhoz: mi kapható? J. CutaneousAesthet. Surg. 2013, 6, 4–11. [CrossRef] [PubMed]

13. Miyamura, Y.; Coelho, SG; Wolber, R.; Miller, SA; Wakamatsu, K.; Zmudzka, BZ; Ito, S.; Smuda, C.;Passeron, T.; Choi, W.; et al. Az emberi bőr pigmentációjának szabályozása és az ultraibolya sugárzásra adott válaszok. Pigment Cell Res. 2007, 20, 2–13. [CrossRef] [PubMed]

14. Davis, EK; Callender, VD Gyulladás utáni hiperpigmentáció: A bőrszín epidemiológiájának, klinikai jellemzőinek és kezelési lehetőségeinek áttekintése. J. Clin. Aesthet. Dermatol. 2010, 3, 20–31. [PubMed]

15. Sales-Campos, H.; Souza, PR; Peghini, Kr. e. da Silva, JS; Cardoso, CR Az olajsav egészségre és betegségekre gyakorolt ​​moduláló hatásainak áttekintése. Mini. Rev. Med. Chem. 2013, 13, 201–210. [CrossRef] [PubMed]

16. Parvez, S.; Kang, M.; Chung, HS; Cho, C.; Hong, MC; Shin, MK; Bae, H. A bőrdepigmentáló és világosító szerek felmérése és mechanizmusa. Fitother. Res. 2006, 20, 921–934. [CrossRef] [PubMed]

17. Luo, L.; Jiang, L.; Geng, C.; Cao, J.; Zhong, L. Hidrokinon által kiváltott genotoxicitás és oxidatív DNS-károsodás HepG2 sejtekben. Chem. Biol. Egymásra hat. 2008, 173, 1–8. [CrossRef] [PubMed]

18. Enguita, FJ; Leitao, AL Hidrokinon: Környezetszennyezés, toxicitás és mikrobiális válaszok.BioMed Res. Int. 2013, 2013, 542168. [CrossRef] [PubMed]

19. Draelos, ZD Bőrvilágosító készítmények és a hidrokinon-vita. Dermatol. Ott. 2007, 20,308–313. [CrossRef] [PubMed]

20. Koo, JH; Lee, I.; Yun, SK; Kim, HU; Park, BH; Park, JW Elszappanosított ligetszépe olaj csökkenti a melanogenezist a B16 melanoma sejtekben, és csökkenti az UV-sugárzás által kiváltott bőrpigmentációt emberekben. Lipids 2010, 45, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

21. Cordell, GA; Colvard, MD Természetes termékek és hagyományos orvoslás: Egy paradigma bekapcsolása. J. Nat. Prod.2012, 75, 514–525. [CrossRef] [PubMed]

22. Panossian, A.; Wikman, G. Schisandra Chinensis Bail farmakológiája: Áttekintés az orosz kutatásokról és az orvostudományban való felhasználásáról. J. Ethnopharmacol. 2008, 118, 183–212. [CrossRef] [PubMed]

23. Chen, P.; Pang, S.; Yang, N.; Meng, H.; Liu, J.; Zhou, N.; Zhang, M.; Xu, Z.; Gao, W.; Chen, B.; et al. A Schisandrin B jótékony hatásai a szívműködésre a miokardiális infarktus egérmodelljében. PLoS ONE 2013, 8, e79418. [CrossRef] [PubMed]

24. Lee, HJ; Jo, S.; Ryu, J.; Jeong, HS; Lee, G.; Ryu, MH; Jung, MH; Kim, H.; Kim, BJ A SchisandraChinensis Turcz hatásai. gyümölcs a dinitrofluor-benzol által kiváltott kontakt dermatitisz egerekben. Mol. Med. Jelentés 2015,12, 2135–2139. [CrossRef] [PubMed]

25. Chun, JN; Cho, M.; Szóval én.; Jeon, JH A Schisandra Chinensis gyümölcskivonat és lignánjainak védő hatásai a szív- és érrendszeri betegségek ellen: A molekuláris mechanizmusok áttekintése. Fitoterápia 2014, 97, 224–233.[CrossRef] [PubMed]

26. Kang, OH; Chae, HS; Choi, JH; Choi, HJ; Park, PS; Cho, SH; Lee, GH; Szóval, HY; Choo, YK;Kweon, OH; et al. A Schisandra Fructus vízkivonat hatásai a humán hízósejtvonalból származó citokin felszabadulásra. J. Med. Élelmiszer 2006, 9, 480–486. [CrossRef] [PubMed]

27. Poma, A.; Bianchini, S.; Miranda, M. L-tirozin-indukált mikronukleuszok termelésének gátlása phenylthiourea által humán melanoma sejtekben. Mutat. Res. 1999, 446, 143–148. [CrossRef]

28. Kim, HJ; Kim, IS; Dong, Y.; Lee, IS; Kim, JS; Kim, JS; Woo, JT; Cha, BY A cirsimaritin melanogenezist indukáló hatása a mikroftalmiával összefüggő transzkripciós faktor és a tirozináz expresszió növekedésén keresztül. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 8772–8788. [CrossRef] [PubMed]

29. Busca, R.; Abbe, P.; Mantoux, F.; Aberdam, E.; Peyssonnaux, C.; Eychene, A.; Ortonne, JP; Ballotti, R. Rasmediates the cAMP-dependens activation of extracellular signal-regulated kinases (ERK) in melanocytes.EMBO J. 2000, 19, 2900–2910. [CrossRef] [PubMed]

30. Busca, R.; Ballotti, R. A ciklikus AMP kulcsfontosságú hírvivő a bőr pigmentációjának szabályozásában. Pigment Cell Res.2000, 13, 60–69. [CrossRef] [PubMed]

31. Hah, YS; Cho, HY; Lim, TY; Park, DH; Kim, HM; Yoon, J.; Kim, JG; Kim, CY; Yoon, TJ Melanogenezis indukciója rapamicinnel humán MNT-1 melanoma sejtekben. Ann. Dermatol. 2012, 24, 151–157. [CrossRef][PubMed]

32. Yun, WJ; Kim, EY; Park, JE; Jo, SY; Bang, SH; Chang, EJ; Chang, SE A mikrotubulus-asszociált proteinkönnyű lánc 3 részt vesz a melanogenezisben a melanociták MITF expressziójának szabályozásán keresztül. Sci. Report.2016, 6, 19914. [CrossRef] [PubMed]

33. Spritz, RA; Hallás, VJ, Jr. A pigmentáció genetikai rendellenességei. Adv. Zümmögés. Közönséges petymeg. 1994, 22, 1–45. [PubMed]

34. Kadekaro, AL; Chen, J.; Yang, J.; Chen, S.; Jameson, J.; Swepe, VB; Cheng, T.; Kadakia, M.; Abdel-Malek, Z. A melanocita-stimuláló hormon elnyomja az oxidatív stresszt az ap53-közvetített jelátviteli útvonalon keresztül az emberi melanocitákban. Mol. Cancer Res. 2012, 10, 778–786. [CrossRef] [PubMed]

35. Wasmeier, C.; Hume, AN; Bolasco, G.; Seabra, MC Melanosomes egy pillantásra. J. Cell Sci. 2008, 121,3995–3999. [CrossRef] [PubMed]

36. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Carlson, JA; Slominski, AT A melanogenezis befolyásolja a III. és IV. stádiumú melanomában szenvedő betegek általános és betegségmentes túlélését. Zümmögés. Pathol. 2013, 44, 2071–2074. [CrossRef] [PubMed]

37. Slominski, A.; Kim, TK; Brozyna, AA; Janjetovic, Z.; Brooks, DL; Schwab, LP; Skobowiat, C.; Jozwicki, W.; Seagroves, TN A melanogenezis szerepe a melanoma viselkedésének szabályozásában: A melanogenezis a HIF-1 expressziójának és a HIF-függő kísérő útvonalak stimulációjához vezet. Boltív. Biochem. Biophys. 2014, 563,79–93. [CrossRef] [PubMed]

38. Kim, HJ; Lee, JH; Shin, MK; Hyun Leem, K.; Kim, YJ; Lee, MH Gastrodia elata extrakciós melanogenezis gátló hatása HM3KO melanoma sejtekben. J. Cosmet. Sci. 2013, 64, 89–98. [PubMed]

39. Hemesath, TJ; Ár, ER; Takemoto, C.; Badalian, T.; Fisher, DE MAP kináz összekapcsolja a Microphthalmia transzkripciós faktort a c-Kit jelátvitellel a melanocitákban. Természet 1998, 391, 298–301. [PubMed]

40. Price, ER; Ding, HF; Badalian, T.; Bhattacharya, S.; Takemoto, C.; Yao, TP; Hemesath, TJ; Fisher, DELineage-specifikus jelátvitel melanocitákban. A C-kit stimuláció a p300/CBP-t mikroftalmiához toborozza.J. Biol. Chem. 1998, 273, 17983–17986. [CrossRef] [PubMed]

41. Bertolotto, C.; Abbe, P.; Hemesath, TJ; Bille, K.; Fisher, DE; Ortonne, JP; Ballotti, R. Microphthalmiagene product as a signal transducer in cAMP-induced differentiation of melanocytes. J. Cell Biol. 1998, 142,827–835. [CrossRef] [PubMed]

42. Pogenberg, V.; Ogmundsdottir, MH; Bergsteinsdottir, K.; Schepsky, A.; Phung, B.; Deineko, V.; Milewski, M.; Steingrimsson, E.; Wilmanns, M. Korlátozott leucin cipzár dimerizáció és a DNS felismerésének specificitása a melanocita mester szabályozó MITF esetében. Genes Dev. 2012, 26, 2647–2658. [CrossRef] [PubMed]

43. Flaherty, KT; Hódi, FS; Fisher, DE A génektől a gyógyszerekig: A melanoma célzott stratégiái. Nat. Rev. Cancer2012, 12, 349–361. [CrossRef] [PubMed]

44. Lee, TH; Seo, JO; Baek, SH; Kim, SY A resveratrol gátló hatásai a melanin szintézisére az ultraibolya B által kiváltott pigmentációban tengerimalacbőrben. Biomol. Ott. 2014, 22, 35–40. [CrossRef] [PubMed]

45. Su, TR; Lin, JJ; Tsai, CC; Huang, TK; Yang, ZY; Wu, MO; Zheng, YQ; Su, CC; Wu, YJ Melanogenesis gátlása galluszsavval: A PI3K/Akt, MEK/ERK és Wnt/ -cateninsignaling útvonalak lehetséges érintettsége B16F10 sejtekben. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 20443–20458. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Yajima, I.; Kumasaka, MY; Thang, ND; Goto, Y.; Takeda, K.; Yamashita, O.; Iida, M.; Ohgami, N.; Tamura, H.; Kawamoto, Y.; et al. RAS/RAF/MEK/ERK és PI3K/PTEN/AKT jelátvitel a malignus melanoma progressziójában és terápiájában. Dermatol. Res. Gyakorlat. 2012, 2012, 354191. [CrossRef] [PubMed]

47. Kim, DS; Kim, SY; Moon, SJ; Chung, JH; Kim, KH; Cho, KH; Park, KC Ceramide gátolja a sejtproliferációt az AKT/PKB inaktiválásával és csökkenti a melanin szintézist Mel-Ab sejtekben. Pigment Cell Res. 2001, 14, 110–115. [CrossRef] [PubMed]

48. Kim, JH; Baek, SH; Kim, DH; Choi, TY; Yoon, TJ; Hwang, JS; Kim, MR; Kwon, HJ; Lee, CHD A melaninszintézis downregulációja az A-val és alkalmazása in vivo villámmodellben. J.Investig. Dermatol. 2008, 128, 1227–1235. [CrossRef] [PubMed]

49. Hartman, ML; Czyz, M. MITF melanomában: Mechanizmusok expressziója és aktivitása mögött. Cell Mol.Life Sci. 2015, 72, 1249–1260. [CrossRef] [PubMed]

50. Kim, DS; Hwang, ES; Lee, JE; Kim, SY; Kwon, SB; Park, KC szfingozin-1-foszfát csökkenti a melanin szintézist a tartós ERK aktiváció és az ezt követő MITF lebontás révén. J. Cell Sci. 2003, 116,1699–1706. [CrossRef] [PubMed]

51. Xu, W.; Gong, L.; Haddad, MM; Bischof, O.; Campisi, J.; Ja, ET; Medrano, EE A mikroftalmiával összefüggő transzkripciós faktor MITF fehérje szintjének szabályozása a hUBC9 theubiquitin-konjugáló enzimmel való társítással. Exp. Cell Res. 2000, 255, 135–143. [CrossRef] [PubMed]

52. Bennett, DC; Cooper, PJ; Hart, IR Nem daganatos egér melanociták sora, amely szingenikus a B16 melanomával, és a növekedéshez tumorpromoterre van szükség. Int. J. Cancer 1987, 39, 414–418. [CrossRef][PubMed]

53. Meira, WV; Heinrich, TA; Cadena, SM; Martinez, GR A melanogenezis gátolja a légzést a B16-F10 melanoma sejtekben, míg növeli a mitokondriális sejttartalmat. Exp. Cell Res. 2017, 350, 62–72. [CrossRef][PubMed]

54. Ohguchi, K.; Tanaka, T.; Iliya, I.; Ito, T.; Iinuma, M.; Matsumoto, K.; Akao, Y.; Nozawa, Y. A Gnetol a Gnetum nemzetségből származó potencirozináz inhibitorként. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003, 67, 663–665. [CrossRef] [PubMed]

55. Uchida, R.; Ishikawa, S.; Tomoda, H. A tirozináz aktivitás és a melanin pigmentáció gátlása 2-hidroxitirozollal. Acta Pharm. Sinica B 2014, 4, 141–145. [CrossRef] [PubMed]