Immunreakciók allogén retinális progenitor sejtek szekvenciális binokuláris transzplantációjára az üvegtest üregébe egerekben

Absztrakt:

Az allogén humán retina progenitor sejtek (RPC) intravitreális transzplantációja ígéretesnek tűnik a vakító retina degeneráció kezelésére. A korábbi munkák azt mutatták, hogy az idegi progenitorok jól tolerálhatók allograftként egyszeri injekciót követően; azonban az allogén sejtek szekvenciális bejuttatása megnöveli a gazdaszervezet szenzitizációjának potenciális kockázatát, ami a graftok ezt követő immunkilökődésével jár. A jelenlegi vizsgálat célja annak felmérése volt, hogy immunválaszt váltanak-e ki allogén RPC-k ismételt intravitrealis transzplantációi, egérállatmodell felhasználásával. Eredetileg C57BL/6 genetikai hátterű donoroktól származó rágcsáló retina progenitor sejteket (gmRPC-ket) injektáltunk BALB/c recipiens egerekbe annak érdekében, hogy biztonsági adatokat biztosítsunk arra vonatkozóan, hogy mi várható a betegek allogén humán sejttermékkel történő ismételt kezelését követően. . A gmRPC-kre adott immunválasz enyhe volt, T-sejtekből, B-sejtekből, neutrofilekből és természetes ölősejtekből állt, és egyértelműen a makrofágok voltak túlsúlyban. Az ismételt gmRPC-dózisokkal kezelt állatok nem mutattak szenzibilizációt, és nem volt megfigyelhető a graftok immunmediált tönkretétele. Az immunszuppresszív kezelések hiánya ellenére az allogén gmRPC graftok túlélték az ismételt adagolást, így alátámasztják azt az előzetes megfigyelést, hogy az allogén RPC-k ismételt injekciója az üvegtest üregébe tolerálható retinitis pigmentosa betegeknél.

cistanche növény-növelő immunrendszer

Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez

【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Kulcsszavak: őssejtek; immuntolerancia; immunkiváltság; graft kilökődés; intravitreális injekció

1. Bemutatkozás

A retinitis pigmentosa (RP) a genetikai rúd-kúp degeneráció egy osztályát öleli fel, és progresszív látásromlást és végső vakságot eredményez. Az esetek túlnyomó többségében nem állnak rendelkezésre bizonyított terápiás intézkedések a látás megőrzésére vagy helyreállítására; ennek a kielégítetlen orvosi igénynek az egyik stratégiája azonban az őssejt-transzplantáció. Kutatócsoportunk tenyésztett humán retina progenitor sejtek (RPC) intravitreális injekcióját tárta fel, hogy beavatkozzon az RP-be azzal a terápiás céllal, hogy stabilizálja a betegség progresszióját vagy esetleg megfordítsa a lefolyását. Az RPG-k éretlen retinából származhatnak szövetadományozás útján, vagy újabban pluripotens sejtvonalakból. Állatmodelleken végzett vizsgálatok kimutatták, hogy ezek a sejtek képesek megmenteni a fotoreceptorokat a szembe való injekció utáni degenerációtól, és képesek a gazdaszemben rúd fotoreceptorokká differenciálódni. Állatkísérletek bizonyítják, hogy az injektált hRPC-k működőképes, integrált fotoreceptorokká válhatnak, és ezáltal potenciálisan stabilizálhatják a retinát azáltal, hogy közvetlenül helyettesítik a haldokló sejteket. Így az injektált hRPC-k mind neurotróf módon, mind sejthelyettesítő mechanizmuson keresztül kezelhetik az RP-t. Akárhogy is, ez a sejtalapú megközelítés racionális stratégiát kínál az RP-ben és potenciálisan más retinabetegségekben szenvedő betegek kezelésére.

Az RPC-k és általában a neurális progenitorok másik kedvező tulajdonsága az a relatív tolerancia, amelyet ezek a sejtek biztosítanak az allograft transzplantációt követően, különösen, ha olyan helyre szállítják őket, amely immunrendszeri kiváltságokkal rendelkezik, például a retinára [1,2]. Ennek ellenére a regeneratív medicina területén végzett klinikai vizsgálatok legutóbbi áttekintései továbbra is széles körben elterjedt és jelentős kihívásokról számolnak be a gyulladással és az immunkilökődéssel [3,4], beleértve a szemet célzó beavatkozásokat, például a retina génterápiákat [5], mint pl. valamint néhány, de nem minden sejtterápia [6]. Noha lokális sejttípus, a retina pigment epiteliális (RPE) sejtje nem mentes a kilökődési problémáktól [7–9]; ezért a recipiensek immunszuppressziója jelenleg bevett gyakorlat [10,11]. A humán RPC-ket viszont rendkívül jól tolerálják allograftként [6,12–16], bár ez nem terjed ki xenograftként történő alkalmazásukra, ahol immunszuppresszióra van szükség [17]. Az allogén RPC-k tartós túlélésének alapja a szemben valószínűleg számos, a felhasznált sejtekkel és a befogadó hellyel kapcsolatos tényezőt foglal magában [1,8,18,19]. Korábbi, áramlási citometriával végzett munkáink során kimutattuk, hogy az agyból és a retinából származó emberi neurális progenitorok I. osztályú, de nem II. osztályú, fő hisztokompatibilitási (MHC) antigéneket expresszálnak [20,21]. A graft kilökődésének klasszikus mechanizmusa magában foglalja az idegen MHC II. osztályú molekulák nem specifikus felismerését a CD4+ gazda limfociták által [20–25]. Ily módon a II. osztályú molekulák hiánya lehetővé teheti az átültetett progenitor sejtek számára, hogy elkerüljék az ezen a mechanizmuson keresztül közvetített immunkilökődést. Az intravitreálisan injektált hRPC-k látszólagos „immunprivilegizált” státusza azonban nem feltétlenül abszolút. Míg a rágcsáló központi idegrendszeri (CNS) progenitorai nem expresszálnak kimutatható I. vagy II. osztályú MHC-molekulákat az alapvonalon, és látszólagos immunrendszeri privilégiumot mutatnak allograftként [1,2,20], ezek a sejtek bizonyos körülmények között immunkilökődésen eshetnek át. Tanulmányok kimutatták, hogy az MHC antigének indukálhatók a központi idegrendszeri progenitorok gamma-interferonnal (IFN) történő stimulálásával [1,26]. A központi idegrendszeri progenitorok kilökődhetnek egy korábban átültetett gazdaszervezet érzékenyítése után. Ezért a központi idegrendszeri progenitor sejtek (beleértve az RPC-ket is) expresszálnak alloantigéneket, amelyeket a gazdaszervezet immunrendszere észlel. Ez együttesen azt jelenti, hogy a beültetett progenitor sejtek immun-privilegizált státusza ideiglenes, és modulációnak van kitéve, például a helyi mikrokörnyezetben jelenlévő citokinek által, és amelyek megváltozhatnak a degenerációk, például az RP során. Mindezen okok miatt a többszörös intravitrealis RPC injekcióra adott immunválaszt nehéz megjósolni, és ezt kifejezetten meg kell vizsgálni.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Ha az RPC-kezelés klinikailag sikeresnek bizonyul RP-ben, erős ösztönzők lesznek mindkét szem kezelésére ebben a kétoldalú vakító betegségben. Legalábbis biztonsági okokból a binokuláris kezeléseket általában egymást követően végezzük, jelentős késleltetéssel a két injekció között. Megjegyzendő, hogy az allogén sejtek szekvenciális bejuttatása az első injekcióra adott válaszként a gazdaszervezet szenzibilizációját eredményezheti, ami potenciálisan immunkilökődést válthat ki a második injekció hatására. Ez mindkét szem graftjának elvesztéséhez vezethet. Korábbi jelentések, amelyekben a hRPC-k egyszeri szubretinális adagolását vizsgálták RP-ben [27], vagy állatokban humán idegi progenitorokkal történő újraadagolást [28,29], az immunszuppressziót tartalmazták. Ezért a következő vizsgálatot egér RPC-k, mint szekvenciális allograftok transzlációs vizsgálataként tervezték egy eltérő genetikai háttérrel rendelkező, immunkompetens egértörzsben. Bár a humán RPC-termékeket nem tartalmazza, ezt a munkát az IND-t lehetővé tévő vizsgálatok részeként végezték, hogy állati adatokat szolgáltathassanak a biztonságról, azaz arról, hogy szükség van-e immunszuppresszióra az FDA által regisztrált vizsgálatok során ismételt RPC allograft kezelésben részesülő betegeknél.

2. Eredmények

A bilaterális RPC injekció immunológiai következményeinek tanulmányozására allogén egerekben gmRPC-ket (C57BL/6 genetikai háttér) injekcióztak intravitreálisan a BALB/c recipiensek egyik szemébe, és egy második adag RPC-t injektáltak a másik szembe 2 héttel később. A 2-hetes időintervallumot úgy választottuk meg, hogy elegendő legyen ahhoz, hogy az első graft veleszületett és adaptív immunválaszokat is kiváltson. Egyik kísérleti állat sem kapott semmilyen immunszuppresszív gyógyszeres kezelést, hogy a természetes fiziológiás immunválaszokat megfigyelhessék.

2.1.A klinikai megfigyelés és a szemészeti vizsgálat nem mutatott ki eltérést

A kísérleti állatok súlyát minden gmRPC injekció beadásakor mértük. Minden kísérleti állat súlygyarapodást mutatott az első és a második injekció között, ami összhangban van az általános jó egészségi állapottal. Azokat az állatokat, amelyeket a második gmRPC injekció után a 14. és a 28. ± 1. napon fejeztünk be, sebészeti mikroszkóppal vizsgáltuk. A legtöbb vizsgált szem elülső és hátsó szegmensét is "normális határokon belül" (WNL) lévőnek ítélték. A kezeletlen, az ál-kezelt és a gmRPC-vel kezelt csoportokban nem volt gyulladásra vagy más látható rendellenességre utaló jel, ami arra utal, hogy a gmRPC intravitrealis injekciója nem okozott tiltott gyulladásos reakciókat vagy fizikai szövetkárosodást, amely ezzel a módszerrel kimutatható volt. A graftot tartalmazó sejtklaszterek a második gmRPC injekciót követő 14. és 28. ± 1. napon is láthatóak voltak az üvegtestben (1. ábra). A gmRPC-k ismételt injekciója nem okozott észrevehető változást a sejtklaszterek méretében, ami összhangban van a donorsejtek tartós túlélésével. A súlyos patológiát a terminális végponton is értékelték, és nem észleltek megnagyobbodott szemgolyókat (ami daganatképződést jelez) vagy egyéb rendellenességet.

1. ábra: A transzplantált gmRPC-k in vivo szemfenéki fényképezéssel, sebészeti mikroszkóppal (minden=bal szem, operációs rendszer) láthatók. (A, B), ál-kezelt állatok (ál/ál, S/S); (C, D), a kontroll állatokat álkezelt jobb szemmel, majd gmRPC-kezelt bal szemmel (ál/sejt, S/C), és mindkét szemű, egymást követően gmRPC-vel kezelt állatokat (sejt/sejt, C/C). sebészeti mikroszkóppal megfigyelhető és leképezve. A felső panelen (A, C, E) az operációs rendszer képei láthatók a 14. napon a másodperces injekció után; az alsó panelen (B, D, F) az operációs rendszer képei láthatók a 28. napon a másodperces injekció után. Az allograftok halvány színű sejtcsomókként (nyilak) voltak láthatók a sejttel injektált bal szem üvegtestében (S/C, C/C) mindkét időpontban (14. nap: (C, D); és 28. nap: () E, F)). A graftokon kívül nem volt nyilvánvaló gyulladás vagy további rendellenesség az elülső és hátsó szegmensben, ilyen módon axiálisan nézve.

2.2. Az immunfluoreszcens jelölés immunsejteket mutatott az üvegtestben

Immunfluoreszcens jelölést öt fő immunsejttípusra (makrofágok, neutrofilek, természetes ölősejtek, T-sejtek és B-sejtek) végeztek a szemkriometszeteken, és pozitív immunsejt-infiltrációt mutattak ki a szemben a gmRPC injekciót követően (2A–F ábra). A gmRPC-vel injektált szemekben a T-sejtek (CD3), B-sejtek (CD45R), neutrofil (Ly-6G) és természetes gyilkos sejtek (CD49b) korlátozott mennyiségben, míg az aktivált makrofágok (Iba-1 ) voltak a fő immunsejtek, amelyek reagáltak az intravitrealis graftokra. A kezeletlen és álkezelt állatok összehasonlítható szövetei nem mutattak immunsejteket a szemkriometszetek során, ami arra utal, hogy a megfigyelt immunsejt-infiltráció a gmRPC graftokra adott válasz volt. Ezzel a megfigyeléssel összhangban az immunsejtek a gmRPC graftokat körülvevő területen vagy magukban a gmRPC klaszterekben helyezkedtek el.

2. ábra: Infiltrált immunsejtek immunjelölése kezelt csoportonként. Immunfluoreszcens képek (A) kontroll szakaszokról (másodlagos antitest önmagában), (B) anti-Iba-1 (aktivált makrofág és mikroglia marker), (C) anti-Ly-6G (neutrofil marker), (D) anti-CD49b (természetes ölősejt marker), (E) anti-CD3 (T-sejt marker) és (F) anti-CD45R (B-sejt marker) láthatók az ábrán. A korlátozott vörös jelek a leukocita markerek pozitív antitest jelölését jelzik, a zöld jelek a gmRPC graftokat, a kék jelek pedig a DAPI nukleáris jelölést. A sárga a jelek nem specifikus átfedése, a legnyilvánvalóbb a fotoreceptor külső szegmenseiben, amelyek autofluoreszcenciát mutatnak. Kezelési csoportok: kezeletlen (UT), mindkét szem kezeletlen; S/S, mindkét szem álkezelve (szekvenciálisan) vivőanyaggal; S/C, jobb szem beinjektált vivőanyaggal, majd bal szem 50,000 gmRPC-vel és; C/C, mindkét szemre 50,{16}} gmRPC-t fecskendeztek (szekvenciálisan) ütemezés szerint a 4. szakaszban

Az egyes immunsejtek csúcsszáma a szemben sejttípusonként változott (3A–E. ábra). Ezzel szemben a kétirányú ANOVA nem mutatott ki különbséget az immunsejt-infiltrációban, ha összehasonlítottuk azokat az állatokat, amelyek egyszeri gmRPC-injekciót kaptak (ál/sejtek) azokkal, amelyek kétoldali injekciót kaptak (sejtek/sejtek). Ez volt a helyzet makrofágok (anti-Iba-1 festődés) (3A. ábra), neutrofilek (anti-Ly-6G festődés) (3B. ábra), természetes gyilkos sejtek (CD49b festődés) esetén ( 3C. ábra), T-sejtek (CD3-festés) (3D. ábra) és B-sejtek (CD45R-festés) (3E. ábra).

2.3. Az ELISPOT nem mutatott antigén visszahívási választ

Az ELISPOT egy módszer az antigén-specifikus IFN-t termelő T-sejt aktiváció vizsgálatára. A forbol 12-mirisztát 13- acetáttal (PMA) végzett kezelés pozitív kontroll volt, amely utánozta a második hírvivőt, a DAG-ot, aktiválva a T-sejt-receptor útvonalat, és ezáltal a T-sejt aktiválódását. A 4A–D. ábrán a PMA-val kezelt csoportok sokkal magasabb IFN-foltszámot mutattak, mint a csak válaszadó sejteket (azaz CLN-ből származó limfociták, lépből származó lépsejtek) tartalmazó kontrollcsoportok. Amikor a válaszadó sejteket C57BL/6 lépsejtekkel (B6 SPL) együtt tenyésztettük, a 14. napon vett minták hasonlóak voltak a csak válaszadó sejtek csoportjaihoz, csak valamivel magasabb IFN foltszámmal, ami a T-sejt-aktiváció hiányára utal (4A. B).

3. ábra: A gmRPC transzplantációt követő immunsejt-infiltráció mennyiségi meghatározása. Az infiltrált immunsejteket vörös fluoreszcens jelekként tettük láthatóvá a képalkotó mezőben a gmRPC injekciót követően minden kísérleti körülményre vonatkozóan, megszámláltuk az ImageJ segítségével, és oszlopdiagramokon ábrázoltuk. Adatok Iba-1 (aktivált makrofág és mikroglia marker) (A), anti-Ly-6G (neutrofil marker) (B), anti-CD49b (természetes ölősejtek marker) (C), antitestek anti-CD3 (T-sejt marker) (D), és anti-CD45R (B-sejt marker) (E) láthatók az ábrán. Kétutas ANOVA-teszteket használtunk az ál/sejt és a sejt/sejt csoportok közötti szignifikancia tesztelésére; p értékek a következők voltak: (A) p < {{10}},4492, (B) p < 0,9376, (C) p < 0,119{{18 }}, (D) p < 0,6411 és (E) p < 0,7201 (egyik sem volt szignifikáns).

Az allogén donorsejtek ezzel a vizsgálattal történő tesztelésekor a gmRPC-vel intraperitoneálisan injektált állatokból származó válaszadó sejtek (IP-csoport) nem mutattak antigén-visszahívási választ, mivel a minták nem mutattak több T-sejt-aktivációt IFN-foltszám alapján, mint a soha nem exponált álállatok. a gmRPC-knek (ál/ál). Azok az állatok sem, amelyeket intravitreálisan injektáltak gmRPC-vel, sem egyszer (ál/sejt), sem ismételten (sejt/sejt) nem mutattak antigén-visszahívási választ. Egy esetben az ismételt gmRPC adagolásra adott válaszok tompábbnak tűntek (4B. ábra). Ezek az eredmények együttesen azt mutatták, hogy a gmRPC-k nagyon alacsony antigenitást mutatnak. Vegye figyelembe, hogy a C57BL/6 lépsejtek a gmRPC-k genetikai hátterével egyeztek meg. Az alternatív stimulátorsejtek, a gmRPC-k váratlanul növelték az IFN-foltszámot az összes kísérleti csoportban a negatív kontrollcsoportokhoz képest (4A–D. ábra). A lehetséges magyarázat az lehet, hogy a gmRPC-k magas hátteret okoznak ebben a vizsgálatban. Fontos, hogy nem volt különbség a kezeletlen, álkezelt, egyszeri gmRPC injekció és az ismételt gmRPC injekció csoport között, ami ismét az antigén visszahívási válaszok hiányát jelezte.

4. ábra: ELISPOT mennyiségi meghatározása gmRPC transzplantációt követően. Az ELISPOT vizsgálatokat a következő csoportok szerint állítottuk be: kontroll, csak válaszadó sejtek (a kísérleti állatok nyaki nyirokcsomóiból (CLN) vagy lépéből (SPL) izolált T-sejteket tartalmazó limfociták vagy lépsejtek; PMA, forbollal kezelt válaszadó sejtek {{1} }mirisztát 13--acetát (PMA) és Ca-ionofor; B6 SPL, válaszadó sejtek keverve C57BL/6 állatokból izolált lépsejtekkel; gmRPC-k, ugyanazok a válaszadó sejtek keverve gmRPC-kkel. (A), A válaszadó sejtek a lépsejtek voltak azokból a kísérleti állatokból, amelyeket a második gmRPC-injekció után a 14. napon leöltek. (B) A válaszadó sejtek a kísérleti állatok CLN-jeinek limfocitái voltak, amelyeket a második gmRPC-injekció után a 14. napon leöltünk. (C) A válaszadó sejtek a kísérleti állatok lépsejtjei voltak, amelyeket a második gmRPC-injekció után a 29. napon leöltünk (D) A válaszadó sejtek a kísérleti állatok CLN-jeinek limfocitái voltak, amelyeket a második gmRPC-injekció után a 29. napon leöltünk. Kétutas ANOVA teszteket használtunk a szignifikancia (*) tesztelésére az ál/sejt és a sejt/sejt csoportok között; p értékek a következők voltak: (A) p < 0,5332, (B) p < 0.0001 (szignifikáns), (C) p < 0,0207 ( szignifikáns), és (D) p < 0,3355.

3. Megbeszélés 

Jelentős érdeklődés mutatkozott az őssejt-technológia iránt, mint a retina degeneratív betegségeinek kezelésében, és csoportunk az allogén hRPC-k RP-ben való alkalmazását vizsgálta. Annak érdekében, hogy adatokat gyűjtsünk az allogén humán RPC termék egynél több adagjának intravitreális injekcióval történő beadása esetén jelentkező lehetséges immunkövetkezményekről, a jelen állatkísérletet C57BL/6 háttérből származó gmRPC-k felhasználásával végeztük graftként és BALB/c egereket gazdaként. Ezeket az eltérő genetikai háttereket használták fel az allogén hRPC-kkel végzett szekvenciális kezelés modellezésére, és előzetes biztonsági adatok biztosítására az embereken végzett tesztelés előtt.

A válaszok teljes kiértékeléséhez a gazdaállatok nem kaptak immunszuppresszív kezelést. Összehasonlítottuk az egyetlen gmRPC injekció által generált immunválaszokat a szekvenciális kétoldali adagolással a leírt injekciós ütemterv szerint. A szemészeti vizsgálatok nem mutattak ki gyulladást vagy más jelentős különbséget az 1 adag gmRPC-t vagy 2 adag gmRPC-t kapó állatcsoportok között, ami arra utal, hogy a recipienseket vagy nem érzékenyítették a kezdeti gmRPC-kezelések, vagy az érzékenység finom volt. Az immunjelölés eredményei azt mutatták, hogy mind az öt vizsgált immunsejttípus, nevezetesen a T-sejtek (CD3), B-sejtek (CD45R), makrofágok (Iba-1), neutrofilek (Ly-6G) és természetes ölősejtek ( CD49b) beszivárgott a szembe, és a transzplantáció utáni RPC graftokat célozta meg. Ennek ellenére ez az infiltráció viszonylag mérsékelt volt, és bár más sejttípusok is kimutathatók voltak, túlnyomórészt Iba-1 pozitív makrofágokból állt. Nagyon korlátozott számú T-sejt, B-sejt, neutrofil és természetes gyilkos sejt volt jelen. Érdekes módon az egyszeri és ismétlődő RPC graftok által kimutatott túlélés ekvivalens volt, mindkét esetben a graftok elvesztése nélkül, a makrofágok jelenléte ellenére. Összességében ez arra utal, hogy mind a veleszületett, mind az adaptív immunválaszok a genetikailag eltérő RPC-kre mérsékeltek voltak, annak ellenére, hogy immunszuppressziót nem alkalmaztak. Ezenkívül az ELISPOT vizsgálati eredmények nem mutattak antigén-visszahívási választ a gmRPC-vel kezelt csoportokban, ami összhangban van azzal az állítással, hogy a T-sejtek nem játszanak fontos szerepet a C57BL/6 egerekből származó gmRPC graftok kilökődésében. Ismét megfigyelték a gmRPC graftok makrofág-infiltrációját, bár ez nem járt együtt a klasszikus immunkilökődéssel összefüggő típusú jelentős graftpusztulással [22–24].

A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert

Ezek a megfigyelések együttesen olyan helyzetet tárnak fel, amely egyértelműen különbözik a széles körben elismert T- és B-sejtek által közvetített allogén transzplantátum kilökődési mechanizmusoktól, amelyek más szövetekben is megfigyelhetők. Több tényező is hozzájárulhat ehhez a helyzethez. Egyrészt létezik a szem mint "immunrendszeri kiváltságos" hely fogalma, még akkor is, ha az üvegtestnek a szaruhártya és a retina hasonló jellemzőinek mértékét kevésbé tanulmányozták, és talán nagyobb a vitatott. Másrészt úgy tűnik, hogy maguk az RPC-k csökkent immunogenitást mutatnak allograftként, összehasonlítva a gyakrabban vizsgált sejttípusokkal. Amint azt korábban bemutattuk, az egér RPC-kből hiányzik az MHC I. és II. osztályú antigének kiindulási expressziója, bár ezek citokin stimulációval indukálhatók. Az MHC-expresszió hiánya hozzájárulhat ezeknek a sejteknek a transzplantáció utáni túléléséhez. Mindazonáltal az immunsejtek jelenléte a graftokban alátámasztja azt az elképzelést, hogy a graft tolerancia ebben a helyzetben nem passzív, és egy aktív immunregulációs jelenség eredménye. Itt hangsúlyozni kell, hogy ugyanaz a fajta immunsejt-infiltráció már egyszeri injekciók után is jelen volt, és nem súlyosbította az ismételt adagolás, ami alátámasztja azt a következtetésünket, hogy a graftok immunsejt-infiltrációja, különösen a makrofágok által, nem a korábbi beavatkozások eredménye. gazdaszervezet szenzibilizációja. E kísérlet paraméterein belül az ismételt adagolás nem csökkenti a graft általános életképességét, ami összhangban volt a terápiás összefüggésekben fennálló tartós hatékonyság lehetőségével. Az alternatív paraméterek, mint például a különböző injekciók közötti intervallumok, növelhetik vagy csökkenthetik az immunsejtek aktivitását olyan mértékben, ami a klinikai alkalmazás szempontjából releváns lenne. Nem világos, hogy az infiltrátumok sejtösszetevői, beleértve a makrofágok túlsúlyát, az emberekre is vonatkoznak-e. Ezen túlmenően ezeknek az allograftoknak a túlélése nem feltétlenül függ a normális retinától, amely egészséges vér-retina gáttal rendelkezik. Az itt használt BALB/c recipiensek albínók és érzékenyek a fénykárosodásra [30]. Sőt, a tartós túlélést többször is megfigyelték a különböző retinadegenerációs modellekkel végzett korábbi munkák során (pl. [31]).

A graft túléléséhez képest a graftokon belüli sejtek életképessége összetettebb helyzetet jelent. Ismert a központi idegrendszeri progenitor sejtek elvesztése, amely gyorsan bekövetkezik a transzplantáció után, valószínűleg több tényező miatt, beleértve a növekedési faktor hirtelen megvonását. Miután megtelepedtek a szemben, a disszociált sejtek gömbszerű aggregátumokká egyesülnek, amelyek központjai a jelek szerint szuboptimális mikrokörnyezetet biztosítanak a növekedéshez, talán a vaszkularizáció hiánya és a tápanyag diffúzióval kapcsolatos kihívások miatt. A makrofágok látszólagos tropizmusa az RPC graftok esetében nem specifikus válasz lehet ezeknek az életképtelen sejteknek a graftok belsejében való jelenlétére, ahol a makrofágok a sejttörmelék megkötőjeként működnek. Alternatív megoldásként a teljesen életképes RPC-k aktívan vonzhatják a makrofágokat, például kemo-vonzó citokinek expressziója révén, ami után a gazdasejtek másodlagosan találkoznának a nem életképes donorsejtek törmelékével. Fontos, hogy az ilyen körülmények között megfigyelt makrofág-infiltráció mértéke úgy tűnik, hogy nincs negatív következménye a graftra vagy a gazda retinájára, ellentétben a sejtes allograftokra adott válaszokkal a nem immunrendszerű privilegizált helyeken [4]. Végül érdemes megemlíteni, hogy az itt közölt eredmények bár egérmodellre korlátozódnak, hatással lehetnek az emberi munkára. Az egérrel ellentétben tudjuk, hogy a tenyésztett humán RPC-k az MHC I. osztályú antigének erőteljes szintjét fejezik ki a kiinduláskor; ezért az összehasonlítás bevallottan kísérleti jellegű. Mindazonáltal érdekes megjegyezni, hogy a szubretinális hRPC graftok egy kínai csoport által végzett klinikai tesztelése [13], valamint csoportunk intravitrealis hRPC-transzplantációja ezt követően az allograftok tartós túlélését mutatta nem immunszupprimált RP-s (JC) betegeknél. -01, [32], nem publikált adatok). Ez a helyzet mindkét szem szekvenciális injekciója után is (JC-01 Extension, nem publikált adatok), hasonlóan az itt bemutatott munkához. Ezen túlmenően a graft túlélése volt megfigyelhető a JC-02 [33] követéses vizsgálatában, amelyben egymást követő ismételt dózisokat adtak ugyanahhoz a szembe [34]. Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy az immunszuppresszió nem mindig szükséges a neurális progenitor transzplantáció hátterében, különösen a szemben, bár ennek a jelenségnek a határait és a mögöttes szabályozó mechanizmusokat még tisztázni kell.

4. Anyagok és módszerek

4.1. Sejtkultúra

Ehhez az allogén vizsgálathoz a korábban jellemzett gmRPC-ket [31] választottuk donorsejteknek. Eredetileg a gmRPC-ket GFP-transzgénikus C57BL/6 egerekből izolálták, amelyeket genetikailag módosítottak, hogy fokozott zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) expresszáljanak. A GFP fehérje expressziója a gmRPC-kben azért volt érdekes, mert lehetővé teszi a graftok láthatóvá tételét az injekció beadása után anélkül, hogy további jelölésre lenne szükség. A jelenlegi vizsgálatban a gmRPC-ket Advanced DMEM/F12-ben tenyésztjük, kiegészítve N-2 kiegészítéssel (1:100, Life Technology, Carlsbad, CA, USA), Glutamax-1 (1:100, Life Technology) , Carlsbad, CA, USA), és EGF (20 ng/ml, rekombináns, Human, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), majd 37 ◦C-on és 5% CO2-on inkubáltuk. A sejteket kevert szuszpenzióban/lazán kapcsolódó telepekben tartottuk bevonat nélküli szövettenyésztő lombikban. A sejteket PBS-ben 1:5 arányban hígított TrypLE Select CTS-sel (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) tripszinezéssel passzáltuk egy percig, és a hozzáadott tripszin térfogatának 10-szeresével semlegesítettük. A sejt-tripszin keveréket 140 g-vel 2 percig szobahőmérsékleten centrifugáltuk, a felülúszót eltávolítottuk, és a sejtpelletet friss tápközegben újraszuszpendáltuk, mielőtt a kívánt koncentrációban szövettenyésztő lombikba oltottuk volna. A sejtkoncentrációt és életképességet tripánkék festéssel határoztuk meg; A számlálásokat Countess (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) és hemocitométerrel végeztük.

Az intravitreális injekciókhoz a sejtüledéket 50K sejt/µl BSS PLUS®-ban újraszuszpendáltuk. A sejtek koncentrációját és életképességét az injekciók előtt és után értékeltük. Az injektált dózis szemenként 50,{2}} sejt volt injekciónként. A dózist és a vivőanyagot korábbi vizsgálataink alapján választottuk ki.

4.2. Kísérleti állatok

A jelenlegi vizsgálat célja az allogén RPC-k ismételt intravitrealis injekciója által kiváltott lehetséges allogén immunválaszok vizsgálata volt. A recipiens állatok BALB/c egerek voltak, amelyek genetikailag különböznek azoktól a C57BL/6 egerektől, amelyektől a gmRPC-ket izolálták. Minden egyes időpontban kezelt kísérleti csoportonként legalább három állat alkalmazását tartották szükségesnek a csoportok közötti statisztikai szignifikancia értékeléséhez az eredményváltozók és a kísérleti időszak alatti lehetséges állatveszteségek tekintetében. Ezen túlmenően, tekintettel a kísérleti eredményt potenciálisan befolyásoló számos további tényezőre, mint például a sikertelen sejtinjektálási eljárás vagy az állatharcok miatti potenciális kopás, csoportonként öt állaton végeztek injekciós eljárást, hogy tovább biztosítsák a statisztikai elemzéshez szükséges minimális számok teljesítését.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Az 1. táblázat bemutatja az állatok négy csoportját, amelyeket mind a négy időpontra (4, 7, 14 és 28 nap) készítettek elő, amikor a kórszövettani értékeléseket, beleértve az immunfluoreszcenciát is, el kell végezni. Két további, 10ˆ6 gmRPC-vel intraperitoneálisan injekciózott állatcsoportot készítettünk pozitív kontrollként mind a két ELISPOT értékelési időpontra (14 és 28 nap). A 2. táblázat az egyes csoportokra tervezett értékeléseket foglalja össze.

1. táblázat Kísérleti csoportok.

2. táblázat: Értékelési időpontok.

4.3. Intravitreális injekció

A gmRPC-ket intravitreális injekcióval adtuk be. Az érzéstelenítés után Mydriacyl-t (1%-os Tropicamide szemészeti oldat) és Phenylephrine-t (2,5%-os szemészeti oldat) alkalmaztunk az injekciózandó állat mindkét szemére. Amikor a megfelelő mydriasis kialakult, az állatot kézzel visszatartották, és az állat fejét elforgatták, hogy az injekciózandó szem okuláris tengelye a sebészeti mikroszkóp optikájához igazodjon, hogy láthatóvá váljon a szem hátsó szegmense (azaz üvegtest és retina). . A szemet finoman kézzel javasolták a szemhéjakra gyakorolt ​​nyomással, és egy inzulinfecskendőn lévő 31G tűvel finoman átszúrták a limbus melletti sclerát az inferior orrnegyedben. A donor sejteket (vagy vivőanyag-kontrollt) tartalmazó csiszolt üveg mikropipetta hegyét a bemetszésen keresztül az üvegtest üregébe vezettük, közvetlen vizualizáció mellett. Ügyeltünk arra, hogy ne sértsük meg a lencse vagy a hátsó szegmens struktúráinak integritását. A sejteket vagy vivőanyagokat önmagukban 1 mikroliter térfogatban injektáltuk. Néhány pillanatnyi szünet után, hogy lehetővé tegyük az intraokuláris nyomás kiegyensúlyozását, a pipetta hegyét fokozatosan eltávolítottuk a szemből, mindezt közvetlen vizualizáció mellett. Bármilyen intraokuláris vérzést észleltek, a lokalizációval együtt. Az injekció beadását követően az állatot egy tiszta ketrecbe helyeztük, amelyet egy friss, eldobható betéttel béleltek ki, abszorbens oldallal felfelé/műanyag oldallal lefelé, hogy felépüljön. A felépülést melegítőpárna segítségével könnyítettük meg, és az állat mozgási képessége alapján igazoltuk. Ébredés után az állatot áthelyezték a posztoperatív ketrecbe, ahol ad libitum hozzáférhetett a vízhez. Az állatokat a műtét után naponta vizuálisan ellenőriztük. Az intraokuláris injekcióval kapcsolatos jelek minimálisak vagy egyáltalán nem voltak megfigyelhetők.

Az eljárást követően az állatokat megfigyelték a műtött szem dörzsölése, felborzolt szőr vagy tartós letargia szempontjából, amelyek mindegyike azonnali eutanáziát jelentett. Két állat vesztette életét a verekedés során szerzett sebek miatt. Az összes többi állatot a tervezett végpontokon leállítottuk. Az eutanáziát CO2 belégzéssel hajtották végre.

4.4. Szemészeti vizsgálat

A Leica Ultimate Red Reflex Surgical Microscope was used for ophthalmic examination and photography of experimental mice. Sedation was performed with a Ketamine Hydrochloride/Xylazine Hydrochloride mixture (50–100 mg/mL Ketamine, 5–10 mg/mL Xylazine) administered by intraperitoneal injection. After sedation, topical mydriatics (Tropicamide, Phenylephrine) were applied to the eye(s) to be imaged in 5 min intervals until adequate mydriasis was achieved, as determined via pupil diameter (>2,5 mm) és a fénystimulációra adott válasz. A pislogás elvesztésének kompenzálására hipromellóz (Gonak) oldatot alkalmaztak lokálisan mindkét szemre, hogy megakadályozzák a szaruhártya kiszáradását. A képalkotó eljáráshoz az érzéstelenített állatokat melegítőpárnára helyeztük, és mellkasi fekvésbe helyeztük. Az eljárás végén az érzéstelenítés részleges megfordítása Atipamezol (0,1-1 mg/kg) intraperitoneális injekcióval történő beadásával történt.

4.5. Szövettan

Két szekvenciális graftot kapott állatok immunválaszait (mindegyik szembe egyet) mindkét szem hisztopatológiájával értékeltük a második szem injekcióját követő 4., 7., 14. és 28. ± 1. napon. Az 1. táblázat szerint kezelt egereket a 2. táblázatban megadott ütemezés szerint leállítottuk. Az állatokat szén-dioxid-inhalációval elaltattuk. A kísérleti állatok szívperfúzióját 2%-os paraformaldehiddel (PFA) foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) végeztük. Ezután az összes szemgolyót összegyűjtöttük, és hagytuk ázni 2% PFA/PBS-ben 48 órán át 4 °C-on. A rögzített szemgolyókat szacharózgradiensen dolgoztuk fel (10% szacharóz PBS-ben 1 órán át szobahőmérsékleten, 20% szacharóz PBS-ben 1 órán keresztül szobahőmérsékleten, és 30% szacharóz PBS-ben 4 °C-on egy éjszakán át), mielőtt beágyazták volna OCT táptalaj kriosekcióhoz. A szemek kriometszeteit (10 µm) Harrison hematoxilinnel és eozinnal (H&E) festettük meg, hogy láthatóvá tegyük a retina mikroanatómiáját és megtaláljuk az injektált donorsejteket.

A gmRPC-vel kezelt csoportok esetében a kriometszeteket immunfluoreszcenciával értékeltük ki GFP+ (donor) sejtekre. A szemekben jelenlévő specifikus immunsejttípusok azonosítását specifikus primer antitestekkel történő jelöléssel végeztük a következőkre: CD3 (T limfocita marker) [35], CD45R (B limfocita marker) [36], Iba-1 (aktivált makrofág és mikroglia marker) [37], Ly-6G (neutrofil marker) [38] és CD49b (természetes ölősejt marker) [39]. A kriometszeteket háromszor mostuk PBS-ben szobahőmérsékleten, és blokkoltuk 0,03% Triton X-100 és 10% normál kecskeszérum PBS-ben (NGS; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) 1 óra szobahőmérsékleten. Patkány egér elleni CD3 (1:100 hígítás, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), patkány egér elleni CD45R (1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), nyúl anti-egér Iba{{ 26}} (1:400 hígítás, Wako Chemicals, Richmond, VA, USA), patkány egér elleni Ly-6G (1:100 hígítás, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) és patkány elleni -egér CD49b-t (1:100 hígítás, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) vittünk fel a mintákra, és egy éjszakán át 4 fokon inkubáltuk. A mintákat újra mostuk PBS-ben szobahőmérsékleten háromszor. Alexa-Fluor-konjugált másodlagos antitesteket (kecske anti-patkány Alexa-Flour-568 és kecske anti-nyúl Alexa-Flour-568, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) alkalmaztunk a mintákon 1 órán keresztül. szobahőmérsékleten. Ezután az összes mintát PBS-ben még háromszor mostuk szobahőmérsékleten. A fedőlemezeket DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) segítségével szereltük fel, és a tárgylemezeket egy éjszakán át szobahőmérsékleten száradni hagytuk.

4.6. ELISPOT és MLR vizsgálatok

Az RPC-specifikus memória T-sejteket az első graft beültetése után 2 és 4 héttel egy enzimhez kötött immunszorbens folt (ELISPOT) vizsgálattal monitoroztuk. A kísérleti csoportokat az 1. és 2. táblázat szerint állítottuk fel minden egyes időpontra. Az ELISPOT assay rögzíti a szekretált fehérjéket egy specifikus antitesttel bevont mikrolemezen, és felhasználható a memória T-sejt aktiválásának meghatározására a T-sejt IFN-szekréció kimutatásával. A kísérleti eredmény a mikrolemezen lévő IFN-foltok száma. A jelenlévő IFN-foltok száma az aktivált T-sejtek számát jelzi. Az alloreaktív T-sejtek gyakoriságát 48 órás kevert leukocita reakcióval (MLR) végeztük 96-lyukú Multiscreen-IP lemezeken (Millipore, Burlington, MA, USA). A válaszadó sejtek nyaki nyirokcsomókból (CLN) és a kísérleti állatok lépéből tisztított T-sejteket tartalmazó limfociták/lépsejtek voltak, a stimulátorsejtek pedig az eredetileg C57BL/6 egerekből származó gmRPC-k voltak. Az ELISPOT vizsgálatokat standard protokoll alapján végeztük. 96-lyuk A Multiscreen-IP lemezeket steril körülmények között előnedvesítettük 15 µl 35%-os etanollal lyukanként. A lemezeket steril PBS-sel háromszor mostuk, mielőtt 100 µl IFN-befogó antitestet (AN-18 klón, eBioscience, San Diego, CA, USA) PBS-ben (2 µg/ml) hígítottunk fel a lemezekre. A lemezeket egy éjszakán át 4 fokon inkubáltuk, mielőtt az MLR vizsgálatokat a lemezekre vittük volna. A befogó antitesttel bevont lemezeket háromszor mostuk PBS-sel, majd blokkoltuk RPMI1640-nel 2 órán át 37 °C-on.

Mindegyik vizsgálólemez a következő kontrollokat tartalmazta: sejteket nem tartalmazó üregek, stimuláció nélkül sejteket tartalmazó üregek, valamint forbol-{0}}mirisztát-13--acetáttal (PMA) kezelt sejteket tartalmazó üregek. és Ca-ionofor pozitív kontrollként. A PMA-kezelés pozitív kontrollként szolgál azáltal, hogy utánozza a második hírvivőt, a DAG-t, aktiválja a T-sejt-receptor útvonalat, és ezáltal T-sejt-aktivációt okoz, a Ca-ionofor pedig megkönnyíti a kalciumionok bejutását a sejtekbe. A lemezeket 36 órán át 37 °C-on inkubáltuk a színreakció előtt. A lemezeket {{10}}.01% Tween 20-at tartalmazó PBS-sel mostuk hatszor, majd 100 µL detektáló antitestet (R64A2 klón, eBioscience, San Diego, CA, USA), hígítva. PBS-ben (0,5 µg/ml) alkalmaztunk minden egyes lyukra. A lemezeket további 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk. A lemezeket ismét mostuk 0,01% Tween 20-nal PBS-ben. Lyukanként 100 µl Streptavidin-AP-t (1:1000 hígítás, Invitrogen) alkalmaztunk, és a lemezeket 45 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Minden lemezt ismét háromszor mostunk 0,01% Tween 20-nal PBS-ben, és csak PBS-sel további háromszor. Végül 100 µl BCIP/NBT-t (Sigma Aldrich, München, Németország) adtunk minden egyes lyukhoz színezés céljából. Minden lemezt alaposan megmostunk csapvízzel, és megszárítottuk az adatok elemzése előtt.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

5. Következtetések

Ez a tanulmány azt mutatja, hogy az allogén RPC-k szekvenciális binokuláris graftjai az üvegtest üregébe nem váltanak ki klasszikus immunkilökődést az egérben. Bár elismert tény, hogy ezeket az allogén szövettani vizsgálatokat nem lehet elvégezni humán RPC klinikai termékkel, az adatok összhangban állnak egy klinikai biztonsági vizsgálat eredményeivel (jCyte, JC-01E, nem publikált adatok), amelyben retinitisben szenvedő betegek vettek részt. pigmentosa nem egyidejű, kétoldali injekciót kapott immunszuppresszív kezelés nélkül. Noha nehéz közvetlenül összehasonlítani a két vizsgálatot, figyelemre méltó, hogy mindkettő általános eredménye hasonlóságot mutatott az allograft túlélés tekintetében.

Hivatkozások

1. Hori, J.; Ng, TF; Shatos, M.; Klassen, H.; Streilein, JW; A fiatal, MJ idegi progenitor sejtek nem rendelkeznek immunogenitással, és allograftként ellenállnak a pusztulásnak. Stem Cells 2003, 21, 405–416. [CrossRef] [PubMed]

2. Klassen, H.; Schwartz, PH; Ziaeian, B.; Nethercott, H.; Young, MJ; Bragadottir, R.; Tullis, GE; Warfvinge, K.; Narfstrom, K. A fejlődő macskaagyból izolált idegi prekurzorok retinális integrációt mutatnak a disztrófiás macska retinájába történő átültetést követően. Állatorvos. Ophthalmol. 2007, 10, 245–253. [CrossRef] [PubMed]

3. Salado-Manzano, C.; Perpina, U.; Straccia, M.; Molina-Ruiz, FJ; Cozzi, E.; Rosser, AE; Canals, JM Az immunológiai válasz szűk keresztmetszetet jelent a neurodegeneratív betegségek sejtterápiájában? Elülső. Sejt Neurosci. 2020, 14, 250. [CrossRef]

4. Petrus-Reurer, S.; Romano, M.; Howlett, S.; Jones, JL; Lombardi, G.; Saeb-Parsy, K. Immunológiai megfontolások és kihívások a regeneratív sejtterápiákban. Commun. Biol. 2021, 4, 798. [CrossRef]

5. Bucher, K.; Rodriguez-Bocanegra, E.; Dauletbekov, D.; Fischer, MD Immunreakciók a retina génterápiájára ade no asszociált vírusvektorok használatával – A kezelés sikerének és biztonságának következményei. Prog. Retin. Eye Res. 2021, 83, 100915. [CrossRef]

6. Singh, MS; Park, SS; Albini, TA; Canto-Soler, MV; Klassen, H.; MacLaren, RE; Takahashi, M.; Nagiel, A.; Schwartz, SD; Bharti, K. Retina őssejt-transzplantáció: A biztonság és a potenciál egyensúlya. Prog. Retin. Eye Res. 2020, 75, 100779. [CrossRef]

7. Kamao, H.; Mandai, M.; Okamoto, S.; Sakai, N.; Suga, A.; Sugita, S.; Kiryu, J.; Takahashi, M. Humán indukált pluripotens őssejtből származó retina pigment epithelium sejtlapok jellemzése klinikai alkalmazásra. Stem Cell Rep. 2014, 2, 205–218. [CrossRef]

8. Sugita, S.; Kamao, H.; Iwasaki, Y.; Okamoto, S.; Hashiguchi, T.; Iseki, K.; Hayashi, N.; Mandai, M.; Takahashi, M. A T-sejt aktiválásának gátlása indukált pluripotens őssejtekből származó retina pigment epiteliális sejtekkel. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 2015, 56, 1051–1062. [CrossRef]

9. McGill, TJ; Stoddard, J.; Renner, LM; Messaoudi, I.; Bharti, K.; Mitalipov, S.; Lauer, A.; Wilson, DJ; Neuringer, M. Allogén iPSC-eredetű RPE sejtgraft-hiba a szubretinális térbe történő átültetést követően főemlősökben. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 2018, 59, 1374–1383. [CrossRef]

10. Sugita, S.; Mandai, M.; Kamao, H.; Takahashi, M. Az RPE sejttranszplantáció immunológiai vonatkozásai. Prog. Retin. Eye Res. 2021, 84, 100950. [CrossRef]

11. Nair, DSR; Thomas, BB Őssejt-alapú kezelési stratégiák a retina degeneratív betegségeihez. Curr. Stem Cell Res. Ott. 2022, 17, 214–225. [CrossRef] [PubMed]

12. Martinez Velazquez, LA; Ballios, BG Az öröklött retinabetegségek molekuláris és sejtterápiájának következő generációja. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11542. [CrossRef]

13. Liu, Y.; Chen, SJ; Li, SY; Qu, LH; Meng, XH; Wang, Y.; Xu, HW; Liang, ZQ; Yin, ZQ Humán retina progenitor sejt transzplantáció hosszú távú biztonsága retinitis pigmentosa betegekben. Stem Cell Res. Ott. 2017, 8, 209. [CrossRef] [PubMed]

14. Wang, Y.; Tang, Z.; Gu, P. Stem/progenitor sejt alapú transzplantáció retina degenerációra: A klinikai vizsgálatok áttekintése. Cell Death Dis. 2020, 11, 793. [CrossRef] [PubMed]

15. német, OL; Vallese-Maurizi, H.; Soto, TB; Rotstein, NP; Politi, LE Retina őssejtek, remények és akadályok. World J. Stem Cells 2021, 13, 1446–1479. [CrossRef]

16. Karamali, F.; Behtaj, S.; Babaei-Abraki, S.; Hadady, H.; Atefi, A.; Savoj, S.; Soroushzadeh, S.; Najafian, S.; Nasr Esfahani, MH; Klassen, H. Potenciális terápiás stratégiák fotoreceptor-degenerációhoz: A látás helyreállításának útja. J. Transl. Med. 2022, 20, 572. [CrossRef]

17. Semo, M.; Haamedi, N.; Stevanato, L.; Carter, D.; Brooke, G.; Young, M.; Coffey, P.; Sinden, J.; Patel, S.; Vugler, A. Az emberi retinális progenitor sejtek hatékonysága és biztonsága. Ford. Vis. Sci. Technol. 2016, 5, 6. [CrossRef]

18. Mochizuki, M.; Sugita, S.; Kamoi, K. A szem immunológiai homeosztázisa. Prog. Retin. Eye Res. 2013, 33, 10–27. [CrossRef]

19. Yamasaki, S.; Sugita, S.; Horiuchi, M.; Masuda, T.; Fujii, S.; Makabe, K.; Kawasaki, A.; Hayashi, T.; Kuvahara, A.; Kishino, A.; et al. Az emberi ESC- és iPSC-eredetű retinák alacsony immunogenitása és immunszuppresszív tulajdonságai. Stem Cell Rep. 2021, 16, 851–867. [CrossRef]

20. Klassen, H.; Schwartz, MR; Bailey, AH; A multipotens humán és egér idegi progenitor sejtek által expresszált fiatal, MJ felszíni markerek közé tartoznak a tetraspaninok és a nem fehérje epitópok. Neurosci. Lett. 2001, 312, 180–182. [CrossRef]

21. Klassen, H.; Ziaeian, B.; Kirov, II; Young, MJ; Schwartz, PH Retina progenitor sejtek izolálása poszt mortem emberi szövetből és összehasonlítása autológ agyi progenitorokkal. J. Neurosci. Res. 2004, 77, 334–343. [CrossRef]

22. Ingulli, E. A sejtkilökődés mechanizmusa transzplantációban. Pediatr. Nephrol. 2010, 25, 61–74. [CrossRef]

23. Issa, F.; Schiopu, A.; Wood, KJ A T-sejtek szerepe a graft kilökődésben és a transzplantációs toleranciában. Expert Rev. Clin. Immunol. 2010, 6, 155–169. [CrossRef] [PubMed]

24. Nasr, M.; Sigdel, T.; Sarwal, M. Előrelépések a transzplantációs kilökődés diagnosztikájában. Szakértő Rev. Mol. Diagn. 2016, 16, 1121–1132. [CrossRef] [PubMed]

25. Klassen, H.; Imfeld, KL; Ray, J.; Young, MJ; Gage, FH; Berman, MA A felnőtt hippocampális progenitor sejtek immunológiai tulajdonságai. Vis. Res. 2003, 43, 947–956. [CrossRef] [PubMed]

26. Weinger, JG; Weist, BM; Fásott, WC; Klaus, SM; Walsh, CM; A Lane, TE MHC eltérése neurális progenitor sejt kilökődést eredményez gerincvelő-transzplantációt követően a vírus által kiváltott demyelinizáció modelljében. Stem Cells 2012, 30, 2584–2595. [CrossRef] [PubMed]

27. ReNeuron, L. First-in-human Phase I/IIa, Open-label, Prospektív tanulmány a szubretinálisan transzplantált humán retinális progenitor sejtek (hRPC) biztonságosságáról és tolerálhatóságáról Retinitis Pigmentosa (RP) betegeknél. Klinikai vizsgálat száma: NCT02464436. Elérhető online: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02464436 (Hozzáférés: 2023. február 27.).

28. Lu, B.; Lin, Y.; Tsai, Y.; Girman, S.; Adamus, G.; Jones, MK; Shelley, B.; Svendsen, CN; Wang, S. A degenerált retinába történő későbbi humán idegi progenitor transzplantáció nem veszélyezteti a graft kezdeti túlélését vagy a terápiás hatékonyságot. Ford. Vis. Sci. Technol. 2015, 4, 7. [CrossRef] [PubMed]

29. Jones, MK; Lu, B.; Girman, S.; Wang, S. Sejtalapú terápiás stratégiák a retina degeneratív betegségeinek pótlására és megőrzésére. Prog. Retin. Eye Res. 2017, 58, 1–27. [CrossRef] [PubMed]

30. Bell, BA; Kaul, C.; Bonilha, VL; Rayborn, ME; Shadrach, K.; Hollyfield, JG A BALB/c egér: A standard vivárium világítás hatása a retina patológiájára az öregedés során. Exp. Eye Res. 2015, 135, 192–205. [CrossRef]

31. Klassen, HJ; Ng, TF; Kurimoto, Y.; Kirov, I.; Shatos, M.; Coffey, P.; A fiatal, MJ Multipotens retina progenitorok fejlődési markereket fejeznek ki, retinális neuronokká differenciálódnak, és megőrzik a fény által közvetített viselkedést. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004, 45, 4167–4173. [CrossRef]

32. jCyte, Inc. Humán retinális progenitor sejtek (jCell) egyszeri intravitreális injekciójának biztonsága Retinitis Pigmentosa esetén. Klinikai vizsgálat száma NCT02320812. Elérhető online: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02320812 (Hozzáférés: 2023. február 24.).

33. jCyte, Inc. Humán retinális progenitor sejtek intravitreális injekciójának biztonságossága és hatékonysága retinitis Pigmentosa-ban szenvedő felnőtteknél. Klinikai vizsgálat száma: NCT03073733. Elérhető online: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03073733 (Hozzáférés: 2023. február 24.).

34. jCyte, Inc. Humán retinális progenitor sejtek (sejt) ismételt intravitreális injekciójának biztonsága Retinitis Pigmentosa-ban szenvedő felnőtt egyénekben. Klinikai vizsgálat száma: NCT04604899. Elérhető online: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04604899 (Hozzáférés: 2023. február 24.).

35. Oudejans, JJ; van der Valk, P. T sejt és NK sejt neoplazmák immunhisztokémiai osztályozása. J. Clin. Pathol. 2002, 55, 892. [CrossRef] [PubMed]

36. Tostanoski, LH; Chiu, YC; Gammon, JM; Simon, T.; Andorko, JI; Bromberg, JS; Jewell, CM A helyi nyirokcsomók mikrokörnyezetének újraprogramozása elősegíti a szisztémás és antigénspecifikus toleranciát. Cell Rep. 2016, 16, 2940–2952. [CrossRef] [PubMed]

37. Jurga, AM; Paleczna, M.; Kuter, KZ A differenciális mikroglia fenotípusok általános és megkülönböztető markereinek áttekintése. Elülső. Sejt Neurosci. 2020, 14, 198. [CrossRef] [PubMed]

38. Li, JC; Zou, XM; Yang, SF; Jin, JQ; Zhu, L.; Li, CJ; Yang, H.; Zhang, AG; Zhao, TQ; Chen, CY A neutrofil extracelluláris csapdák részt vesznek a rákkal összefüggő trombózis kialakulásában gyomorrákos betegeknél. World J. Gastroenterol. 2022, 28, 3132–3149. [CrossRef]

39. Kee, BL Természetes ölősejtek fejlesztése és ILC1. Encycl. Immunobiol. 2016, 1, 140–148.