Immunmoduláló faktorok a Cistanche Salsában

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Shinjiro MARUYAMA", Koji YAMADA, Hirofumi TACHIBANA

Cistanche salsa(CAMever) G.Beck, Az Orobanchaceae egy parazita növény, amelyet Japánban keleti gyógyhatású tonikként használnak. Korábbi vizsgálatunkban azt találtuk, hogy a C, salsa kivonat fokozta mind az IgM, mind az IgG termelődését a humán Ivmph node limfocitákban. Továbbá, a C, salsa dializátum (CSD), amelyet dialízis membránnal készítettek a3.{1}}Da molekulatömeg határértéke fokozta az IgM termelést a BALL humán B-sejtvonalban-1; emellett enyhe sejtproliferációt is indukált. Ezzel szemben azonban a CSD növekedésgátlást indukált, amit apoptózis kísért a Namalwa humán Burkitt limfóma sejtvonalban. Ezek az eredmények a limfocitákra specifikus aktív összetevők lehetséges jelenlétét jelzik a CSD-ben. Eddig ezeknek az összetevőknek a kémiai tulajdonságait nem sikerült tisztázni. Ebben a tanulmányban a CSD aktív összetevőinek kémiai tulajdonságait vizsgáltuk. A B-sejtvonalakban mindkét fent említett aktivitást nem inaktiválta a CSD autokláv kezelése. Gélszűrős oszlopkromatográfiával azt találtuk, hogy az aktív frakciók csúcsai különböző frakciókban koncentrálódtak. Eredményeink azt sugallják, hogy a CSD-ben legalább 2 típusú aktív összetevő található, és ezek poliszacharidok lehetnek, mivel vízben oldódó, nagy molekulatömegű összetevők és hőstabilak.

Kulcsszavak: Cistanche salsa, nagy molekulatömegű, IgM, növekedésgátlás.

Bevezetés

Cistanche salsa(CA Meyer) G.Beck, Az Orobanchaceae egy parazita növény, amelyet Japánban keleti gyógyhatású tonikként használnak. Kínában ez a növény fontos hagyományos gyógyszer a veseelégtelenség és a neuraszténia kezelésére. In vitro vizsgálatok során már beszámoltunk a C. salsa immunrendszerre gyakorolt ​​hatásairól. Első. kimutattuk, hogy a C. salsa kivonat fokozza az IgM és IgG termelődését humán nyirokcsomó limfocitákban. Másodszor, kimutattuk, hogy a 3,500-Da molekulatömegű cut-off dialízis mem-brán segítségével előállított C. salsa dializátum (CSD) fokozta az IgM termelést a BALL humán B-sejtvonalban-1; emellett kis mértékben sejtproliferációt is indukált.2 Ezenkívül a CSD ellentétes hatást fejt ki, mivel apoptózissal kísért növekedésgátlást vált ki a humán Burkitt limfóma sejtvonalban, a Namalwa-ban.3) Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a CSD ezen hatása összefügg a a B-sejtek aktiválódása, míg az apoptózis a B-sejt differenciálódáshoz szükséges egyéb jelek, például citokinek és sejt-sejt kontaktus hiánya miatt következett be; azonban a CSD kémiai tulajdonságait egyik korábbi tanulmány sem tisztázta. Ezért ebben a tanulmányban a CSD aktív összetevőinek kémiai tulajdonságait vizsgáltuk.

Anyagok és metódusok

A CSD-t ugyanezzel a módszerrel állítottuk elő korábbi tanulmányunkban. A CSD-t foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) oldottuk fel 20 mg/ml koncentrációban. Az elkészített oldatot (0,8 ml) egy szűrőn (0,22 um) engedtük át a felhordás előtt, majd ugyanazzal az oldattal eluáltuk TOYOPEARL HW-40F-et tartalmazó oszlopokon keresztül. (1.0×96,5 cm; Tosoh Corp, Japán), TOYOPEARL HW-55F(1.0 × 98.0 cm; Tosoh Corp., Japán) és Sephacryl S-400HR(1.0×98,0 cm; GE Healthcare UK Ltd., Anglia); és 1 ml-es (30 csepp) frakciókat gyűjtünk össze. A gélek hézagtérfogatának és a frakcionált alkotórészek hozzávetőleges molekulatömegének (MW) meghatározásához kék dextrán (BD) (Sigma-Aldrich Japan KK, Japán); és a Leuconostoc spp.-től (Sigma-Aldrich Japan KK, Japán) beszerzett ismert molekulatömegű dextránok, azaz MW2, 000kDa(D1), 500 kDa(D2), 70 kDa (D3) és 6 kDa (D4); és cianokobalamint (VB12, MW:1355.4) (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japán) használtunk. Az egyes frakciók összcukor- és fehérjetartalmát fenol-kénsav módszerrel, illetve Lowry módszerrel határoztuk meg a PIERCETM bicinchoninic acids (BCA) protein assay kittel (Thermo Fisher Scientific Inc., USA). Standardként glükózt és szarvasmarha-szérumalbumint használtunk. Továbbá megmértük az egyes frakciók abszorbanciáját 320 nm-en (A:2o). A kék dextrán és a cianokobalamin elúciós csúcsait a 260 nm-en mért abszorbancia értékük alapján határoztuk meg, az ismert molekulatömegű dextránok csúcsait pedig fenol-kénsav módszerrel határoztuk meg. A CSD-t 120 fokon 20 percig autoklávoztuk a termostabilitás megállapítására. A bioassay során a sejttenyésztést és az IgM mérését ugyanazzal a módszerrel végeztük, mint előző vizsgálatunkban.

Cistanche salsa kivonat

Eredmények és megbeszélés

Az 1. ábra a CSD gélszűrős oszlopkromatogramjait mutatja HW-40F-en. Az la ábrán látható, hogy a D4 dextrán marker alapján az aktív összetevők molekulatömegét több mint 6 kDa-ra becsülték. Ezenkívül a CSD-aktivitások, azaz az IgM-termelés fokozása és a növekedésgátlás indukálása sem inaktiválódtak az autoklávban végzett kezelés hatására (2. ábra), bár egyes összetevők aggregálódnak és elvesztek, miután a CSD áthaladt a 0-on.{{6} }um szűrőt. A CSD és az autoklávozott CSD elúciós mintázata majdnem azonos volt, azonban az IgM termelést fokozó relatív aktivitása az autoklávozott CSD-ben alacsonyabb volt, mint a nem kezelt CSD-ben. Néhány ok úgy tűnik, hogy az aggregátumok tartalmazták az aktív összetevőket, vagy az aktív összetevők egy része inaktiválódott. A HW-55F kromatográfiás eredményei kétféle immunmoduláló faktor lehetséges jelenlétét mutatták ki: az első, a fr. sz.32. egy nagy molekulatömegű aktív alkotórész (HCS), amely fokozni tudta az IgM termelést, míg a második, a fr. No.50, egy közepes molekulatömegű aktív alkotórész (MCS), amely gátolni tudta a sejtproliferációt (3. ábra). Azonban mind a HCS, mind az MCS (fr.no.32 és 50) csúcsai nem voltak olyan élesek, mint az ismert molekulatömegű dextránoké (az adatokat nem mutatjuk be). Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy lehetnek a CSD előállítása során mesterségesen előállított melléktermékek, könnyen roncsolható és több egységből álló aktív összetevők polimerei, vagy különböző, eltérő eredeti MW-vel rendelkező aktív összetevők. A kromatogramokon látható elúciós mintázatok azt mutatják, hogy nem könnyű tiszta összetevőket előállítani HCS-ből és MCS-ből, mivel úgy tűnik, hogy vannak olyan összetevők, amelyeknek molekulatömege kissé eltérő, amint azt fentebb említettük. Bár mindkettő aktív összetevők keveréke, úgy tűnik, hogy a HCS 70 kDa-t meghaladó, míg az MCS 6 kDa-t meghaladó MW-os összetevőket tartalmaz. A HCS a HW-55F-en eluálódott egy olyan frakcióban, amely az elválasztási tartományon kívül volt. A Sephacryl-S400.-on a HCS egy része (fr.no.36) eluálódott ugyanabban a frakcióban, mint a D1 marker, amelynek molekulatömege 2, 000 kDa (4. ábra). Általában a poliszacharidokat és a fehérjéket vízoldható, nagy molekulatömegű összetevőként veszik figyelembe a növényi kivonatokban. Mivel szinte minden funkcionális fehérjét inaktiválnak hőkezeléssel, úgy tűnik, hogy poliszacharidok. Azonban Park et. al. beszámoltak a viszkotoxin nevű, hőstabil citotoxikus kis fehérjéről, amelyet fagyöngy (Viscum album L., Viscaceae) kivonatból állítanak elő.4 Ezenkívül kimutatták, hogy a viszkotoxinok fokozzák az emberi természetes ölősejtek immunmoduláló aktivitását.5 A 3. ábrán az MCS, amely kisebb MW, magasabb fehérjetartalmat mutat. Figyelembe véve ezeket a tényeket, az MCS lehet fehérjéhez kötött poliszacharid8 vagy lehet hőstabil fehérje, mint a viszkotoxinok. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a két aktív alkotórész lehet poliszacharid. Ellenkező esetben az MCS hőstabil fehérjék lehetnek.

Hivatkozások

1) Deng, M., Zhao, JY, Ju, XD, Tu, PF, Jiang, Y., Li, ZB: Protective effect of tubuloside B on TNF alfa-induced apoptosis in neuron cells.Acta Pharmacol. Sin.,25, 1276-1284,2004.

2) Maruyama, S., Yamada, K., Tachibana, H.:Cistanche salsa kivonatfokozott IgM-termelés a humán B-sejtvonalban, BALL{0}}.J. Trad. Med., 24, 209-211, 2007.

3) Maruyama, S., Yamada, K., Tachibana, H:Cistanche salsakivonat apoptózist indukált a Namalwa humán Burkitt limfóma sejtvonalban. J.Trad. Med., 25, 24-27, 2008.

4) Park. JH, Hyun, CK, Shin HK: A komponensek citotoxikus hatásai hőkezelt fagyöngyben (Viscum album). Cancer Let, 139, 207-213, 1999.

5) Tabasco, J., Pont, F, Fournic, JJ, Vercellone, A.: A fagyöngy viszkotoxinjai növelik a természetes ölősejtek által közvetített citotoxicitást. Eur.J. Biochem., 269, 2591-2600, 2002.

6) Fisher, M., Yang, LX: A poliszacharid-K (PSK) rákellenes hatásai és mechanizmusai: a rák immunterápia hatásai. Anticancer Res., 22, 1737-1754, 2002.

cistanche kiegészítők