A Cistanche Deserticola vízzel extrahálható poliszacharidjainak immunstimuláló hatása növényi adjuvánsként in vitro és in vivo

Bevezetés

A védőoltások fontosak a betegségek leküzdésében vagy megelőzésében. Az újonnan előállított és jelenleg fejlesztés alatt álló vakcinák nagy tisztaságú, nagyobb biztonságú rekombináns antigének, de a tisztított antigének nem képesek kielégítő immunválaszt stimulálni, mint az attenuált vagy inaktivált kórokozókészítmények. Adjuvánsok segítségével a vakcinák tartós immunválaszt válthatnak ki [1,2]. Az új, erős adjuvánsok széles körben érintettek mindkét vakcinábanfejlődés és az emberi egészség. A mai napig különféle adjuvánsokat azonosítottak és alaposan tanulmányoztak. Ezek az adjuvánsok számos előnnyel ruházzák fel a vakcinákat, többek között csökkentik az antigének szükséges mennyiségét, minimalizálják a normál immunválaszokhoz szükséges immunizálások számát, és gyorsabb, szélesebb körű és erősebb immunválaszokat indukálnak.3–5]. Bár sok erős adjuvánst fejlesztettek ki, mint például a lipopoliszacharidot (LPS) és a Freund-féle komplett adjuvánst (FCA), toxicitásuk miatt nem alkalmazzák őket széles körben. Ezért csak néhány adjuváns, mint például az Alum, engedélyezett klinikai használatra [6]. Összességében hatékonyabb és biztonságosabb adjuvánsokat kell kifejleszteni a fertőző és nem fertőző betegségek elleni jobb profilaktikus és terápiás vakcinák előmozdítása érdekében.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA AZ IMUNITÁS ERŐSÍTÉSÉHEZ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

A biztonság fontos szempont az adjuvánsok fejlesztésénél. A kínai lágyszárú összetevők közé tartoznak a tápanyagok és fontos aktív kompozitok, például fenolos vegyületek és poliszacharidok, amelyek erős immunstimulánsként működhetnek [7–9]. Közülük a hagyományos kínai gyógynövényekből származó poliszacharidokat széles körben kutatták immunstimuláló hatásuk és alacsony toxicitásuk miatt. Például az inulin egy immunadjuváns, anélkül, hogy más adjuvánsok, például az FCA toxicitása lenne. Az AdvaxTM delta inulin adjuváns sikeresen fokozta a vakcina immunogenitását is [10,11]. Az Astragalus, más néven Huangqi kínaiul és Radix Astragali latinul, széles körben elterjedt az egész világon. A poliszacharid az egyik fő hatóanyaga, amely az immunmoduláló aktivitásért felelős. Kísérleti vizsgálatok kimutatták, hogy az Astragalus poliszacharid erős immunmoduláló hatással rendelkezik mind in vitro, mind in vivo [12, 13]. A Lycium barbarum poliszacharidok vakcina adjuvánsként szintén jó javulást és stimuláló hatást mutattak [14, 15]. Ezek a vizsgálatok azt sugallták, hogy a kínai növényi poliszacharidok ideális jelöltek az adjuváns fejlesztéshez.

Cistanche deserticolaA YC Ma (CD, kínaiul "Rou Cong Rong") egy értékes hagyományos kínai gyógynövény, amelyet kiváló tonizáló hatása miatt általában "a sivatagok ginzengének" neveznek. Hszincsiang száraz vagy félszáraz régióiban elterjedt. Kínában szárított, húsos szárát több száz éve használják tonizáló táplálékként [16, 17]. A főtt CD-t hosszú évek óta használják tonizáló táplálékként a túlterhelés okozta károsodások kezelésére, ami arra utal, hogy orális adagolás esetén biztonságos. Ezt a növényt széles körű gyógyászati ​​​​funkciói miatt széles körben tartják számon. A közelmúltban végzett fitokémiai és farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a poliszacharidok a fő biológiailag aktív komponensek, és különféle biológiai hatásokkal bírnak, pl.immunmoduláló hatás, antioxidáns hatás és gyulladáscsökkentő hatás[18–21]. A C. deserticola-ból származó vízzel extrahálható poliszacharidok immunerősítő aktivitásáról azonban ritkán számoltak be Hszincsiangban.

Köztudott, hogy a DC-k fontos antigén-prezentáló sejtek (APC), amelyek az immunválasz elindításához és a veleszületett és adaptív sejtek modulálásához szükséges jeleket biztosítanak. Egyes adjuvánsok, amelyek javítják a DC-k antigénfelvételét, növelhetik a kostimuláló vagy MHC-molekulákat, ésfokozza az immunitást. Amikor elkezdődik a DC-k érése, több kostimuláló molekula és citokin termelődik, és a DC-k eltérő fenotípusokat mutatnak [22, 23].

Ebben a tanulmányban először azt vizsgáltuk, hogy a WPCD elősegítheti-e a DC-k aktiválását a TLR4 jelátviteli útvonalon keresztül in vivo. Mivel a DC-k voltak a kapcsolat a veleszületett és az adaptív immunválaszok között, feltételeztük, hogy a WPCD által stimulált DC-k aktiválása befolyásolja az adaptív immunitás kimenetelét. Megvizsgáltuk az ovalbuminra (OVA) adott specifikus immunválaszt WPCD-vel kezelt egerekben, beleértve az IgG, IgG1 és IgG2a alosztály titereit, a T- és B-proliferációt, valamint a citokintermelést. Megvizsgáltuk, hogy a WPCD-kezelés növelné-e a DC-k és a Treg-sejtek aktivitását ezen egerek lépében. Eredményeink igazolták a C. deserticola természetes poliszacharidjainak potenciális immunmoduláló hatását, és kiterjesztették alkalmazási körét.

Anyagok és metódusok

Állatok

Nyolc-tíz hetes C57BL/6, BALB/c vagy ICR nőstény egereket a Xinjiang Medical University (Urimuqi, Xinjiang, Kína) Első Kórházától vásároltunk. Az egereket kórokozómentes körülmények között tartottuk a Xinjiang Egyetem Állategészségügyi és Jóléti Egyetem Állatgondozási és Felhasználási Bizottságának (ACUC) irányelveinek megfelelően. Az állatkísérleti eljárásokat a Xinjiang Egyetem AUCC hagyta jóvá.

Vizes kivonatok kinyerése

A C. deserticola egy növény Kínában, Hszincsiang tartományban. A nyers poliszacharidot vizes extrakcióval és etanolos kicsapással kaptuk. Röviden, 100 g szárított C. deserticolát porrá őröltünk, majd leszűrtünk. A port petroléterrel szobahőmérsékleten többször visszafolyató hűtő alatt forraljuk, majd vízmentes etanollal 1 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk, hogy eltávolítsuk a színes összetevőket és a lipideket. A maradékokat forrásban lévő vízzel háromszor extraháltuk, és az extraktumokat egyesítettük, 4000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 10 percig, és 60 °C-on 4 órán át visszafolyató hűtő alatt forraltuk. Az oldathoz négyszeres térfogatú 95%-os etanolt adunk a nyers poliszacharidok kicsapása céljából. A nyers poliszacharidokat újra feloldottuk desztillált vízben, és Sevage reagenssel kezeltük a fehérjék eltávolítására. A kivonatokat PBS-ben oldottuk, és 022- μm-es szűrőn keresztül sterilizáltuk. Végül a WPCD teljes cukortartalma 59,58% volt, amint azt a fenol-kénsav analízis mutatta [24].

DC-k generálása

A BM-DC-ket a korábban leírt módszer szerint állítottuk elő, kis módosításokkal [25]. A C57BL/6 egerekből származó csontvelői DC-ket 10% magzati borjúszérummal (Hyclone) kiegészített RPMI-1640 komplett tápközeggel (Gibco) öblítettük ki. Az összegyűjtött sejteket 50 μM-merkaptoetanolt (Sigma, St Louis, MO) és 20 ng/ml egér GM-CSF-et (Peprotech, Rocky Hill, NY) tartalmazó RPMI{7}} tápközegben újraszuszpendáltuk, és 37 °C-on inkubáltuk. C 5% CO2 atmoszférában. A táptalaj felét 1-2 naponta friss, GM-CSF-et tartalmazó táptalajra cseréltük. A sejteket a 6. napon összegyűjtöttük, különböző dózisú WPCD-vel és LPS-sel (100 ng/ml) (Sigma, St Louis, MO) kezeltük 24 órán keresztül, majd áramlási citometriával értékeltük.

DC-k érésének és T-sejt aktiválódásának kimutatása in vitro

A WPCD BM-DC-kre gyakorolt ​​in vitro érési hatását FAC-ok fenotípusos analízisének eredményei alapján értékeltük. A 7. napon a C57BL/6-ból származó BM–DC-ket GM-CSF jelenlétében indukáltuk, majd különböző koncentrációjú WPCD-vel kezelték (0.01, 0.{{ 11}}2, 0,05, 0,1 és 0,2 mg/ml) 12 órán keresztül három párhuzamosban. LPS-t (100 ng/ml) használtunk pozitív kontrollként. Miután a BM-DC-ket PBS-ben mostuk, és Fc Block-ot (BD Biosciences, CA) alkalmaztunk a nem specifikus antitestkötés megakadályozására, a sejteket PBS-ben festettük meg megfelelő FITC-, PE- vagy APC-konjugált CD40, CD11c, CD{ {23}}, CD80 és MHC-II antitestek (BD) 20 percig 37 ˚C-on. A megfestett sejteket FACs Calibur (BD) detektáltuk. Az adatok elemzése FlowJo szoftverrel (Tree Star) történt.

A DC-k in vitro érési kísérletében sejttenyészet-felülúszókat is gyűjtöttünk az IL-12 és a TNF- elemzésére citokin tesztkészletek (Boster, Wuhan, Kína) segítségével a gyártó utasításai szerint. Az abszorbanciát 450 nm-en ELISA lemezleolvasóval (Bio-Rad, USA) mértük. A mintákban lévő citokin mennyiségeket a rekombináns citokinek standard görbéivel számítottuk ki regressziós lineáris módszerrel.

Allogén stimuláló aktivitásuk tesztelésére a kevert limfocita reakció (MLR) kísérletét végeztük az előző módszer szerint [26] MTT (Sigma, St Louis, MO) assay segítségével. Röviden, a stimulátorsejtekként használt C57BL/6 egerekből származó BM-DC-ket a 7. napon RPMI-1640 tápközegben és GM-CSF-ben kinyertük, és különböző koncentrációjú WPCD-vel kezeltük 12 órán keresztül 37 °C-on. A sejteket mostuk, és RPMI{10}} tápközegben újraszuszpendáltuk, mielőtt a 24-lyuklemezre szélesztettük. Az egyplenocita szuszpenzióra reagáló sejteket BALB/c egerekből izoláltuk. A BM-DC-ket lépsejtekkel kevertük 1:5 és 1:10 arányban. A sejteket 37 °C-on tenyésztettük 5% CO2 atmoszférában három napig, három párhuzamosban. Pozitív kontrollként LPS-kezelést alkalmaztunk. Ezt követően a tenyészetekhez 20 μL MTT-t adtunk az utolsó 4-órás tenyésztéshez. A mérési hullámhosszon (490 nm) és a referencia hullámhosszon (650 nm) mértük az abszorbanciákat a T-sejt proliferációs analízishez. Minden mintát háttérkontrollhoz mértünk.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA AZ IMMUNRENDSZER FEJLESZTÉSÉHEZ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kezelés TLR4 inhibitorral in vitro

A BM-DC-ket 5 μM TAK-242-dal (TLR4 inhibitor, Medchemexpress Inc. USA) előkezeltük 1 órán át, majd különböző koncentrációjú WPCD-vel (100 és 200 ug/ml) együtt tenyésztettük 12 órán keresztül. a Golgi Stop jelenlétében vagy hiányában három példányban. A pozitív kontrollhoz LPS-t adtunk. A sejteket és a felülúszókat a CD86 és a CD40 felszíni markerek, valamint a TNF-a és az IL-12 citokinek elemzéséhez ELISA-val detektáltuk.

Immunizációs protokoll

Akut toxicitási teszt

Ebben a vizsgálatban az orális akut toxicitási tesztben 4 0 egészséges felnőtt ICR egeret használtak. Az ICR egereket egy éjszakán át éheztettük (ételt, de nem vizet) az adagolás előtt. A WPCD-t orálisan adtuk be 0, 50, 500 vagy 5000 mg/ttkg dózisban minden állatnak 7 napon keresztül. Sóoldattal és timsóval kezelt egerek kerültek a kontrollcsoportba. Az állatokat naponta megfigyeltük 14 egymást követő napon. Az egereket egyenként figyelték meg, hogy rögzítsék a mortalitást és a klinikai tüneteket. Ezenkívül a testsúlyt, valamint az élelmiszer- és vízfogyasztást mérték a kísérlet során. A 14. napon a lép vagy csecsemőmirigy indexét a következőképpen számítottuk ki: (lép vagy csecsemőmirigy tömege/testtömeg) × 10.

A WPCD immunmoduláló aktivitás kimutatása in vivo.

Annak vizsgálatára, hogy a WPCD-nek van-e immunmoduláló hatása, ovalbumint (OVA) (Sigma) használtak modellantigénként, és a nőstény ICR egereket véletlenszerűen 7 csoportra osztották (negatív kontrollcsoport (0,9% NaCl és WPCD 400 ug). ) és a pozitív kontroll (200 ug timsó OVA-val)). Az egereknek kétszer szubkután, 10 ug OVA-val önmagában vagy WPCD-vel OVA-val 20, 100 vagy 400 ug dózisban, 2-hetes időközönként. Az emlékeztető oltás után vérmintákat és lépet vettünk az IgG titerek, az IgG alosztályok, a lépsejtek proliferációja és a citokin, a DCs felszíni markerek és a Treg gyakoriság kimutatására.

OVA-specifikus antitestek kimutatása

Az OVA-specifikus IgG titereket és alosztályokat ELISA-val vizsgáltuk az előző módszer szerint [27]. Az ELISA lemezeket (Nunc, Thermo Fisher Scientific) egy éjszakán át bevontuk, majd blokkoltuk. A szérummintákat sorozathígítottuk az IgG titer elemzéséhez vagy az IgG1 és IgG2a kimutatásához (Southern Biotech, Inc.). A lemezeket ezután HRP-konjugált anti-egér IgG-t, IgG1-et és IgG2a-t tartalmazó PBST-vel inkubáltuk 1 órán át 37 °C-on. A kolorimetriás reakciót tetrametilbenzidinnel (TMB) fejlesztettük ki, majd a 450 nm/655 nm-en mért abszorbanciákat optikai sűrűség (OD) egységekben fejeztük ki.

Lépsejtek proliferációjának és citokinének kimutatása

A lépsejtek proliferációját MTT vizsgálattal határoztuk meg. Az első vakcinációt követő 21. napon egyetlen lépsejt-szuszpenziót kaptunk. A sejteket RPMI-1640 tápközegben tenyésztettük 96-lyukú lemezeken 1×106 sejt/lyuk koncentráció szerint három párhuzamosban. A tenyészeteket OVA-val (végső koncentráció 10 ug/ml), ConA-val (végső koncentráció 5 ug/ml) (Sigma, St Louis, MO) és LPS-sel (végső koncentráció 100 ng/ml) stimuláltuk 48 órán keresztül 37 °C-on. . A sejteket 48 órán át tenyésztettük, és 20 μl (5 mg/ml) MTT-t (Sigma, St Louis, MO) adtunk minden egyes lyukba, és további 4 órán át inkubáltuk. Miután minden lyukba 50 μl DMSO-t adtunk a színfejlődés leállítása érdekében (Sigma), a lemezeket 570 nm-en olvastuk le mikrotiterlemez-leolvasóval (BioRad, CA, USA). A lépsejtek proliferációját stimulációs indexként (SI) fejeztük ki, amely a stimulált üreg OD570 nm aránya egy nem stimulált lyukhoz képest.

Az IL-4 és az IFN- hozamát a T-sejtekben intracelluláris citokinfestéssel mérték egy publikált protokoll szerint, kisebb módosításokkal [27, 28]. Az első vakcinázást követő 21. napon egyetlen lépsejt szuszpenziót készítettünk. A vörösvérsejt-lízist követően a lépsejteket (2×106 sejt/ml) OVA-val (10 ug/ml) inkubáltuk 4-órás stimulációig, majd Golgi-stop-ot (BD) adtunk hozzá 12 órás inkubációhoz, PMA pozitív. ellenőrzés. A sejteket összegyűjtöttük, PBS-sel mostuk, CD4-FITC/CD8-FITC-vel megfestettük, majd Cytofix/Cytoperm kittel (BD) rögzítettük és permeabilizáltuk a gyártó utasításai szerint. Az intracelluláris citokinfestést a megfelelő koncentrációjú IL-4-PE vagy IFN- -APC antitestekkel 4°C-on 20 percig végeztük. A festett sejteket FAC-okkal detektáltuk. Az adatok elemzése a FlowJo-ban történt.

A DC-k érésének és a lépben lévő Treg-sejtek értékelése

Egerekben a lépsejtekből származó DC érésének elemzéséhez sejtfelszíni festést végeztünk CD11c-PE, CD40-FITC és CD80-APC antitestekkel. Az első vakcinázást követő 3. napon egyetlen lépsejt szuszpenziót (1 x 106 sejt/ml) kaptunk, és a sejteket kétszeres festésnek vetettük alá. A fluoreszcens intenzitást a FACs Calibur mérte, a mért adatokat pedig a FlowJo elemezte.

Annak megfigyelése, hogy a WPCD csökkentheti-e a CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg cellák frekvenciáját. A második vakcinációt követő 7. napon egyetlen lépsejt szuszpenziót készítettünk. A lépsejteket (2×106 sejt/ml) sejtfelszíni festésnek vetettük alá CD4-APC antitesttel, majd nukleáris citokinfestést végeztünk a megfelelő CD25-FITC és Foxp3-PE antitestekkel. az egér szabályozó T-sejtfestő készlettel (eBiosciences) a gyártó utasításai szerint. A CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg-sejtek gyakoriságát FAC-okon tesztelték. Az adatok elemzése a FlowJo-ban történt.

Statisztikai analízis

Egyutas varianciaanalízis (ANOVA) teszteket (Tukey Multiple-Comparison Test) végeztünk a több kísérleti csoport közötti különbségek elemzésére. Az összes értéket átlag ±SD-ben fejezzük ki. P< 0.05 is believed to be statistically significant. The statistical analyses were performed using Prism 5.0 software.

Eredmények A WPCD elősegítette a BM-DC-k érését és működését in vitro

Az adaptív immunitást a DC-k aktiválása határozza meg, beleértve a kostimuláló molekulák és citokinek típusait [29, 30]. Kezdetben azt vizsgáltuk, hogy a WPCD elősegítheti-e a kostimuláló molekulák expresszióját. A WPCD, BM-DC különböző dózisai szerint

C57BL/6-ból származó beadásra került. A sejtekben a CD11c, CD86, CD80, CD40 és MHC-II expressziós szintjét elemeztük (1. ábra). Az SSC-vel és FSC-vel kapuzott sejtek azt mutatták, hogy a különböző dózisú WPCD-kezelés nem változtatta meg a BM-DC-k morfológiáját (az adatokat nem mutatjuk be). A CD86, CD80 és CD40 expressziós szintje dózisfüggő módon szignifikánsan felszabályozott a kezeletlen csoporthoz képest, és a 20 ug/ml WPCD dózis alatt elérte a platót, de a különbség nem szignifikáns az LPS-csoporthoz képest (1A–1C. ábra). Az MHC-II expressziós szintje szignifikánsan a maximális értékre emelkedett 50 ug/ml dózis alatt (1D. ábra). A sejtfelszíni markerek elemzési eredményei azt mutatták, hogy az LPS-sel vagy WPCD-vel kezelt DC-k szignifikánsan megnövekedett CD86, CD80, CD40 és MHC-II expressziós szinteket mutattak, és elősegítették a fenotípusos érést.

Egyes adjuvánsok növelhetik a kostimuláló molekulákat a DC-ken, vagy közvetlenül indukálhatják a citokinek szekrécióját. Az IL-12 és a TNF- a Th1 immunválaszt aktiváló fő citokinek. Elemeztük a citokin hozamát BM–DC-kben WPCD kezelés után. Miután a BM–DC-ket 12 órán keresztül különböző tartalmú WPCD-vel kezeltük, a felülúszót összegyűjtöttük, hogy ELISA kit segítségével kimutathassuk az IL-12 és a TNF- tartalmát. A WPCD dózisfüggően növelheti az IL-12 (2A. ábra) és a TNF- (2B. ábra) termelését. Az eredmények azt mutatták, hogy a WPCD indukálhatja a DC-k funkcionális érését.

Immunválasz esetén funkcionálisan aktiválni kell a DC-ket. Ezután az allogén T-sejt proliferáció magasabb szintjét a teljesen érett DC-k indukálták. Ezért a DC-k WPCD-re adott funkcionális válaszát az MLR vizsgálta. A WPCD-indukált DC-k allostimulációs képessége, hasonlóan az LPS-hez, drámai módon megnövekedett dózisfüggő módon a jelzett arány mellett (2C és 2D ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a WPCD javította az antigén prezentációt és optimalizálta a T-sejt választ az MLR által in vitro.

A WPCD elősegítette a DC-k érését a TLR4 útvonalon keresztül

A fenti eredményekből arra lehet következtetni, hogy a WPCD által aktivált BM-DC-k az LPS-hez (egy TLR4 ligandum) hasonló DC-k felszíni molekula expresszióját jelezték. Feltételeztük tehát, hogy a BM-DC-ket a WPCD aktiválja a TLR4 útvonalon keresztül. Miután a BM-DC-ket TAK-242 (TLR4 inhibitor) előkezeltük, majd WPCD-vel és LPS-sel 12 órán át együtt tenyésztettük, a CD40, CD86, TNF-a vagy IL{{12} }} FAC vagy ELISA kimutatta. Ahogy a 3A. és 3B. ábrán látható, a TAK-242 kezelés az LPS vagy WPCD által kiváltott CD40 és CD86 szignifikánsan lecsökkent expresszióját, valamint IL-12 vagy citokintermelést eredményezett. A TNF-a szintén szignifikánsan csökkent (3C. és 3D. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a WPCD aktiválhatja az egyenáramú érést a TLR4 útvonalon keresztül.

A WPCD fokozta a humorális és celluláris immunitást

Összehasonlításképpen értékeltük a WPCD hatásait a humorális immunválasz kiváltására OVA-val immunizált egerekben. Az oltás előtt és a 14., 21. napon,

A 35. és 49. ábrán az első vakcinázást követően vért vettünk az IgG titer és az IgG alosztályok szérumának ELISA-val történő kimutatására. Az OVA-ra adott IgG antitest-válasz a WPCD adagolásának növelésével (100 és 400 ug) dózisfüggő módon nőtt (4. ábra). Az optimális koncentráció 100 ug/ml WPCD volt, és kétszeresére növelte az IgG válaszokat a 21., 35. és 49. napon önmagában az OVA-hoz képest (4A. ábra). Az OVA-specifikus IgG1 és IgG2a antitestszintek jelentős növekedését tapasztaltuk 20 és 100 µg WPCD beadás alatt az OVA-csoporthoz képest a szérumban a 35. napon (4B. ábra). Eközben az Alum csak az OVA-specifikus IgG és IgG1 antitestek expressziós szintjét segítette elő az immunizált egerekben. A WPCD önmagában nem váltott ki OVA-specifikus antitesteket. A fenti eredmények azt mutatták, hogy a WPCD magasabb antitesttitereket és kiegyensúlyozottabb Th1/Th2 választ generált, mint az Alum.

A lépsejtek proliferációja a celluláris immunitás másik mutatója. A ConA stimulálja a T-sejteket, az LPS pedig a B-sejtek proliferációját. Az első vakcinázást követő 21. napon egyetlen lépsejt szuszpenziót kaptunk, és OVA-val (10 ug/ml), OVA323-339 (10 ug/ml) peptiddel, ConA-val (5 ug/ml) és LPS-sel stimuláltuk. 5 ug/ml) 48 órán keresztül. Ezután MTT módszerrel mértük a T-sejtek proliferációját. A WPCD jelentősen elősegítheti az OVA-antigén, a Con A-mitogén és az LPS mitogén által stimulált lépsejtek proliferációját az OVA-val és WPCD-vel immunizált egerekben (5. ábra), és a WPCD optimális koncentrációja 100 ug/ml volt. Ezek az adatok azt mutatták, hogy a WPCD vakcina adjuvánsként OVA-val immunizált egerekben hatékonyabban képes indukálni a T-sejtek és B-sejtek aktiválását, mint az Alum.

Az összes tesztelt WCPD adjuváns, amelyet OVA-vakcinákkal formuláztak, egyformán erős humorális és celluláris immunitást generált (4. és 5. ábra). Ezen adatok alapján a WPCD OVA-specifikus T helper (Th) sejtválaszra gyakorolt ​​hatásának további értékeléséhez tovább elemeztük a citokin expresszióját CD8+ és CD4+ T-sejtekben áramlási citometriával (6. ábra). . Az első vakcinázást követő 21. napon egyetlen egerek lépsejteket izoláltunk, majd együtt tenyésztettük az OVA-val (10 ug/ml). Az IL-4 hozam a CD4+ T-sejtekben a 100 ug OVA/WPCD-vel kezelt csoportban szignifikánsan magasabb volt, mint az OVA/Alum-csoportban és az OVA-csoportban, és hasonló volt a PMA-hoz (6A. ábra). Ezenkívül az IFN-hozam a CD8+ és CD4+ T-sejtekben szintén szignifikánsan megnövekedett az OVA/WPCD-vel (20, 100 és 400 ug) kapott egerekben (6B. és 6C. ábra). Az Alum adjuvánshoz képest a WPCD jobb képességet mutatott a T-sejtekből származó IL-4 és IFN-szekréció indukálására.

A DC-k WPCD-stimulált érése és a csökkent Treg-frekvenciás in vivo DC-k a leghatékonyabb APC-k, amelyek részt vesznek az elsődleges immunválasz kiváltásában. Így az első vakcinázást követő 3. napon megvizsgáltuk a WPCD CD40-re és CD80-ra gyakorolt ​​hatásait a lépben lévő DC-kre (7A és 7B ábra). Az 100-ug OVA/WPCD csoport egerei szignifikánsan magasabb CD40 és CD80 szinteket produkáltak DC-ken, mint az OVA/Alum csoportban lévők. Ezek az adatok azt mutatták, hogy a WPCD aktiválhatja a DC-ket, és egerekben DC érését indukálhatja. A Treg sejtek egyensúlyba tudják hozni a toleranciát és az immunválaszokat. Annak további vizsgálatára, hogy a WPCD hogyan modulálta az immunválaszt, az egerek lépében lévő Treg sejteket egér szabályozó T-sejtfestő készlettel festették meg. Az első vakcinázást követő 21. napon a CD25+ Foxp3+ Treg-sejtek gyakoriságának csökkenése volt megfigyelhető az összes CD4+ T-sejtekben (7C. ábra). Az OVA és OVA/Alum csoportokhoz képest a WPCD csoport szignifikánsan csökkent Treg gyakoriságot mutatott.

A WPCD biztonsági értékelése egerekben

Az orális akut toxicitás becslésére akut toxicitási tesztet végeztünk. Az 5000 mg/testtömegkilogramm orális adagolású egerek nem mutattak rendellenes viselkedést vagy mellékhatásokat, és nem találtak mortalitást a toxicitás-értékelő tesztben. Nem észleltek szignifikáns különbséget a testtömeg-gyarapodásban, a csecsemőmirigy-indexben és a lépindexben a különböző egerek csoportjai között, amelyeknek különböző dózisai WPCD-t kaptak, és nem volt szignifikáns különbség (1. táblázat). 14 nap elteltével nem figyeltek meg elhullást. Ezért a WPCD LD50 értéke több mint 5000 mg testtömeg-kilogrammonként.

Annak tesztelésére, hogy a WPCD negatív hatással volt-e az egerek növekedésére a szubkután vakcinázás előtt és után, minden egyes egér testtömegét meghatároztuk (2. táblázat). Az egerek ezt követő megfigyelése során nem figyeltek meg mellékhatásokat vagy rendellenes viselkedést. Emellett a WPCD-vel kezelt egerek és a sóoldattal vagy OVA/Alum-mal kezelt egerek testtömege nem mutatott szignifikáns különbséget. Ezek a megfigyelési eredmények azt mutatták, hogy a WPCD beadása biztonságos volt.

Vita

Az adjuvánsok kulcsfontosságú komponensek a vakcinákban [31]. A genomika és proteomika fejlődésének köszönhetően egyre több rekombináns és szintetikus vakcina molekula kerül azonosításra. Ezért több adjuvánsra és készítményre van szükség. Egyes hatásos adjuvánsok általában fokozott toxicitással kapcsolatosak, például az FCA. Ezért olyan biztonságos készítményt kell találni, amely különböző szinergetikus komponenseket tartalmaz, amelyek végül kiváltják a kívánt immunválaszt.A kínai gyógynövényekből származó poliszacharidok nem mérgezőekés nem mutatnak jelentős mellékhatásokat [32,28]. Egy bizonyos vakcinához biztonságos adjuváns szükséges.

A Cistanche deserticola egy fontos tonizáló gyógynövény, amely széles körben elterjedt a száraz területeken és a meleg sivatagokban Kína északnyugati részén. A Cistanche deserticola bioaktivitása miatt széles körben érintett, beleértve az immunmoduláló, antioxidáns, antibakteriális és daganatellenes hatásokat [20,21]. Némi előrelépés történt a Cistanche deserticola szerkezeti jellemzésében és immunológiai aktivitásában, amely jó jelölt adjuvánsok kifejlesztéséhez. Kísérletileg értékeltük a WPCD adjuváns hatásait és mechanizmusát in vitro és in vivo. A WPCD szubkután beadása jelentősen elősegítette a humorális és celluláris immunválaszokat a szérum antitestek és a limfocita proliferáció növelésével, a citokinek expressziójának fokozásával, a DC érésének fokozásával és a CD4+ CD{{5} gyakoriságának csökkentésével. } Foxp3+ Treg cellák.

A DC-k kulcsfontosságú APC-k a naiv T-sejtek indításához. A DC-k aktiválása fontos az adjuvánsok számára. A DC-ket, különösen az egérvelőből származó DC-ket gyakran használják adjuvánsok és vakcinák értékelésére. Az áramlási citometria képes megkülönböztetni azokat a sejteket, amelyek egy antigén befogása után aktiválódtak a környező sejtektől. Az FCM elemzésben a stimulált aggregáció mértéke

A sejtek indirekt mutatója az immunmodulátorok biztonságosságának értékelésében [3]. Így a WPCD adjuváns aktivitási adatai DC-kben in vitro értékes információkkal szolgálhatnak az állatmodellek számára. A BM-DC modell alapján az MHC-II, CD86, CD80 és CD40 expressziós szintjeit, a citokintermelést és az allogén T-sejt proliferációt az optimális WPCD koncentráció tartományban detektáltuk. Az MHC-II, CD86, CD80 és CD40 expressziós szintje a BM-DC-kben felfelé volt szabályozva, és a TNF-a és IL-12 hozama dózisfüggő módon nőtt. Megfigyelték az allogén T-sejt proliferációt. A BM-DC-k morfológiája nem változott. A BM-DC-k aktivációjának és a gyulladásos citokinek szekréciójának in vitro indukálásával a WPCD adjuváns jelentősen megnövelheti az antigén mennyiségét és az APC-k számát, valamint serkentheti a T-sejteket IFN-szekrécióra, ami hozzájárul az immunmoduláló aktivitás fokozásához.

KülönféleKínai lágyszárú poliszacharidokképesek aktiválni az immunrendszert, és kiváló adjuváns képességekkel rendelkeznek azáltal, hogy a TLR4 útvonalon stimulálják a DC érését [33,28]. Így feltételezzük, hogy a TLR4 részt vesz a WPCD által kiváltott DC-k érésének jelátviteli útvonalában. Ahogy az várható volt, a TLR4 gátló kezelések a TNF-a és az IL{7}} szignifikáns csökkenését eredményezték. Ezenkívül a TLR4 útvonal gátlása a CD40 és CD80 expresszióját is gátolta a DC-ken, jelezve, hogy a DC-k érése a TLR4-től függ. Ezért nyilvánvaló, hogy a TLR4 részt vesz a WPCD által kiváltott DC-k érésében.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA AZ IMUNITÁS JAVÍTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Az adjuvánsok és a vakcinakészítmény optimális dózisát számos kísérlet során empirikusan határozzák meg. A WPCD adjuváns és az OVA antigének dózis-válasz összefüggésének feltárása érdekében egerekben különböző WPCD dózisokat választottunk a BM-DC-kből származó in vitro korábban közölt adatok alapján, hogy kétszer szubkután adjunk ICR egereket. Azt találtuk, hogy a WPCD szignifikánsan növelte az OVA-specifikus antitestek hozamát, és kiegyensúlyozott Th1/Th2 immunválaszt indukált az IgG1 és IgG2a szint növekedésével. Különösen az IgG2a szintje volt magasabb, mint az optimális dózisban Alum-mal kezeltnél. Ezért a WPCD magasabb szintű specifikus antitesteket és nagyobb hatékonyságot eredményezett az alacsonyabb injekciók mellett.

Az új vakcinákhoz erős sejtválaszok indukálására van szükség, amelyek magukban foglalják az antitesteket, a T-helper (Th) sejteket és a citotoxikus T-limfocitákat (CTL). A terápiás vakcina célja erősebb T-sejt-válasz kiváltása. Az ideális adjuváns növeli a vakcina hatékonyságát és elősegíti a sejt által közvetített immunitást anélkül, hogy toxikus hatásokat okozna [34]. Az immunizált egérmodelleken végzett megfigyelések közül a WPCD az OVA-specifikus és a nem specifikus lépsejtek proliferációjának növekedéséhez vezetett az Alumhoz képest. Egyes adjuvánsok fokozzák a citokinek és az immunrendszer szabályozását. Például a szaponinok stimulálhatják a sejt által közvetített immunválaszt egy olyan antigénre, amely általában csak antitesteket indukál. Az egerek immunitási szintjének közvetett értékeléséhez az IL-4 és az IFN- indikátorokat választottuk. A WPCD több IL-4 és IFN-szekréciót tud indukálni, mint az Alum. Így a WPCD-oltás eredményeként erős helper T-sejt-válaszokat és citokinszekréciót figyeltek meg, ami arra utal, hogy a WPCD hatékonyabban tudta stimulálni a limfocitákat a Th1-típusú citokin és a Th2- típusú citokin kiválasztására, mint a Timsó.

Az antigénprezentációt befolyásoló adjuvánsok befolyásolhatják az összetett immunfolyamatokat. A Treg sejtek képesek módosítani a Th1 és Th2 válaszokat [35]. A WPCD megfelelő dózisa elősegítheti a DC-k érését egerekben azáltal, hogy növeli a CD80 és CD40 expressziós szintjét, és erősíti az OVA antigén prezentációs képességét a korai immunválaszban. A DC-k aktiválásának és a Treg-frekvenciának kísérleti eredményei azt mutatták, hogy a WPCD indukálta a DC-k érését, és csökkentette a Treg-frekvenciát a lépben egerekben. Ezek az eredmények bebizonyították, hogy a WPCD fokozta az OVA vakcinák hatékonyságát az antigénprezentáló sejtek célzottságának növelésével és a T-sejt-specifikus aktiváció elősegítésével.

Adjuvánsok kifejlesztése során nehéz szelektíven kiváltani a megfelelő immunválaszt a megfelelő fertőzéssel szemben. A megfelelő adjuvánsnak alacsony mellékhatásokkal és toxicitással kell rendelkeznie az emberekre vagy állatokra. Ezért figyelembe kell venni a WPCD biztonságát, beleértve az azonnali és hosszú távú mellékhatásokat is. Ebben a vizsgálatban a WPCD akut toxicitását és a WPCD egerek növekedési teljesítményére gyakorolt ​​negatív hatását 110 napig vizsgáltuk. A WPCD akut toxicitásának eredményei azt mutatták, hogy a testtömeg, a csecsemőmirigy-index vagy a lépindex nem mutatott szignifikáns különbséget. A WPCD LD50 értéke több mint 5000 mg testtömeg-kilogrammonként. Az egerek kísérleti későbbi megfigyelése során nem találtak mellékhatásokat vagy rendellenes viselkedést az egereknél. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a WPCD biztonságos.

Összefoglalva, ebben a tanulmányban a WPCD, a Xinjiangból származó C. deserticolából kivont nyers poliszacharid, bizonyos adjuváns tulajdonságokat mutatott. Például a WPCD mind a Th1, mind a Th2 válaszokat fokozta a DC-k aktiválásával, növelte az antitestválaszokat és javította a citokintermelést. Ezenkívül megvizsgáltuk a WPCD hatékonyságának mechanizmusát a DC-k érésének és működésének a TLR4 útvonalon keresztül történő in vitro elemzésével. A csak WPCD-vel kezelt egereknél nem figyeltek meg nyilvánvaló mellékhatást. Ezért a WPCD magasabb immunstimuláló aktivitással rendelkezett a celluláris és humorális immunválaszokban. Az adjuvánsok több vegyület keveréke. Több nyers kivonat keverékének nagyobb jótékony hatásai lehetnek, mint egyetlen növényi kivonatnak. Szükséges a WPCD-kivonatok szisztematikus feltárása, hatékonyságuk és biztonságosságuk tesztelése, hatásmechanizmusuk tisztázása.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA AZ IMUNITÁS JAVÍTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%