A goszipitrin, egy természetesen előforduló flavonoid, csökkenti a vas által kiváltott idegi és mitokondriális károsodást 3. rész

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

4. Anyagok és módszerek 4.1. Reagensek

Az összes reagenst a Sigma-Aldrich Corp.-tól szereztük be (St. Louis, MO, USA). A Gos törzsoldatait DMSO-ban készítettük, és 1/1000 (o/o) hígításban adtuk a sejttenyészetekhez vagy a mitokondriális preparátumokhoz.

További információért kattintson ide

4.2.Növényi anyag

A Talipariti elatum (Sw.) (Syn. Hisbiscus elatus Sw.) (Malvaceae) növényi anyagokat (virágokat) 2020 márciusában gyűjtötték a La Lisa Gyógyszer- és Élelmiszertudományi Intézet Kutatási és Biológiai Értékelő Központjának környező területeiről , Havanna, Kuba. A hitelesítésüket a camagüeyi egyetem „Ignacio Agramonte Loynaz” herbáriájának szakemberei végezték, ahol az utalványmintákat letétbe helyezték: G. Pardo., HPC-12 520 (HIPC).

A Cistanche javíthatja az immunitást

4.3. Kivonat és minta előkészítés

Azetanoloskivonatokat készítettünk a Telatum vörös virágaiból, amint azt korábban közöltük [29]. A rotációs bepárlást követően a szilárd anyagokat újrakristályosítási eljárásokkal tisztították [29]. Az izolált vegyületeket 1D'H(400 MHz) és 13C (100 MHz) NMR-rel jellemeztük. Az NMR adatfeldolgozást a MestReNova szoftver 6.1.0-6224 verziójával végeztük Windowshoz (kiegészítő anyagok, S1-S3 ábrák). A Gos-tól gyűjtött NMR-adatokat összehasonlították a korábbi eredményekkel [56].

4.4. UV/Vis és IR spektroszkópiai vizsgálatok

Az UV/Vis spektrumokat 10 mm-es optikai úthosszúságú kvarcküvettákban vettük fel, és az abszorbanciát UV-Vis készülékben vettük fel.spektrofotométerAz Amersham BioSci (Little Chalfont, Egyesült Királyság) Ultrospec 2100 Pro egy Wave Scan szoftverrel (SWIFT I, 1.2) rendelkező számítógéphez csatlakoztatva szobahőmérsékleten. A Gos és a vasionok közötti kölcsönhatást az UV/Vis spektrum változásának követésével mértük. A Gos és a Fe(II) ion közötti sztöchiometrikus arány meghatározására Job módszerét alkalmaztuk. A Gos és Fe(lI) törzsoldatait naponta készítettük metanolban, illetve foszfát pufferben. Az IR-spektrumokat JASCO FI/IR-440 spektrométerrel vettük fel 4000-400 cm-I tartományban, kálium-bromid pelleteket használva a minták előkészítéséhez.

4.5. Sejtkultúrák

EgérhippocampálisA HT-22 sejteket (ATCC) 10% FCS-sel, L-glutaminnal (1 mM) és penicillin/sztreptomicinnel (1%) kiegészített DMEM tápközegben tenyésztettük, és 37 fokon tartottuk párásított 5 százalékos CO2-ban. inkubátor. A sejteket (2 × 104 sejt/lyuk) 96-lyukas lemezekre (Nunc, Roskilde, Dánia) 200 μl táptalajba oltottuk 24 órán át 37 °C-on.

4.6. Sejtek Oxidaticoe károsodásának előidézése és kezelés Gos-szal

A Gos (0.001-100 μM）) neuroprotektív hatását HT-22-on tesztelték Gos-szal vagy Trolox-szal (500 μM), FeCl2-vel (100 μM) 24 órás koinkubálással. és citrát (1 mM). 24 óra elteltével a sejtfelülúszót eltávolítottuk, és a sejtek életképességét a [3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromid] (MTT) kolorimetriás vizsgálat.

4.7. Sejtéletképességi vizsgálat

A kezelések után a sejteket (2×104) 10 uM MTT-vel 3 órán át 37 °C-on inkubáltuk. A színes MTT-származékot ezután feloldottuk 50 μl DMSO-ban, és az abszorbanciát 570 nm-en megszámoltuk mikrolemez-leolvasóval (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Németország). A sejtek életképességét a kezeletlen sejtek kontrolljához viszonyított százalékban fejezzük ki.

4.8. Mitokondriális membránpotenciál (△Y) vizsgálat HT-22 sejtekben

MitokondriálisA membránpotenciált a rodamin 123 fluoreszcens kationos próba sejtretenciója alapján értékelték [57,58]. 2 órás vas/aszkorbát sérülés után (kontroll) vagy Gos (0.001-100 μM） vagy Trolox（500 μM） jelenléte esetén az idegsejtek （2 ×10*) 10 percig inkubáltuk 1 μM rodamin 123-mal. Centrifugálás és 1 ml 0,1%-os Triton X{15}} oldatban való újraszuszpendálás után a próbakoncentrációt a felülúszóban határoztuk meg mikrolemez-leolvasóval (FLUOstar Omega, BMG). LABTECH, Ortenberg, Németország) az 505/535 nm-es gerjesztési/emissziós hullámhossz páron. Az adatokat százalékban fejeztük ki a kezeletlen sejtek kontrolljához viszonyítva.

4.9.ATP vizsgálat

A celluláris ATP-t a szentjánosbogár-luciferin/luciferáz vizsgálati rendszer [59] határozta meg, ugyanolyan körülmények között, mint az AY. A biolumineszcenciát Sigma-Aldrich assay kittel mértük a gyártó utasításai szerint, a mikrolemez-leolvasó (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Németország) lumineszcencia opciójával.

4.10.Állatok

A 200 g-os hím Wistar patkányokat a Laboratóriumi Állatok Termelő Központjától (spanyol betűszó szerint CENPALAB, Havanna, Kuba) szereztük be, és a kísérletek előtt 1 hétig az állatgondozóban tartották őket. ellenőrzött környezet (22-24 fok), 12-h fény/sötét ciklussal, valamint ad libitum hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez.

4.11.Mitokondriális izoláció

A patkány előagy mitokondriumait differenciális centrifugálással izoláltuk a korábban leírtak szerint [60]. A 10 százalékos digitonint a szinaptoszómák megzavarására használták, és nem szinaptoszómális és szinaptoszómális mitokondriumok keverékét eredményezték. Az egész eljárást 4 fokon végeztük. A légzésszabályozás aránya (3-as állapot/4-es állapot légzési frekvencia) mindig a 4,5-6,0 tartományban volt, 5 mM szukcinátot használva szubsztrátként.

4.12. Folyamatos monitorozású mitokondriális vizsgálatok

A mitokondriális membránpotenciált spektrofluorimetriásan határoztuk meg, 10 μM szafranin O szondaként 【58,61】 mikrolemez-leolvasóban (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Németország) 495/586 nm gerjesztési/emissziós hullámhosszon; ezeket a vizsgálatokat 0,1 mM EGTA és 2 mM K, HPOA jelenlétében végeztük. A mitokondriális duzzanatot spektrofotometriásan becsültük meg a látszólagos abszorbancia csökkenése alapján 540 nm-en. A vizsgálatokhoz a mitokondriumokat 5 mM kálium-szukcináttal (plusz 2,5 uM rotenonnal) 30 fokos hőmérsékleten 125 mM szacharózt, 65 mM KC-t és 10 mM HEPES-KOH-t (pH 7,4) tartalmazó standard tápközegben energizáltuk.

4.13. Lipid-peroxidációs vizsgálatok

A lipidperoxidációt a malondialdehid (MDA) képződése alapján becsülték [28,62]. A mitokondriumokat (1 mg/ml) 4 mM terc-butil-hidroperoxiddal vagy 50 uM Fe(II) plusz 1 mM nátrium-citráttal kezeltük 37 C°-on. Az MDA koncentrációját a kioltási együttható (c =1) felhasználásával számítottuk ki. 56×105 M-1.cm-1).

4.14. Fe(II)-koncentráció meghatározása

A Fe(ⅡI) koncentrációját 10 mM foszfát pufferben (pH 6,5 (2 ml)) határoztuk meg vörös komplex kialakításával 1,10- fenantrolinnal (5 mM), a korábban leírtak szerint [24,28].

4.15.Oxigénfogyasztás monitorozása

A Fe(ⅡI) oxidációjával kapcsolatos O-fogyasztást Clark-típusú elektródával (Hansatech Instruments, Pentney, King's Lynn, Egyesült Királyság) mérték egy 13- ml-es, mágneses keverővel felszerelt üvegkamrában. 30 fok. Az oxigénfogyasztás sebességét (ROC) nmol O2/ml/perc egységben fejeztük ki.

4.16.2-Dezoxiribóz-oxidációs vizsgálat

A hidroxil("OH) gyökök képződését a 2-dezoxiribóz MDA-vá történő lebomlásának követésével becsülték meg, amelyet az extinkciós együtthatójából (e=1.56 × 10 fok M-1·) számítottak ki. cm-), amint azt korábban közöltük [26,27].

4.17. Gos-Fe(II) komplexek kimutatása

Fe (ⅡI) (FeCl,0.4-1.6 μM) adtunk 2 mL (10 mM) foszfátpufferhez (pH 6,5), amely 2 mM citrátot és 1,6 µM Gos-t tartalmaz. A hullámhossz pásztázást 200-600 nm-ről egy Hitachi 2001 spektrofotométerrel (Hitachi, Tokió) végeztük 28 fokos hőmérsékleten.

4.18. Statisztikai analízis

GraphPad Prism 5.{1}}(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA) használtuk. A statisztikai analízist egyutas ANOVA-val, majd Student-Newman-Keuls posthoc teszttel végeztük a páronkénti összehasonlításhoz. Eredmények p<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" half-effective="" or="" inhibitory="" concentrations="" were="" estimated="" following="" a="" non-linear="" regression="">

Kiegészítő anyagok: Az alábbiak online érhetők el. S1 ábra: A gosszipitrin 1H-NMR (400 MHz) spektruma DMSO-do-ban, S2 ábra:13C-NMR (101 MHz) gosszipitrin spektruma DMSO-d-ben, S3. ábra: Goszipitrin HSQC spektruma DMSO-dg-ben. S1 táblázat: A gosszipitrin H (400 MHz) és 13C (100 MHz) adatai az előző jelentéshez képest.

A szerző hozzájárulásai:Conceptualization, G.LP.-A.; módszertan, MAB-V., RFD, YM-P.és GLP-A.; validálás, MAB-V., JM-P., YM-P és RFD; formális elemzés, YM-P, JM-P, RF-A. és GLP-A.; vizsgálat, MAB-V, AA-L., DA-A., YM-P., RFD és GLP-A.; Adatkezelés, MAB-V.YM.-PJM-P.és RF-A.; írás – eredeti tervezet előkészítése, MAB-V.; írás – áttekintés és szerkesztés, IM.-P, RF-A., YM-P és GLP-A.; vizualizáció, YM-P. és GLP-A.; felügyelet, GLP-A.; finanszírozás megszerzése, GLP-A.Minden szerző elolvasta és elfogadta a kézirat közzétett változatát.

Finanszírozás: Ezt a kutatást a VLIR (Belgium) finanszírozta; a CU2018TEA457A103 számú támogatás és a Ministerio de Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente (Kuba); engedély száma PN223LH010-035. Az APC-t a VLIR (Belgium) finanszírozta; CU2018TEA457A103 számú támogatás.

Az intézményi felülvizsgálati bizottság nyilatkozata:A vizsgálatot a Helsinki Nyilatkozat irányelvei szerint végezték, és a Havannai Egyetem Gyógyszerészeti és Élelmiszertudományi Intézetének Etikai Bizottsága hagyta jóvá (IFAL-CEI protokollkód 087-2019, 2019. október) .

Tájékozott hozzájárulási nyilatkozat: Nem alkalmazható. Adatelérhetőségi nyilatkozat: Nem alkalmazható.

Köszönetnyilvánítás:Ezt a munkát részben a Vlaamse Interuniversitaire Raad (VLIR)-Belgium/Ministerio de Educacion Superior (MES)-Kuba Project CU2018TEA457A103 támogatta, amely fedezte a cikkfeldolgozási díjakat is, valamint a PN223LH010-035 projekt a "Ministerio de" részéről. Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente (Kuba), Programa de Ciencias Basicas y Naturales". Összeférhetetlenség: A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.

Minták elérhetősége: A vegyületek mintái a megfelelő szerzőtől szerezhetők be.