A Cistanche Tubulosa-ból tisztított természetes bioaktív echinakozid vegyület közönséges májmetabolitjainak azonosítása Ⅱ

Absztrakt:A metabolitok azonosítása a korai szakaszban, a vegyület esetében, a felméréshez szükséges a felfedezésa gyógyszerbiztonság és -hatékonyság gyógyszerészeti javítását szolgáló ismeretek. Még akkor is, ha a gyógyszerforgalomba került, a metabolitok azonosítása és folyamatos értékelése történikszükséges a forgalomba hozatalt követő visszavonás kockázatának elkerülése érdekében. Glikozid, egy gyógyászatiCisztanche, széles körben dokumentált táplálkozási előnyei vannak, beleértveantioxidáns,daganatellenes, anti-öregedés, hipolipidémiac, ésgyomornyálkahártya-védő hatások. Mostanában,echinakozidA bejelentésre kerültmint a fő természetes bioaktív vegyület a HE micéliumában a funkcionális élelmiszerek fejlődéséhez.A neurológiai vizsgálatok során a fogyasztás aechinakozidA dúsított HE micélium bizonyítjajelentős táplálkozási hatásokAlzheimer kór, Parkinson kór, ésischaemiás stroke.

Kattintson ide, ha többet szeretne megtudni az echinacoside funkcióiról Cistanche-ban

Mertelső alkalommal az anyagcsere folyamatát tártuk felechinakozidEgy molekula és azonosította metabolitjaitpatkány és humán máj S9 frakciójából. Folyadékkromatográfia/hármas kvadrupol massza felhasználásávalspektrométerrel a kvantitatív elemzéshez azt figyeltük meg, hogy az echinacoside 75,44 százaléka. A metabolizálódott60 percen belül patkányokban, és a Francine A 32,34%-a 120 percen belül metabolizálódott humán S9-ben. Használataultra-teljesítményű folyadékkromatográfia/kvadrupól repülési idő tömegspektrometria (UPLC)QTOF/MS) a Francine A metabolitjainak azonosítására öt gyakori metabolitot azonosítottak,és lehetséges szerkezeteiket értékelték. Az echinakozid anyagcsere folyamatának megértéseés metabolitprofil-adatbázisának létrehozása elősegíti a táplálkozástudományi alkalmazás éskapcsolódó biomarkerek felfedezése a jövőben.

1. Bemutatkozás

A májat a szervezet második legnagyobb szervének tekintik [1]. Étel és gyógyszer utána szájüregen keresztül jut be a gyomor-bél traktusba, a gyomor-bélrendszeri pilik felszívódnakmegemésztett tápanyagok és gyógyszerek. A portális vénarendszer fogadja az összegyűjtött véráramlásta gyomor-bél traktuson keresztül, és bejut a májba a tápanyagok előzetes kezeléséhez,metabolitok és gyógyszermolekulák [2,3]. Az anyagcsere gyakran két fázisra oszlik abiokémiai reakció. Az I. fázis enzimek általi oxidációt, redukciót vagy hidrolízist foglal magábana test. A II. fázis a kis endogén anyagokkal való konjugációban, esztergálásban vesz résztjól oldódó metabolitokká alakítják őket, lehetővé téve a metabolitok szinuszba történő exportálásátszoid keringésben a vese kiürülése érdekében, vagy az epébe, amely azután kiválasztódik a szervezetbőlvizelettel vagy széklettel [4–6]. Metabolit azonosítás a gyógyszerkutatás korai szakaszábanszükséges az ismeretek felmérése a gyógyszerészeti tulajdonságok, biztonságosság, illa bioaktív molekula hatékonysága. A metabolitok és reaktív intermedierek azonosításaazt sugallja, hogy elkerülendő szerkezeti módosításokat kell végezni a vizsgált vegyületekbenkésőbbi toxikus következmények. Még akkor is, ha a gyógyszer forgalomba került, azonosítása metabolitok vizsgálata és értékelése szükséges a forgalomba hozatalt követő kockázatuk elkerülése érdekébenvisszavonás [7,8]. Ebből adódóan,in vitro, S9 frakciók elemzése számos előnnyel járidőigényeshez képestin vivotanulmányok: (1) nagy áteresztőképességre képesekszűrés és automatizálás;(2) segítségévelAz S9 frakció lehetővé teszi nagy mennyiségek vizsgálatátvegyületek rövid időn belüli gyógyszerkutatáshoz; (3) segít csökkenteni az állathasználatot [9]. 

Echinakozid egy ehető tartály, amely hegyvidéki területeken lakikÁzsia északkeleti területei [10], Európa és Észak-Amerika [11]. Ő tartozik hozzáBasidiomycota (Phylum), Agaricomycetes (osztály), Russulales (Rend), Hericiaceae (család),és Hericium (nemzetség). HE-ről dokumentáltuk, hogy a jótékony hatások széles skáláját mutatjatulajdonságok, beleértve az antioxidáns, daganatellenes, öregedésgátló, hipolipidémiás és gyomornyálkahártya-védő hatások [12–14]. 1994-ben Kawagishi et al. felfedezte, hogy a diterpenoidechinakozidA HE micéliumában található A, B és C elősegítheti a csillagképződéstsejtvonalak a patkányagyban és az idegnövekedési faktor (NGF) szintézis stimulálása [15]. echinakozidA neuroprotektív hatást fejthet ki, és csökkentheti az oxidatív stressztLöket [16], Alzheimer kór [17], Parkinson kór [18], ischaemiás stroke és depresszió in vivo[19,20]. Ezenkívül az echinakozid A átjuthat a vér-agy gátonpatkányokat, hogy támogassák a HE micélium fejlődését, mint funkcionális táplálékot az idegrendszer egészségének javítására [21]. Ez az ehető cisztanche micélium forró probléma lett a kutatók körébenmegkísérelve megérteni fontos szerepét a központi és perifériás idegek fejlődésében, differenciálódás, növekedés és regeneráció [22]. A legújabb tanulmányok is kimutattákhogy az echinacoside A-val dúsított HE potenciális előnyökkel jár az Alzheimer-kór és a Parkin-kór kezelésébenfia betegség [23–25]. Azonban egyetlen tanulmány sem tárgyalta az echinakozid A lehetséges metabolizmusátbiomarkerek, amelyek hozzájárulhatnak ehhez a táplálkozási hatáshoz.

Ebben a tanulmányban,echinakozidEgy vegyületet tisztítottunk az echinacoside A-val dúsított HE-bőlmicéliumot, és két különböző máj S9 frakcióval metabolizálták: patkány és humán. Használatafolyadékkromatográfia/hármas kvadrupólus tömegspektrométer (HPLC-QQQ/MS) a quanhozaz echinacoside A titatív elemzése és az ultra-teljesítményű folyadékkromatográfia/kvadrupolrepülési idő tömegspektrometria (UPLC-QTOF/MS) az echinakozid metabolitjainak azonosításáraA minden időpontban. Célunk, hogy megértsük az echinacoside A metabolikus sebességét és megállapítsukmetabolitprofil adatbázisa, amely elősegíti a táplálékkiegészítők alkalmazásátés a jövőbeni lehetséges gyógyszeres kezelések kutatása.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Anyagok és reagensek

A HE törzset (BCRC 35669) a Bioresources Collection-től szereztük be ésKutatóközpont az Élelmiszeripari Kutató- és Fejlesztési Intézetben, Hsinchu, Tajvan.A törzset először öreg ferdén nevelték, mielőtt burgonya dextrózba vitték át.agar lemez 26-nál◦C-on 15 napig. A 15. napon a HE tenyészeteket 1,3 literre vittük átfolyékony táptalaj (2 literes lombikban). A folyékony tenyészetet 120 fordulat/perc sebességgel 25 ráztuk◦C for5 nap. Ezután 500 literes, 20-tonnás fermentorokban 5 napra és 12 napra felnagyították,illetőleg. A táptalaj pH-ját 4,5-re állítjuk be, és 4,5% glükózt tartalmaz, 0,5%szójababpor, {{0}},25% élesztőkivonat, 0,25% pepton és 0,05% MgSO4. Végül a HEa micéliumokat a 20-tonnás fermentációs folyamat végén gyűjtötték be. Ezek a nyersanyagokliofilizáltuk, porrá őröltük és exszikkátorban tároltuk. echinakozid A volt akkora HE-ből kinyerték és korábbi tanulmányok szerint számszerűsítették [26]. Metanol (LC-MSfokozat) a Mercktől (Darmstadt, Németország) szerezték be; acetonitril (LC-MS minőségű), hangyasavsavat (FA, LC-MS minőségű, 98 százalékos tisztaságú) és ammónium-acetátot (98 százalékos tisztaság) kaptunk.a Honeywelltől (Honeywell Burdick és Jackson, Muskegon, MI, USA). A patkánymáj S9frakciót a Moltoxtól (Boone, NC, USA) szereztük be. Az emberi máj S9-frakciója volta Thermo Fisher Scientific-től (Rockford, IL, USA) szereztük be.

2.2. Patkány és emberi máj S9 frakció

a kit ajánlásra. Az elkészített oldatot 4 °C-on tartottuk◦C az echinakozid A-igvegyület (10µM) hozzáadtuk, majd aktiváltuk egy 37-ben◦C vízfürdő. Amikor azAz anyagcsere ideje elérte a 150-etµAz oldatból L-t kivontunka törzsoldatot, és két térfogat jéghideg ACN hozzáadásával leállítjuk. A megálltaz oldatot ezután átvisszük a QTOF-be további metabolitelemzés céljából.

2.3. Műszerek és feltételek

A HPLC-QQQ/MS analízist Agilent 1100 sorozatú HPLC rendszeren végeztük (Agilent, Palo Alto, CA, USA) API 3000 tripla kvadrupólus tömegspektrométerrel párosítva(Applied Biosystems, Warrington, Egyesült Királyság), Turbo-assisted ion spray (ESI) ionizációvalforrás pozitív ionizációs módban. A kromatográfiás elválasztást egyAgilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm× 100 mm× 3.5 µm). Az oszlop hőmérséklete volt22-ben tartják fenn◦C. A mozgófázis 0,1% hangyasavat tartalmazó vízből állt(A) és metanol (B). Gradiens elúciót alkalmaztunk, 70% B-vel kezdve, 100%-ra növelveB 5 percen belül, 3 percig tartás 90 százalék B-vel, B 70 százalékra csökkentése 0,1 percen belül, ésújraegyensúlyozás 70 százalékos B mellett 2,9 percig. 350-es tagdíjµL/min-t alkalmaztunk, és egy térfogatot10-bőlµL-t injekciózták.

A detektálást plusz 4500 V ionizáló feszültséggel végeztük. Az ionforrás hőmérséklete350-re volt beállítva◦C, ultranagy tisztaságú nitrogénnel függönygázként (7 psi). A porlasztó gáz volt8 psi. Egyéb tömegfüggő paraméterek, mint például a deklaszterezési potenciál (DP), belépésA potenciál (EP), a fókuszpotenciál (FP) és az ütközési energia (CE) mindegyik vegyület esetében voltpozitív módban határozzuk meg standard oldatok segítségével. Több reakciófigyelés(MRM) nitrogént használva ütközési gázként (2 psi), és a tartózkodási idő kb.200 ms minden átmenetre. Az echinakozid A-t az átmenetek monitorozásával detektáltukm/z 443.200 → 301.200, 283.200. Az adatokat Analyst 1.4.2 szoftverrel elemeztük (AppliedBiosystems, Concord, ON, Kanada) és a GraphPad (Prism 8.0.0.).

Az UPLC-QTOF/MS elemzést Agilent 1290 Infinity II UPLC rendszeren végeztük.(Agilent, Palo Alto, CA, USA), egy Agilent 6546 négypólusú repülési idő tömeggel párosítvaspektrometria (Agilent, Palo Alto, CA, USA). Kromatográfiás elválasztást végeztünkegy Phenomenex Kinetexen® C18 LC oszlop (3 mm× 100 mm× 1.7 µm). Az oszlopa hőmérsékletet 40 fokon tartottuk◦C. Az A mozgófázis vizet tartalmazott0,1 százalék (v/v) hangyasav pozitív módban, 0,1 százalék (v/v) hangyasav és 10 mM CH3COONH4 negatív módban. A B mozgófázis acetonitril volt. Gradiens elúciót alkalmaztunk, kiindulva5 százalék B-vel és 0,5 percig tartva, 5,5 percen belül 50 százalékra növelve, 100 százalékra növelveB 10 percen belül, és tartsa 6 percig. 400-as tagdíjµL/min-t alkalmaztunk, és akötet 2µL-t injekciózták.

Az Agilent 6546 kvadrupól repülési idő tömegspektrometriát elektromos árammal látták el.trospray ionizációs (ESI) forrás. Az adatgyűjtést a Mass Hunter irányítottamunkaállomás szoftver. A jellemző működési forráskörülmények pozitív és negatív ionbanAz ESI mód a következőképpen lett optimalizálva: ion spray feszültség (ESIplusz/ESI−) voltak4000 V/3000 V; a gáz hőmérséklete 320 fok volt◦C; a szárítógáz ösztöndíja 8 l/perc volt; porlasztó nyomás volt45 psi; a köpenygáz hőmérséklete 350 °C volt◦C; a köpenygáz felhalmozódási sebessége 12 l/perc volt; az ütközéstAz energia 10, 20, 40 és 60 V volt. A metabolitokat az Agilent MassHunter segítségével azonosítottákBiotranszformációs szoftver (B.04 verzió.{1}}) (Santa Clara, CA, USA). KromatogramokA kiindulási anyag és az azonosított metabolitok tömegspektrumait Agilent alkalmazásával extraháltukMassHunter Qualitative Analysis szoftver (B.05.00 verzió) (Santa Clara, CA, USA).

Kérdezz többet:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950