HPLC négy fenil-etanol-glikozid komponens egyidejű meghatározásához Cistanche Herba főzetdarabokban és Cistanche Tubulosa kivonatokban

Absztrakt: A tanulmány célja, hogy megállapítsa anagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC)módszer négy fenil-etanol-glikozid egyidejű meghatározásáraCistanches Herba főzetdarabokésCistanche tubulosa kivonatok. A kromatográfiás körülmények egy Inertsil ODS{{0}} oszlopot (250 mm × 4,6 mm, 5 µm) alkalmaztak, amelynek mozgófázisa acetonitril - 0,1% hangyasavat tartalmazott. gradiens elúcióval. Az áramlási sebességet 1.0 ml/perc értékre állítottuk be, az oszlop hőmérsékletét 30 fokon tartottuk, és a detektálási hullámhossz 330 nm volt 1{ befecskendezési térfogat mellett. {27}} µL. A csúcsterület linearitása koncentrációkkal 2,53 és 201,60 µg/ml között volt a különböző glikozidok esetében, a korrelációs együtthatók (r) nagyobbak, mint 0,9993. A kimutatási határ (LOD) és a kvantifikálás (LOQ) 0,2249 és 1,1004 µg/ml, illetve 0,3101 és 0,8161 µg/ml között volt. A módszer jó pontosságot, stabilitást és ismételhetőséget mutatott 3,0%-nál kisebb RSD-értékekkel. Az átlagos visszanyerési arány 97,70% és 100,95% között változott, jelezve a módszer pontosságát és hatékonyságát ezen komponensek egyidejű mennyiségi meghatározására a mintákban.

Kulcsszavak:Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia,Isztanszok Herba, főzetdarabok,Cistanche tubulosa kivonatok, feniletanol-glikozidok, tartalommeghatározás.

HETIAN DICHENMIKROBIÁLIS HATÁRÉRTÉKŰ SZOBA

A Cistanche, más néven Rou Cong Rong és Desert Ginseng az Orobanchaceae családjába tartozik, és a hagyományos gyógyászatban pikkelyekkel borított, húsos szárai miatt használják. A Chenopodiaceae növények, például a Haloxylon és a Tamarix gyökereiben élősködik, és elsősorban Belső-Mongólia, Qinghai, Xinjiang és Ningxia száraz vidékein található Kínában. Először a "Shennong Bencao Jing" klasszikus gyógynövényszövegben szerepelt, mint kiváló minőségű gyógynövény. A Cistanche édes és sós ízű, meleg természetű, és a vese és a vastagbél meridiánjaihoz kapcsolódik. Jótékony hatásairól ismert: erősíti a veséket és a jangot, hidratálja a beleket és enyhíti a székrekedést, védi a májat, védi az öregedést, küzd a fáradtság ellen és erősíti az immunitást. Klinikailag gyakran használják olyan állapotok kezelésére, mint a vese-yang-hiány, a vérhiányos székrekedés, a nők meddősége, gyenge térd és hát, valamint memóriaromlás. Cisztanchét a "sivatag ginzengejeként" és "értékes gyógyszerként" tisztelik.

A növény fenil-etanol-glikozidokat, iridoid terpéneket, alkaloidokat, lignánokat és egyéb komponenseket tartalmaz, az echinakozid és az akteozid pedig a fenil-etanol-glikozidok reprezentatív fenil-etanol-glikozidjai, amelyek a yang-fokozó, öregedésgátló, antioxidáns és memóriajavító hatásukról ismertek. Ezek az összetevők jelentik a Cistanche gyógyhatásainak elsődleges alapját, és a Kínai Gyógyszerkönyv 2020-as kiadásában a minőségértékelés és -ellenőrzés kulcsfontosságú mutatói.

Vannak jelentések a Cistanche-fajták fenil-etanol-glikozid-tartalmának nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) történő meghatározásáról, de ezek a nyers Cistanche anyagokra és szeletekre korlátozódtak. Jelenleg nincsenek nemzeti szabványok a Cistanche tubulosa kivonattal kapcsolatban, és a tartalmának meghatározásáról sem számoltak be. Előzetes kutatásunk azt találta, hogy a Xinjiangból származó Cistanche tubulosa főként négy reprezentatív fenil-etanol-glikozidot tartalmaz: echinakozidot, izoakteozidot, akteozidot és tubulozid A-t. Ez a tanulmány egy HPLC-módszert hozott létre e négy komponens egyidejű meghatározására mind a Cistanche főzetdarabokban, mind a tubulosa kivonatban. célja a Cistanche főzetdarabok minőségének jobb értékelése és a kivonatai minőségi szabványainak kialakítása. A jelentés a következő.

1 Műszerek és reagensek

1.1 Műszerek

• LC-20AT nagyteljesítményű folyadékkromatográf, diódasoros detektorral (Shimadzu, Japán)

• AB135-S elektronikus mérleg (Mettler Toledo, Svájc)

• KQ-500DE ultrahangos tisztító (Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.)

• Aike ultra-tiszta vízrendszer (Chengdu Tangshi Corning Science and Technology Development Co., Ltd.)

1.2 Reagensek

• A Pinorezinol-diglükozid (S{0}} tételszám), az izomukronulatol 7-O-glükozid (Y-073-11803024 tételszám), a mukronulatol 7-O-glükozid (M{ gyártási tételszáma) standard anyagai {6}}), és a Tubuloside A (G gyártási szám-066-11812016), melyek mindegyike a Beijing Inlay Technology Development Co., Ltd.-től vásárolt 98% feletti tisztasággal.

• Az acetonitril és a metanol kromatográfiás minőségű, a hangyasav analitikai minőségű, a víz ultratiszta volt.

• Négy tétel Cistanches Herba főzetdarabot (S1, S2 kód Belső-Mongóliából; S3, S4 kód Hszincsiangból) mindegyiket négy urumcsi gyógyszertárból vásárolták.

• A Cistanche tubulosa kivonatokat (S5 kód, enziminaktivált száraz szelet vizes extrakció; S6 kód, enziminaktivált száraz szelet alkoholos extrakció; S7 kód, enziminaktivált száraz szelet alkoholgyantához kötött extrakció) a Xinjiang Hetian Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co. ., Kft.

2 Módszerek és eredmények

2.1 Kromatográfiai körülmények

• Kromatográfiás oszlop: Inertsil ODS-3 oszlop (250 mm × 4,6 mm, 5 µm)

• Mozgófázis: Acetonitril (A) - 0,1%-os hangyasav vizes oldata (B) gradiens elúcióval (17% A-ról 20% A-ra 0-12 perc alatt, 20% A-tól 22% A-ig több mint 12-30 perc, 22% A – 17% A 30-35 perc felett)

• Áramlási sebesség: 1.{1}} ml/perc

• Érzékelési hullámhossz: 330 nm

• Oszlop hőmérséklet: 30 fok

• Injekciós térfogat: 10 µL

  

Hetia Dichen Fizikai-kémiai Laboratórium

2.2 Oldat elkészítése

• Vegyes standard oldat: Pontosan mérje le mind a négy standardot, és töltse át külön 10 ml-es mérőlombikokba, töltse fel a jelig 50%-os metanollal, hogy 1,008, 1,011, 1,012 és 1,012 koncentrációjú egyedi standard oldatokat kapjon. mg/L a Pinoresinol-diglükozid, a Tubulozid A, a Mucronulatol 7-O-glükozid és az Isomucronulatol 7-O-glükozid esetében. Mérjünk ki mindegyikből megfelelő mennyiséget, öntsük egy 10 ml-es mérőlombikba, töltsük fel 50%-os metanollal, jól keverjük össze, hogy 201,60, 50,55, 101,20 és 50,60 µg/ml koncentrációjú vegyes standardoldatot készítsünk, és szűrjük le. 0,45 µm-es membránszűrőn keresztül.

• Mintaoldat: Körülbelül 1.0 g Cistanches Herba főzetport (4-es számú szitán átszitva) pontosan lemérünk, és egy 1{{10}}0 ml-es borostyánszínű mérőlombikba töltjük. . Adjunk hozzá pontosan 50 ml 50%-os metanolt, mérjük le, extraháljuk ultrahanggal 40 percig 250 W teljesítménnyel és 35 kHz frekvenciával, hűtsük le, mérjük meg újra, és pótoljuk a vesztett tömeget 50 % metanollal. Jól keverjük össze, szűrjük le, és gyűjtsük össze a szűrletet. Húzza át egy 0,45 µm-es membránszűrőn, hogy megkapja a Cistanches Herba mintaoldatot. Hasonló módon készítse el a Cistanche tubulosa kivonat mintaoldatát körülbelül 0,2 g kivonatpor felhasználásával.

1. Echinakozid 2. Tubulozid A 3. Akteozid 4. Izoakteozid A. Vegyes összehasonlító oldat B. Cistanches Herba főzetdarabok vizsgálati oldata C. Cistanche Tubulosa kivonat vizsgálati oldata

2.3 Módszertani vizsgálat

Rendszeralkalmassági teszt: A 2.2. szakaszban szereplő három oldatból megfelelő térfogatú mintát vettünk a 2.1. szakaszban vázolt kromatográfiás körülmények között, és feljegyeztük a kromatogramokat. Az eredmények azt mutatták, hogy az echinakozid csúcs elméleti lemezszámának legalább 3000-nek kell lennie, 1,5-nél nagyobb elválasztási fokokkal, ami jó alapvonali elválasztást jelez. A részletekért lásd az 1. ábrát.

Linearitás értékelése: A kevert referenciaoldat pontos térfogatai a 2.2 szakaszból (0,5, 1.0, 2,5, 5.0 és 10,0 ml) ) 10 ml-es mérőlombikokba vittük át, 50%-os metanollal térfogatra hoztuk, jól összekevertük, és kevert referenciaoldatok sorozatának elkészítésére használtuk. Ezekből az oldatokból pontosan 10 µl-t fecskendeztünk be a 2.1. szakasz kromatográfiás körülményei között. Feljegyeztük a csúcsterületeket, és lineáris regressziót végeztünk a komponensek koncentrációival (X, µg/mL) független változóként és csúcsterületei (Y) függő változóként. A regressziós egyenletek és a linearitási tartomány az 1. táblázatban találhatók.

Kimutatási és mennyiségi meghatározási határok: A 2.2. pontban szereplő vegyes referenciaoldat pontos térfogatait vettük, ennek megfelelően hígítottuk, és a 2.1. pontban leírt kromatográfiás körülmények között analizáltuk. A 3:1 és 10:1 jel-zaj aránynak megfelelő koncentrációkat használtuk kimutatási, illetve mennyiségi határként. Az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.

Precíziós vizsgálat: A 2.2. szakaszból származó összekevert referenciaoldat megfelelő térfogatát hatszor egymás után elemeztük a 2.1. pont kromatográfiás körülményei között. Az echinakozid, tubulozid A, akteozid és izoakteozid csúcsterületeinek RSD-értékei 1,31%, 0,91%, 1,58% és 0,58% voltak (n {{12} }), ami a műszer jó pontosságát jelzi.

Stabilitási teszt: A vizsgálati mintaoldatokat elkészítettük, és szobahőmérsékleten hagytuk 0, 2, 4, 6, 8, 12 és 24 órán át, mielőtt a 2.1. szakaszban leírt körülmények között analizálnák őket. Az echinakozid, tubulozid A, akteozid és izoakteozid csúcsterületeinek RSD-értékei rendre 1,84%, 2,18%, 1,05% és 1,55% voltak (n=7), ami azt jelzi, hogy a tesztoldatok stabilak voltak a szobában. hőmérsékleten akár 24 órán át.

Ismételhetőségi teszt: Egy mintát (ID: S2) pontosan lemértünk és hat részre osztunk. Minden egyes adagot vizsgálati mintaoldatként készítettünk a 2.2. szakaszban leírt módszer szerint, és a 2.1. szakaszban leírt kromatográfiás körülmények között elemeztük. Az echinakozid, tubulozid A, akteozid és izoakteozid átlagos tartalma rendre: 0,779%, 0.020%, 0,155%, illetve 0,074%. , 1,21%, 3,12%, 2,65% és 2,96% (n=6) RSD-értékekkel, ami a módszer jó megismételhetőségét mutatja.

Visszanyerési teszt: Ismert mennyiségű mintát (ID: S2) vettünk, és kilenc részre osztottuk. Minden egyes adagot a 2.2. szakaszban leírt módszer szerint elkészített egyedi referenciaoldatokkal kis, közepes vagy magas koncentrációban megtapasztottunk, és a 2.1. szakaszban leírt kromatográfiás körülmények között elemeztük. Feljegyeztük a csúcsterületeket, és kiszámítottuk a visszanyerési arányokat. Az eredményeket a 2. táblázat tartalmazza.

Hetian DiChen HPLC Laboratórium

2.4 Mintatartalom meghatározása

A 2.2. szakaszban leírt módszer szerint minden egyes tételből megfelelő térfogatú mintát készítettünk vizsgálati oldatként, majd a 2.1. szakaszban leírt kromatográfiás körülmények között elemeztük. Minden mintát három párhuzamosban vizsgáltunk, a csúcsterületeket feljegyeztük, és kiszámítottuk a minták tartalmát. Az eredményeket a 3. táblázat tartalmazza.

3 Vita

Ebben a vizsgálatban diódasoros detektort alkalmaztak, és a vegyes referenciaoldatokat és a tesztmintaoldatokat 200-450 nm hullámhossz-tartományban vizsgálták. Az eredmények azt mutatták, hogy az echinakozid és az akteozid 330 nm-nél, a tubulozid A 331 nm-nél, az izoakteozid pedig 327 nm-nél mutatott maximális abszorpciót. Ezenkívül a Kínai Gyógyszerkönyv 2020-as kiadására hivatkozva, amely 330 nm-es detektálási hullámhosszt határoz meg az echinakozid és az akteozid esetében, megfigyelhető, hogy sok komponens jelentős kromatográfiás csúcsokkal és magas válaszértékekkel rendelkezik 330 nm-en, ami a 330 nm-es hullámhossz kiválasztásához vezetett. a végső mérési hullámhossz.

A Cistanches Herba főzetdarabok tartalom-meghatározásának eredményeiből kiderült, hogy mind a Cistanche tubulosa, mind a sivatagi Cistanche esetében az echinacoside volt a legmagasabb, ezt követi az akteozid, míg a tubulozid A és az izoakteozid tartalommal viszonylag alacsonyabb volt. A négy fenil-etanol-glikozid komponens tartalmában szignifikáns eltérések mutatkoztak, és ez a variabilitás az azonos helyről vagy különböző helyekről származó különböző tételek között is kifejezett volt. Ez az eltérés olyan tényezőknek tudható be, mint a földrajzi környezet, a hőmérséklet, az éghajlat és a nyersanyagok betakarítási folyamatai, amelyek befolyásolják a vegyi összetevők felhalmozódását a növényekben. Míg a különböző eredetű Cistanche kémiai összetevői hasonlóak, ezeknek az összetevőknek a koncentrációja eltérő, ami eltérő hatásokhoz vezet. Ezért a jobb klinikai eredmények elérése érdekében célszerű a nyersanyagokat a hatékonyságuk alapján kiválasztani.

Összefoglalva, az ebben a tanulmányban kialakított módszer egyszerű, gyors, pontos és hatékony. Alkalmazható egyidejűleg négy fenil-etanol-glikozid komponens meghatározására Cistanches Herba főzetdarabokban és Cistanche tubulosa kivonatokban. A tartalommeghatározás eredményei tükrözhetik az azonos vagy különböző helyről származó különböző tételek és különböző kivonatok minőségi szintjét, elméleti alapot adva a vonatkozó minőségi szabványok megállapításához.

Tab. 2 A helyreállítási teszt eredménye (n=9)

Tab. 3 Négy fenil-etanol-glikozid tartalommeghatározásának eredménye a mintákban (%,n=3)

Cistanche előnyei

Referenciák:

1. 中文 (kínai) {1}}.
   英文 (angol): National Pharmacopoeia Commission. A Kínai Népköztársaság Gyógyszerkönyve (1. kötet) [M]. Peking: Kínai Orvostudományi és Technológiai Kiadó, 2020: 140-141.

2. 中文 (kínai): 朱乃亮,徐荣,吴海峰,等. 荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉指纹图谱比较研究［J］. 中国药学杂志, 2016, 51(13):1116-1119.
   英文 (angolul): Zhu Nailiang, Xu Rong, Wu Haifeng et al. Összehasonlító vizsgálat a Cistanche deserticola és a Cistanche tubulosa [J] ujjlenyomatairól. Chinese Pharmaceutical Journal, 2016, 51(13): 1116-1119.

3. 中文 (kínai): 闫暾,齐海平,李旻辉,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉的对比［J］. 包头医学院学报, 2019,35(1):120-121.
   英文 (angolul): Yan Tun, Qi Haiping, Li Minhui és mások. A Cistanche deserticola és a Cistanche tubulosa [J] összehasonlítása. Journal of Baotou Medical College, 2019, 35(1): 120-121.

4. 中文 (kínai): 吴波,顾少菊,傅玉梅,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉通便与补肾壮阳药理作用的研究［J］. 中医药学刊, 2003, 21(4):539-548.
   英文 (angolul): Wu Bo, Gu Shaoju, Fu Yumei és mások. A Cistanche deserticola és a Cistanche tubulosa hashajtó és tonizáló vese-jang hatásának tanulmányozása [J]. Journal of Chinese Medicine and Pharmacy, 2003, 21(4): 539-548.

5. 中文 (kínai): 范亚楠,黄玉秋,贾日柱,等. 肉苁蓉炮制前后对衰老模型大鼠抗衰老及免疫功能的影响［J］. 中华中医药学刊, 2017, 35(11):2882-2885.
   英文 (angol): Fan Yanan, Huang Yuqiu, Jia Tianzhu és mások. A Cistanche deserticola hatása a feldolgozás előtt és után az öregedésgátló és az immunrendszer működésére öregedő modellpatkányokban [J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2017, 35(11): 2882-2885.

6. 中文 (kínai): 吴波,付玉梅. 肉苁蓉总苷对亚急性衰老小鼠抗脂质过氧化作用的研究［J］. 中国药理学通报,2005,21(5):639.
   英文 (angolul): Wu Bo, Fu Yumei. A Cistanche-glikozidok lipid-peroxidációt gátló hatásának vizsgálata szubakut öregedő egereken [J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2005, 21(5): 639.

7. 中文 (kínai): 胡余明,胡怡秀,刘秀英,等. 苁蓉总苷对正常小鼠学习记忆功能的影响研究［J］. 中国预防医学杂志, 2007,8(4):370-373.
   英文 (angolul): Hu Yuming, Hu Yixiu, Liu Xiuying et al. A Cistanche-glikozidok tanulási és memóriafunkcióra gyakorolt ​​hatásának tanulmányozása normál egerekben [J]. Chinese Journal of Preventive Medicine, 2007, 8(4): 370-373.

8. 中文 (kínai): 屠鹏飞,姜勇,郭玉海,等. 发展肉苁蓉生态产业推进西部荒漠地区生态文明［J］. 中国现代中药, 2015, 17(4):297-301.
   英文 (angolul): Tu Pengfei, Jiang Yong, Guo Yuhai és mások. A Cistanche deserticola ökológiai iparának fejlesztése az ökológiai civilizáció előmozdítása érdekében a nyugati sivatagi területeken [J]. Modern Kínai Orvoslás, 2015, 17(4): 297-301.

9. 中文 (kínai): 覃文婷,宿美凤,雒晓梅,等. 定性分析不同产地荒漠肉苁蓉苯乙醇苷类及多糖类成分［J］. 辽宁中医药大学学报,2018,20(7):77-81.
   英文 (angolul): Qin Wenting, Su Meifeng, Luo Xiaomei et al. Különböző eredetű Cistanche deserticolában található feniletanoid glikozidok és poliszacharidok kvalitatív elemzése [J]. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2018, 20(7): 77-81.

10. 中文 (kínai): 王力伟,曹瑞,房永雨,等. 超高效液相色谱-串联3重4极杆质谱联用法测定肉苁蓉中有效成分的含J量［. 中药材, 2017, 40(2):295-300.
    英文 (angol): Wang Liwei, Cao Rui, Fang Yongyu és mások. Aktív komponensek meghatározása Cistanche deserticolában ultrateljesítményű folyadékkromatográfiás-tandem tripla kvadrupól tömegspektrometriával [J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2017, 40(2): 295-300.

11. 中文 (kínai): 初侨,席兴军, 杨丽. 肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷闪提工艺研究［J］. 食品研究与开发,2015,36(16):49-52.
    英文 (angol): Chu Qiao, Xi Xingjun, Yang Li. Tanulmány az echinacoside és a verbascoside flash extrakciós technológiájáról Cistanche deserticolában [J]. Élelmiszerkutatás és -fejlesztés, 2015, 36(16): 49-52.

12. 中文 (kínai): 余逸凡. 肉苁蓉属植物化学成分及药理活性研究进展［J］. 化工管理, 2019(13):111-112.
    英文 (angolul): Yu Yifan. A Cistanche kémiai összetevőivel és farmakológiai tevékenységeivel kapcsolatos kutatási eredmények [J]. Chemical Management, 2019(13): 111-112.

13. 中文 (kínai): 王小新,骆婷婷. 肉苁蓉对小鼠抗疲劳及记忆力的影响［J］. 内蒙古中医药,2014,33(22):102–103.
    英文 (angolul): Wang Xiaoxin, Luo Tingting. A Cistanche deserticola hatása a fáradtság elleni küzdelemre és a memóriára egerekben [J]. Inner Mongolia Journal of Traditional Chinese Medicine, 2014, 33(22): 102-103.

14. 中文 (kínai): 随家宁,李芳婵,郭勇秀,等. 肉苁蓉化学成分,药理作用研究进展及其质量标志物预测分析［J］. 辽宁中医药大学学报,2021,23(1):191-196.
    英文 (angol): Sui Jianing, Li Fangchan, Guo Yongxiu és mások. A Cistanche deserticola kémiai összetevőivel és farmakológiai hatásaival kapcsolatos kutatási eredmények, valamint minőségjelzőinek előrejelzési elemzése [J]. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2021, 23(1): 191-196.

15. 中文 (kínai): 刘涛,殷松娜,栾昕. 肉苁蓉对卵巢早衰大鼠免疫因子和凋亡相关蛋白的影响［J］. 中国临床药理学杂志,2019,35(23):3084-3087.
    英文 (angol): Liu Tao, Yin Songna, Luan Xin. A Cistanche deserticola hatása az immunfaktorokra és az apoptózissal kapcsolatos fehérjékre korai petefészek-elégtelenségben szenvedő patkányokban [J]. Chinese Journal of Clinical Pharmacology, 20