A GRP78 túlzott expressziója PINK1-IP3R-közvetített neuroprotektív mitofágia 3. rész

3.1.3. A mitofágia indukciója a GRP78 túlzott expressziójával neuroprotekciót közvetít

Feltételeztük, hogy a GRP{0}}mediált neuroprotekció a mitokondriumok szelektív autofágiájának indukálásával valósulhat meg a hibás organellumok eltávolításának felgyorsítása érdekében.

Az utóbbi években egyre több tanulmány bizonyítja, hogy a mitokondriumok fontos szerepet játszanak a memória kialakításában és fenntartásában. A mitokondriumok fontos szervek a sejtekben, amelyek felelősek az energiatermelésért. Emellett a mitokondriumok részt vesznek a teljes sejtanyagcsere szabályozásában és a redox reakciók egyensúlyában is. A legújabb tanulmányok azt is megállapították, hogy a mitokondriumok a hosszú távú memória megszilárdulását is befolyásolhatják azáltal, hogy szabályozzák a neuronális ingerlékenység változásait.

A mitokondriumok felelősek az oxidatív anyagcseréért a sejtekben, és a sejtek energiája főként a mitokondriumokban lévő adenozin-trifoszfáton (ATP) keresztül továbbítódik. A neuronok, mint az emberi szervezet információátvivő egységei különösen nagy energiaigényűek, így egészséges mitokondriumuk normális működése elengedhetetlen az idegsejtek élettani jellemzőihez és az idegrendszer normál működéséhez. A kutatók azt találták, hogy betegség vagy öregedés esetén a mitokondriumok egészsége károsodik, működésük hanyatlik, ami az idegsejtek működésének és a memória képességének csökkenését eredményezi.

Az emlékezet kialakítása és fenntartása egyszerre igényel komplex koordinációt a neuronok, szinapszisok és mitokondriumok között. A neuronok végén található szinapszisokban a mitokondriumok az idegsejtek és az idegsejteket támogató gliasejtek között helyezkednek el. Ezek a szinapszisok sajátos szerkezetűek és erősen képlékenyek, ami a memória és a tanulás igényei szerint állítható. A mitokondriumok olyanok, mint a szinapszisok "termelési központja", amelyek a neuronokat és szinapszisokat ellátják a szükséges energiával és anyagokkal, amelyek gyorsan szabályozhatják az idegsejtek ingerlékenységét, és fenntarthatják a szinapszisok hosszú távú plaszticitását és stabilitását.

A mitokondriumokhoz és a memóriához kapcsolódó másik kutatási irány a sejtek transzformációval kapcsolatos faktorokon (egy fehérjetípuson) keresztül történő kezelése. Ez a kezelés javíthatja a mitokondriális működést, növelheti az anyagcsere sebességét, és megóvhatja a neuronok és a szinapszisok egészségét. E tanulmányok alapján azt sugallják, hogy a mitokondriumok egészségének erősítésével javíthatjuk memóriánkat és intellektuális képességeinket, miközben csökkentjük az Alzheimer-kór és más neurológiai betegségek kockázatát.

Összefoglalva, a mitokondriumok a memória kialakításának és karbantartásának szerves részét képezik. A mitokondriumok egészsége elengedhetetlen a neuronok és szinapszisok normál működéséhez, valamint a hosszú távú plaszticitás és stabilitás fenntartásához. Figyelnünk kell az étrendre, a testmozgásra és az életmódbeli szokásokra, hogy megőrizzük a mitokondriumok egészségét, csökkentsük az Alzheimer-kór és más neurológiai betegségek kockázatát, valamint javítsuk intelligenciánkat és memóriánkat. Látható, hogy javítanunk kell a memórián, a Cistanche pedig jelentősen javíthatja a memóriát, mert szabályozhatja a neurotranszmitterek egyensúlyát is, például növeli az acetilkolin és a növekedési faktorok szintjét, amelyek nagyon fontosak a memória és a tanulás szempontjából. Ezenkívül a Cistanche deserticola javíthatja a véráramlást és elősegítheti az oxigénszállítást, ami biztosítja, hogy az agy megfelelő táplálékhoz és energiához jusson, ezáltal javítva az agy vitalitását és állóképességét.

Kattintson az Ismerje meg a memória javításának módjait

E hipotézis alátámasztására a GRP78 bizonyítottan elősegíti a makroautofágiát [4] (a továbbiakban autofágia).

Számos jól jellemzett autofágia modulátor segítségével próbáltuk meghatározni, hogy szükséges-e az autofágia a GRP{0}}indukált neuroprotekcióhoz: a rapamicin, amely az mTORC1 gátlásával aktiválja az autofágiát, és az autofágia fluxusának két gátlója: a 3-metiladenin ({{4) }}MA), a III. osztályú foszfatidil-inozitolkináz PI3K inhibitora és az LY294002, az I. osztályú PI3K inhibitora.

Mindhárom autofágia modulátor csökkentette a túlélést mind a GFP, mind a GRP78 csoportban Tun-kezelt sejtekben a hordozóhoz képest (4A ábra). Ezek az eredmények azt sugallták, hogy az autofágia helyes beindítása a PI3K-Beclin1 útvonalon és a késői fluxus szükséges volt, bár nem elegendő a GRP78 túlzott expressziójának europrotektív hatásaihoz az ER-stresszes sejtekben.

3. ábra: A GRP78 túlzott expressziója megmenti a mitokondriális diszfunkciót stresszes NSC34 sejtekben. (A) Immunblot és oszlopdiagram, amely a GRP78 szintjét mutatja plazmidvektorral nukleofertőzött NSC34 sejtekben a GRP78 vagy egy nem rokon proteinas kontroll (GFP) túlzott expressziója érdekében. (B) A GFP-t vagy GRP-t{8}}expresszáló NSC34-sejtek túlélésének százalékos aránya (átlag ± SEM) 24 óra elteltével 1 µg/ml tunikamicint (Tun) (balra) vagy 10 µM nokodazolt tartalmazó tápközegben (jobbra) MTT-teszttel határozták meg (n=4; * p < 0.005,** p < 0,001 vs. GFP, Student-féle t-teszt ). (C) A MitoSOX fluoreszcenciájának kvantitatív elemzése GFP-t vagy GRP78-at túlzottan expresszáló sejtekben, amelyeket Tunnel vagy vivőanyaggal (balra) vagy efavirenzzel (EFV) kezeltek kontrollként vagy hordozóként (jobbra). (D) A TMRM fluoreszcenciájának kvantitatív elemzése GFP-t vagy GRP78-at túlzottan expresszáló és Tunnel vagy vivőanyaggal (balra) vagy EFV-vel vagy vivőanyaggal (jobbra) kezelt sejtekben (a GFP-Veh a kontrollcsoport). (E) Balra: Az O2-koncentráció reprezentatív elemzése (Clark-típusú O2-elektróddal) az idő függvényében GFP-t vagy GRP78-at túltermelő és Tun-val kezelt sejtekben. Jobb oldalon: O2-fogyasztás 5 óra Tuntreatment után a GFP-t vagy GRP78-at túltermelő sejtekben (a GFP-Veh a kontrollcsoport) (n=4; * p < 0,05 vs. Veh-GFP, # p < 0,05 vs.GRP78, egyirányú ANOVA).

4. ábra. A mitokondrium mitokondrium jelölése a GRP78 túlzott expressziója miatt előnyös. (A) A GFP vagy GRP78 plazmidokkal nukleofertőzött és Tunnel vagy Tun autofágia modulátorok kombinációjával kezelt NSC34 sejtek százalékos arányának oszlopdiagramja (átlag ± SEM), a vonatkozásban kontroll vivőanyag (Veh), MTT vizsgálattal meghatározva 24 órával a kezelés után (GFP-Veh a kontrollcsoport) (n=4–8, * p < 0,05 vs.

Veh-GFP; # p < 0.05 vs. Tun-GFP).(B) Csak PARK2-HA plazmiddal nukleofertőzött sejtek reprezentatív konfokális képei (felső, középső panelek, kontroll) GRP78 plazmid (alsó panelek) vivőanyaggal (Veh) vagy Tunnel (5 óra) kezelve, és HA-ra (zöld) és HSP60-re (piros) immunfestve; skálasáv=10 µm. (C) Veh, Tun és Tun+GRP78 csoportok Parkin és Hsp60 együttes lokalizációjának Pearson-féle korrelációs együtthatójának átlaga ± SEM (n=4; * p < 0,05 vs. Parkin-Veh, # p < 0,05 vs.

Parkin-Tun, egyirányú ANOVA). (D) Bal oldali Western blot a jelzett fehérjék mitokondriális (mito) és citoszolikus (cito) egyesített frakcióiban, GFP- vagy GRP78-túlexpresszáló sejtekből 5 órán át vivőanyaggal vagy Tunnel kezelve. Az elemzett fehérjék a következők: OPA-1, CV-, PDI, GRP78, ubiquitinált aminosavak, LC3 és aktin. Jobb oldalon, oszlopdiagramok a GRP78 átlagos hajtásváltozásáról mindkét egyesített frakcióban és az LC{{1{{20}}}II a mitokondriális frakcióban az aktinhoz (citoszolhoz) vagy az V komplex béta-alegységéhez viszonyítva (CV-B) (mitokondrium) a GFP csoportban. (E) A GFP vagy GRP78 fehérjéket túlzottan expresszáló és Tunnel önmagában vagy CCCP-vel, CSA-val vagy BAPTA-AM-mel kombinálva kezelt életképes sejtek százalékos arányának oszlopdiagramja (átlag ± SEM), amelyet MTT-vizsgálattal határoztak meg 24 órával a kontroll vivőanyaggal kezelt kezelés után. sejteket. (F) Hasonló oszlopdiagram a thapsigarginnal (THA) CCCP-vel vagy anélkül kezelt sejteknél (a GFP-Veh a kontrollcsoport) (n=4–8, 3 különböző kísérletben, * p < 0,05 vs. vezérlő-Veh;# p < 0,05 vs. GRP78-Tun).

Parkin nem mindig vesz részt a mitofagiában, mivel alternatív mechanizmusok is kiválthatják [46]. Annak megállapítására, hogy Parkin részt vesz-e a GRP78-közvetített hatásban, meghatároztuk a HA-címkézett Parkin szubcelluláris elhelyezkedését az NSC34 sejtekben ER-stressz mellett és anélkül.

Konfokális mikroszkóppal megfigyeltük, hogy a Parkin az NSC34 sejtben eloszlott 5 órás vivőanyag- vagy Tun-kezelés után (4B. ábra). Ezzel szemben a GRP78-at túlzottan expresszáló sejtekben megnőtt a Parkin és a HSP60, egy mitokondriális fehérje együttes lokalizációja. , ami ennek az organellum formitofágának a megcélzására utal (4B, C ábra).

Ezenkívül izoláltuk a mitokondriális és citoszolos frakciókat olyan sejtekből, amelyek túlzottan expresszálták a GFP-t vagy a GRP78-at, és kontrollként Tunnel vagy vivőanyaggal kezeltük 5 órával az inzultus után. Az egyesített mitokondriális frakciók tisztaságát az OPA1 és a CV jelenlétének, valamint az ER-rezidens fehérje, a protein-diszulfid izomeráz (PDI) hiányának elemzésével igazoltuk (4D ábra).

Érdekes módon azt is megfigyeltük, hogy az ER-stresszben szenvedő sejtek összevont mitokondriális frakcióiban a GRP78 mennyisége növekedett a kontrollhoz képest. Megjegyzendő, hogy bár a Tun-inger a citoszol GRP78 szintjének növekedését is indukálhatja, ez nem volt látható a mitokondriális frakciónál.

A GRP78 kényszerített túlzott expressziója elősegítette mind a PINK1, mind a Parkin felhalmozódásának növekedését az itokondriális frakcióban (4D ábra és S4 ábra). Beszámoltak arról, hogy a Parkin jelenléte felerősíti az Ub felhalmozódását és fokozza a mitofagiát, összehasonlítva a PINK egyedüli jelenlétével [42,47]. Ennek megfelelően az ubiquitin (Ub) immunoblot vizsgálata különbségeket mutatott ki annak profiljában a GRP78--ot expresszáló sejtek mitokondriális frakcióiban a GFP-csoporthoz képest (4D. ábra).

Stresszes körülmények között a mitokondriális fehérjék ubiquitilációja az autofagoszóma gépezet komponenseinek felhalmozódásához vezet, ami az LC3 és LC3II lipidezett izoformájának felhalmozódásával kezdődik [42,48].

Bőséges LC3II fehérjét figyeltek meg a mitokondriális frakcióban, amely a GRP78-at túltermelő stresszhelyzetben lévő sejtekben fokozottabb jelenlétet mutatott, mint a hasonló körülmények között GFP-ben szenvedőknél (4D ábra). Összességében ezek az adatok arra utalnak, hogy a GRP78 kényszerített expressziója elősegítheti a mitokondriális transzlokációt és mitofág címkézése.

Annak érdekében, hogy meghatározzuk a mitofág indukció lehetséges jelentőségét a GRP78 túlzott expressziója által közvetített neuroprotektív hatásban, értékeltük a mitofágia aktivátorai és inhibitorai által kiváltott változásokat. Karbonil-cianid-m-klórfenil-hidrazint (CCCP) használtunk az oxidatív foszforiláció kémiai szétválasztására és a mitofágia indukálására a mitokondriális membránpotenciál összeomlásával [49,50], valamint két mitofágia-gátlót: a BAPTA-AM-et, az intracelluláris sejt-permeáns kelátort. 2+ és ciklosporin A (CSA), a mitokondriális permeabilitás átmeneti pórus (mPTP) inhibitora, amely blokkolja a Ca2+ mitokondriumokból való kiáramlását [51].

Bár a CCCP-kezelés az NSC34-ben nem volt elegendő ahhoz, hogy jelentősen csökkentse az életképességet, amint azt széles körben beszámolták, azt találtuk, hogy az ER-stressz sejtek esetében ugyanaz a kezelés növelte a túlélést, függetlenül attól, hogy a GRP78 túlzott volt-e vagy sem (4E. ábra).

Fontos, hogy a GRP78 túlzott expressziója által előmozdított neuroprotektív hatás az ER-stressznek kitett sejteken megszűnt CSA vagy BAPTA-AM jelenlétében (4E. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a mitofág indukció lehetővé teszi a sejtek számára, hogy megbirkózzanak az ER stresszel és a Ca2+-fluxussal. fontos a GRP78 által előidézett neuroprotektív hatás szempontjából.

A GRP78 mitofágia indukálásának egyik lehetősége a szükséges Ca2+- által közvetített hatás elősegítése, talán az ER-rezidens inozitol 1,4,5-trifoszfát receptor (IP3R) hatására, amelynek megnyitása lehetővé teszi a Ca2+ áramlását. Az ER-ből a mitokondriumokba. Ezt a lehetőséget az IP3R aktiválásának gátlásával akartuk megvizsgálni thapsigargin (THA), egy Ca2+ ATPáz inhibitor [52] segítségével.

A thapsigarginról is ismert, hogy ER-stresszt termel a sejtekben, mivel ez a kezelés kimeríti az ER-ből származó Ca{0}}-raktárakat, és ezáltal fokozza a GRP78-expressziót a kanonikus kibontott fehérjeválasz részeként [53]. A 4F. ábra azt mutatja, hogy a thapsigargin a tunicamycin kezeléshez hasonlóan befolyásolja a sejtek életképességét a GFP-kontroll sejtekben, és hogy a CCCP egyidejű kezelés megakadályozza a sejthalált, amint azt Tun esetében megfigyelték.

Azonban a GRP78 erőszakos túlzott expressziója nem volt képes blokkolni a káros thapsigargin hatást, mint a tunicamycin inzultus esetében. Ez a megfigyelés megerősíti a Ca2+ fluxus szükséges részvételét a GRP78 neuroprotektív hatásában, valószínűleg az IP3R révén.

3.1.4. A GRP78 által közvetített neuroprotekció A PINK1-től és az IP3R-től függ

A GRP78 neuroprotektív hatás mediátorainak azonosításához shRNS technológiát alkalmaztunk. Először is ellenőriztük, hogy a kiválasztott shRNS csökkentette a GRP78, a PINK1 vagy az IP3R expresszióját (S4A–C ábra), és nem veszélyezteti a kontrollsejtek életképességét (S4D ábra). Először megerősítettük, hogy maga a GRP78 expressziója szükséges mind a GRP78-, mind a CCCP által közvetített neuroprotekcióhoz, hogy szembenézzen a Tun-indukálta ER stresszel (5A. ábra).

Ezután a PINK1 vagy az IP3R elnémítása blokkolta a GRP78 túlzott expressziója vagy a CCCP-kezelés által előidézett neuroprotektív hatást (5A. ábra). Ezenkívül azt találtuk, hogy a GRP78 eltolódása, amely normálisan sima foltos eloszlásban oszlik el a sejtmag körül, az IP3R-re lokalizálódik a foltos gócokban, amikor túlzottan kifejeződött (5B. ábra).

Ezek az eredmények együttesen arra utalnak, hogy a GRP78 modulálja a protektív mitofagiát in vitro modellünkben, és ezt a neuroprotektív hatást PINK1- és IP3R-függő módon fejti ki.

4. Megbeszélés

A neuroprotekció endogén mechanizmusainak felerősítése hatékony terápiás eszközöket eredményezhet a traumás elváltozások vagy betegségek utáni neurodegeneratív folyamatok megelőzésére [3,54,55]. Az ER-rezidens GRP78 chaperon számos ilyen mechanizmus metszéspontjában áll, amelyek több betegségben túlzottan expresszálódnak. modellek [4].

A mögöttes mechanizmusok meghatározására a gerincgyökér avulzió modelljét alkalmaztuk [55], amely megzavarja a motoneuronok összekapcsolódását, ami retrográd neurodegeneratív folyamatot okoz [20].

Ebben a modellben a motoneuron halálát ER stressz, blokkolt autofágia-fluxus jellemzi, és nem apoptózis, mivel nem figyelték meg a kaszpáz 3 vagy 12 aktív formáit, ami arra utal, hogy az apoptózis nem a neuronális pusztulás végső végrehajtója [20]. Ennek megfelelően korábban proteomikai megközelítésekkel igazoltuk, hogy az RA után az apoptotikusokkal párhuzamosan anti-apoptotikus tulajdonságok jelentkeznek, blokkolva a hatékony apoptózis-végrehajtást [25].

Ebben a neurodegeneratív kontextusban a GRP78 túlzott expressziója motoros neuroprotekciót fejtett ki [20,26,27]. Itt kezdetben a proteom elfogulatlan összehasonlító és kvantitatív elemzését alkalmaztuk, hogy feltárjuk ennek a neuroprotekciónak az elsődleges alapját.

Nem várt módon a mitokondriumok voltak a fő célpont, a megnövekedett organellum fehérjetartalommal, amelyet az elnyelt mitokondriumok a sérült motoneuronokon belüli hólyagokba való díszítése kísér, amelyek túlzottan kifejezték a GRP78-at.

Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a mitofág jelenléte a neuroprotekció kulcseleme. Mélyebb in vitro kísérletek igazolták ezt a hipotézist, mivel a GRP78 neuroprotekciót közvetített azáltal, hogy (i) helyreállította a mitokondriumok légzését és a ROS szintjét, (ii) stimulálta a PINK1/PARKIN mitokondriumok transzlokációját, megjelölte az organellumokat a mitofagiára, és (iii) attól függően, hogy az IP3R alapvető közvetítőként működik.

Tudomásunk szerint ez az első olyan tanulmány, amely kimutatja, hogy a GRP78 túlzott expressziója elősegíti a protektív mitofágiát. Amellett, hogy a GRP78 kalciumkötő fehérjeként szerepet játszik a hibásan összetekeredő fehérjékben és más holdfény-funkciókban [4,56], hozzáadtuk a proaktív hatását stimulálja a mitofagiát. Ezenkívül tanulmányunk csatlakozik egy sor olyan közelmúltbeli tanulmányhoz, amely az ER stresszt a mitokondriális diszfunkcióval kapcsolja össze [57–59].

Megtaláltuk a mitofagia jellemzőit in vivo, amikor a GRP78 túlzottan expresszálódott és elősegítette a neuroprotekciót. Ugyanezt figyelték meg olyan in vitro modellek is, amelyek utánozzák az RA után fellépő neurodegeneratív folyamat néhány jellemzőjét, például az ER stresszt [20,26].

A mitokondriumok mitofagiával történő minőségellenőrzése döntő fontosságú a mitokondriális tartalom és az anyagcsere homeosztázis monitorozása szempontjából. Az irodalomban még mindig vitatott, hogy a mitofág indukció elősegíti-e több betegség túlélését vagy sejthalált az apoptózis jelátvitellel való kiterjedt áthallása miatt [60], bár leírták, hogy a sérült mitokondriumok eltávolítása alapvető szerepet játszik az olyan neurodegeneratív betegségekben, mint az Alzheimer-kór. , Parkinson-kór vagy öregedés [61].

Korábban beszámoltak arról, hogy a GRP78 gátolja az ER stressz által kiváltott apoptózist azáltal, hogy megakadályozza a CHOP indukciót [62,63], a kaszpáz 7 aktiválását [5] vagy a PI3K-AKT-mTOR jelátviteli tengelyt [4]. Azt is kimutatták, hogy alacsony szinten tartja az oxidatív stresszt és a DNS-károsodást [4,64]. Különösen a rákos sejtekben kimutatták, hogy a GRP78 gyengíti a ROS-t azáltal, hogy aktiválja a protein kináz RNS-szerű endoplazmatikus retikulum kináz (PERK)-NRF2 jeleit [65,66], ami az antioxidánsokkal kapcsolatos gének felszabályozásához, valamint a fehérjeszint növeléséhez vezet. glikolitikus enzimek [67].

Ehelyett azt találtuk, hogy a GRP78 túlzottan expresszálja a glikolitikus enzimeket (pl. ENO1 és ENO2) (kiegészítő táblázatok). Ezek az eredmények arra utalhatnak, hogy modellünkben a ROS megfigyelt gyengülése inkább a megnövekedett mitofagiával függhet össze, bár az érintett mechanizmus részleteit tovább kell vizsgálni. A mitokondriális diszfunkció gyakori állapot a neurodegeneratív betegségekben [68], és a mitofágia is szerepet játszik Parkinson-kórban [49,69], Huntington-kórban [70,71], Alzheimer-kórban és Tauopathiában [72].

Számos szerző rámutatott, hogy a mitofágia útvonalak megfelelő szabályozásával a szervezet elkerülheti a káros oxidatív fajokat, szabályozhatja a redox egyensúlyt és a homeosztázist [73]. Így a GRP78 túlzott expressziója ezen a szabályozott mitofágindukción keresztül neuroprotektív stratégiának tekinthető ezekben a betegségekben. Úgy tűnik, hogy a GRP78 túlzott expressziója által közvetített neuroprotekció a Ca2+ fluxustól függ, mivel azt a BAPTA-AM blokkolta. A Ca2+ BAPTA-AM kelátozása több különböző lépésben is beavatkozhat az autofág fluxusút mentén, nemcsak az autofágia kiváltását, hanem az autofagoszómák képződésének és feldolgozásának lépéseit is gátolja [74].

Ezzel szemben egy másik, a Ca2+ áramlását befolyásoló szer, például az aszthapsigargin alkalmazása meglepő eredményeket hozott. A Thapsigargin blokkolja a szarko-endoplazmatikus retikulumCa2+ ATP-ázokat (SERCA-kat), fenntartva a citoszol Ca2+ emelkedését, de az intracelluláris Ca2+ raktárak krónikus kimerülése és a kibontott fehérjék felhalmozódása révén ER stresszt is kivált.

Ebben a helyzetben megfigyeltük, hogy a GRP78 túlzott expressziója nem tudja megmenteni a haldokló sejteket, és gyanítottuk, hogy ennek az az oka, hogy a thapsigargin az IP3R hatását is gátolja [52]. Az IP3R alapaktivitása és a folyamatos alacsony szintű Ca2+ áramlás az ER-ből a mitokondriumokba nélkülözhetetlen a mitokondriális légzés és a sejtbioenergetika elősegítésében [75].

A GRP78 kölcsönhatásba lép a MAM-okkal a szigma-1 receptor (SIGR1) és az IP3R által alkotott komplexszel [76,77]. ERstressz hatására a SIGR1-GRP78 kölcsönhatás a Ca2+ kimerülése miatt csökken, ami ezt követően az IP3R-eken keresztül fokozza a Ca2+ áramlását az ER-ből a mitokondriumokba [76]. Ezenkívül azt is kimutatták, hogy az IP3R szükséges a Parkin-indukált mitofagiához, különösen a Parkin-utánpótláshoz szükséges mitokondriális klaszterek kialakulásához [78].

Eredményeink megegyeznek azzal, hogy az IP3R shRNS technológiával történő redukálása megszüntette a GRP78 túlzott expressziója által kifejtett neuroprotektív hatást ER-stresszben szenvedő sejtekben. Érdekes az a megfigyelés is, hogy a GRP78 növekedhet magán a mitokondrium frakción. A GRP78-at a belső membrán közbenső térben és a mitokondriumok mátrixában mutatták ki, bár az ottani funkcióját még tisztázni kell [79].

Mindazonáltal, és számos funkcióját tekintve, úgy gondoljuk, hogy pufferelő Ca2+ lehet. Ha ez a helyzet, megnövekedett jelenléte a mitokondriumokban az ER-stressz sújtott sejtekben, ha túlzottan expresszálódik, mérsékelheti a hatalmas Ca2+ beáramlást, hogy elkerülje az apoptózist. Az ezzel kapcsolatos további kísérletezés nagyon értékes lenne.

A tanulmány korlátai és a jövőbeli kutatások

Ez a tanulmány megnyitja az utat a GRP{0}}dependens mitofágia neuroprotektív szerepének jövőbeni elemzései előtt a neurotrauma utáni idegsejthalálban. A tanulmány első korlátja az, hogy a mitofagiát egy meghatározott időablakban elemezték az RA után, és mivel a mitofág egy dinamikus folyamat, érdekes lenne megfejteni annak áramlását és azt, hogy mely molekulákról van szó.

Így további, a mitofagiát moduláló kísérletekre (farmakológiai vagy genetikai megközelítésekkel) van szükség annak megfejtésére, hogy az in vivo megfigyelt hatások tisztán a mitofagiától függenek-e.

Ez lehetővé teszi számunkra, hogy megerősítsük, hogy a GRP78 túlzott expressziója elősegíti az MN túlélését a mitofágán keresztül. Mivel a mitokondriumok és az apoptózis között jól leírt keresztszál van, további in vitro és in vivo manipulációk elengedhetetlenek ahhoz, hogy megfejtsük, hogy modellünkben melyik halálozási mechanizmus váltja ki az MN halálát. Ez segít annak tisztázásában, hogy a GRP78 közvetlenül modulálja-e ezt a sejthalál mechanizmusát azáltal, hogy blokkolja azt, vagy jelenléte lehetővé teszi az MN-ek számára, hogy megbirkózzanak vele, és túléljék.

5. Következtetések

Ez a tanulmány volt az első, amely leírta a GRP78 új szerepét a mitofág modulálásában a motoneuronális védelem elérése érdekében. Eredményeink azt mutatják, hogy a GRP78 a mitofagiát képes előmozdítani a degeneráló motoros neuronok neuroprotekciójának elősegítésére súlyos traumás idegsérülést követően, helyreállítva a sérült mitokondriális funkciót az idegsejtekben. Ezenkívül ez a GRP78-közvetített neuroprotekció a PINK1-től és az IP3R-től függ. Ezért a finomhangolt mitofág aktiválása GPR78 vagy más jelöltekkel végzett génterápián keresztül új terápiás megközelítésként használható az idegrendszer traumás sérüléseinek kezelésére. .

Kiegészítő anyagok: A következők online elérhetők a https://www.mdpi.com/article/10.3390/biomedicines9081039/s1 címen. S1 ábra: Bioinformatikai elemzés. S2 ábra: Endogén GRP78 szintek Tun kezelés után. S3 ábra: A Tun és az EFV mitokondriális diszfunkciót okoz NSC34 sejtekben. S4 ábra: Nincs cím. S5 ábra: Sejtéletképesség elemzése shRNS nukleofekció után A kiegészítő anyagok tartalmazzák a táblázatokat is, amelyek a proteomikai analízis során kimutatott összes fehérjét tartalmazzák.

A szerző közreműködése: TL-R. és DR-G. megtervezte és végrehajtotta a kísérleteket, elemezte az eredményeket, és megírta a kézirat egy részét. MH-G. és JF segített az in vivo kísérletekben.PM-G. és JML végezte a mitokondriális tisztításokat. Az MP, CB és NA segített a mitokondriumok funkcionális elemzésében. VP és AB elkészítette az összes használt GRP78 plazmidot és viralvektort. A CC kigondolta, megtervezte, felügyelte és elemezte az összes kísérletet, és megírta a kéziratot. Minden szerző elolvasta és elfogadta a kézirat közzétett változatát.

Finanszírozás: Ezt a munkát elsősorban a Spanyol Gazdasági Minisztérium (#SAF 2014-59701) és a Marató de TV3 (#201607.10) támogatta. Hálásak vagyunk a CIBERNED és a Generalitat de Catalunya támogatásáért is. A CB Miguel Servet szerződésének (CP19/00077) címzettje a Carlos III Health Institute-tól.

Az intézményi felülvizsgálati testület nyilatkozata: Az állatokat érintő összes eljárást az Universitat Autònoma de Barcelona és a Generalitat de Catalunya hagyta jóvá, és követte az Európai Közösségek Tanácsának 2010/63/EU irányelvét.

Tájékozott hozzájárulási nyilatkozat: Nem alkalmazható.

Nyilatkozat az adatok elérhetőségéről: A jelen tanulmány során generált vagy elemzett összes adat megtalálható ebben a közzétett cikkben és a kiegészítő információs fájlokban.

Köszönetnyilvánítás: Köszönetet mondunk Marta Monserratnak, Ariadna Aransanznak, Miguel Chillónnak, Julia Lorenzónak, Sara Marmolejonak és az UAB Neuroplasztikus és Regenerációs Csoportjának. Külön köszönetet mondunk Carlos Guillemnek (University Complutense de Madrid), amiért kedvesen biztosította a PARK{0}}HAplazmidot, valamint Elena Galeának és Esther Dalfónak az UAB-nál az antitestekért.

Összeférhetetlenség: A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.

Különleges nyilatkozat: A szerzők külön említést kívánnak szentelni Caty Casasnak, a befolyásos tudósnak és egy csodálatos és bátor embernek, aki idő előtt, 54 éves korában halt meg. Megtiszteltetés és kiváltság, hogy megoszthattam vele egy részét. életét, szakmai képességeit, valamint etikai és emberi értékeit.

Hivatkozások

1. Conforti, L.; Gilley, J.; Coleman, MP Walleri degeneráció: Egy feltörekvő axonhalál út, amely összeköti a sérülést és a betegséget. Nat.Rev. Neurosci. 2014, 15, 394–409. [CrossRef]

2. Romeo-Guitart, D.; Forés, J.; Herrando-Grabulosa, M.; Valls, R.; Leiva-Rodríguez, T.; Galea, E.; González-Pérez, F.; Navarro, X.; Petegnief, V.; Bosch, A.; et al. Mesterséges intelligencia felhasználásával feltárt neuroprotektív gyógyszer idegsérülésekre. Sci. Rep. 2018, 8,1879. [CrossRef]

3. Romeo-Guitart, D.; Forés, J.; Navarro, X.; Casas, C. A NeuroHealin által felgyorsított regeneráció és csökkent denervált izomsorvadás az ágyékgyökér-avulzió preklinikai modellje késleltetett újraimplantációval. Sci. Rep. 2017, 7, 12028. [CrossRef]

4. Casas, C. Grp78 a neurodegeneráció és a rák színpadának középpontjában. Elülső. Neurosci. 2017, 11, 1–15. [CrossRef]

5. Reddy, RK; Mao, C.; Baumeister, P.; Austin, RC; Kaufman, RJ; Lee, AS A GRP78 endoplazmatikus retikulum chaperon fehérje megvédi a sejteket a topoizomeráz inhibitorok által kiváltott apoptózistól. Az ATP-kötőhely szerepe a kaszpáz-7aktiváció elnyomásában. J. Biol. Chem. 2003, 278, 20915–20924. [CrossRef] [PubMed]

6. Wang, M.; Kaufman, RJ A fehérje hibás feltekeredése az endoplazmatikus retikulumban, mint az emberi betegségekhez vezető út. Természet 2016, 529.326–335. [CrossRef] [PubMed]7. Printsev, I.; Curiel, D.; Carraway, KL Membrán fehérje mennyiségi kontroll az endoplazmatikus retikulumban. J. Membr. Biol. 2016,250, 1–14. [CrossRef] [PubMed]

8. Shu, C.-W.; Sun, F.-C.; Cho, J.-H.; Lin, C.-C.; Liu, P.-F.; Chen, P.-Y.; Chang, MD-T.; Fu, H.-W.; Lai, Y.-K. A GRP78 és a Raf{11}}együttműködve rezisztenciát biztosít az endoplazmatikus retikulum stressz által kiváltott apoptózisával szemben. J. Cell. Physiol. 2008, 215, 627–635. [CrossRef]

9. Cook, KL; Clarke, R. Heat shock 70 kDa protein 5/glucose-regulated protein 78 "AMP" ing up autophagia. Autofágia 2012, 8,1827–1829. [CrossRef]

10. Li, Z.; Wang, Y.; Newton, IP; Zhang, L.; Ji, P.; Li, Z. A GRP78 szerepet játszik a tumor aerob glikolízisének modulálásában azáltal, hogy elősegíti az IKK autofág lebomlását. Sejt. Jel. 2015, 27, 1237–1245. [CrossRef]

11. Cha-Molstad, H.; Yu, JE; Lee, SH; Kim, JG; Sung, KS; Hwang, J.; Yoo, YD; Lee, YJ; Kim, ST; Lee, DH; et al. Az SQSTM1/p62 aktivitás modulálása a HSPA5/GRP78/BiP endoplazmatikus retikulum chaperon N-terminális arginilációjával. Autofágia 2016,12, 426–428. [CrossRef]

12. Cha-Molstad, H.; Sung, KS; Hwang, J.; Kim, KA; Yu, JE; Yoo, YD; Jang, JM; Han, DH; Molstad, M.; Kim, JG; és munkatársai. Az amino-terminális arginiláció az endoplazmatikus retikulum chaperone BiP-t célozza meg az autofágiára a p62 kötődésen keresztül. Nat. Cell Biol.2015, 17, 917–929. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com