A Cistanche Herba antidepresszáns hatású krónikus, előre nem látható stressz esetén

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li és mtsai

ABSZTRAKT

A Cistanche tubulosa, a Cistanches Herba egyik faja a közelmúltban megerősítette, hogy antidepresszáns hatást fejt ki a krónikus, kiszámíthatatlan stressz (CUS) patkányokban azáltal, hogy helyreállította a bélmikrobióta homeosztázisát. Ebben a cikkben a C. tubulosa metabolikus profiljának feltárására törekszünk normál és CUS-indukált depressziós modellpatkányokban in vitro és in vivo. Az UPLC-Q-TOF-MS segítségével az in vitro gyomor-bélrendszeri metabolizmust vizsgáljuk.Cistanche tubulosa kivonat(CTE) normál és CUS patkányokon is értékeltük. Ugyanakkor a CTE in vivo metabolizmusa(Cistanche tubulosa kivonat)normál és depressziós patkányokban patkányok vizeletében és székletében is vizsgálták. Összesen 20 és 26 metabolitot jellemeztek in vitro és in vivometabolizmusból normál, illetve CUS patkányokban. CTE(Cistanche tubulosa kivonat)aglikonokká és fenil-etanoid-glikozidok (PhG-k) és iridoid-glikozidok bomlástermékeivé metabolizálódott, akár normál, akár depressziós patkánybél-mikrobióta in vitro. Az aglikonok II. fázisú metabolitjai, valamint a PhG-k és az iridoid glikozidok bomlástermékei voltak a fő metabolitok a patkányok vizeletében és székletében. Ezenkívül a depressziós patkány bélmikrobiótájában a másodlagos glikozidok és aglikonok előállítására való metabolikus képesség sokkal gyengébb volt, mint a normál patkány bélmikrobiótáé, ami a CUS-depressziós patkányok bélmikrobióta által termelt rendezetlen glikozid-hidrolázoknak tulajdonítható. A tanulmány eredményei megalapozták a CTE antidepresszáns tulajdonságainak metabolikus folyamatának és terápiás mechanizmusának megértését.

Kulcsszavak: Cistanche tubulosa, Depresszió Metabolizmus, In vitro, In vivo, Bél mikrobiota

1. Bemutatkozás

A Cistanches Herba hivatalosan a Cistanche deserticola (YC Ma) és a C. tubulosa (Schrenk) szárított zamatos száraként szerepel, amelyet veseelégtelenség, impotencia, női meddőség, morbidleucorrhoea, súlyos metrorrhagia és időskori székrekedés kezelésére használnak [1]. A modern farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a Cistanches Herba számos biológiai hatással rendelkezik, például neurodegeneráció-ellenes, immunreguláló és gyulladásgátló [2,3]. Korábbi vizsgálataink ezt igazoltákCistanche tubulosa kivonat(CTE), amelyek 48,6% fenil-etanol-glikozidokból (PhG-k), 6,9% iridoid-glikozidokból és 2{5}},0% összes szacharidból állnak, jelentősen enyhíthetik a krónikus, előre nem látható stressz (CUS) által kiváltott depressziós patkányok depressziós tüneteit. a bél mikrobiota homeosztázisának helyreállítása [4]. A legújabb tanulmányok azt mutatják, hogy a bél mikrobiota összetételének változásai a depresszió kialakulásához és progressziójához kapcsolódnak [5,6]. A mikrobiális nemzetségek relatív abundanciája jelentősen megzavart CUS-depresszív modellpatkányokban a normál kontrollokhoz képest [7]. A depressziós betegekben a bélmikrobióta változatossága és gazdagsága is jelentősen megváltozott [8]. Ezenkívül különféle vegyületeket, köztük a fenil-etanoid-glikozidokat (PhG-ket) és az iridoid-glikozidokat tekintették a Cistanches Herba [2,3] fő összetevőinek, amelyek könnyen metabolizálódtak másodlagos glikozidokká és aglikonokká, beleértve a hidroxi-tirozolt (HT), 3,4-dihidroxi-fenetilt. glikozid, deglikozilált genipozidsav stb. az emberi bélmikrobióta által. Ezek a metabolitok könnyebben felszívódnak a bélben, és a prototípus komponenssel összhangban lévő biológiai aktivitást fejtenek ki[9–11]. Ezért úgy gondoljuk, hogy a depresszió kialakulása és kialakulása során a bél mikroflóra szerkezetének megzavarása elkerülhetetlenül befolyásolja az orális hagyományos kínai gyógyszerek (TCM) anyagcseréjét a gyomor-bél traktusban, amellett, hogy befolyásolja a gazdaszervezet fiziológiai állapotát. A Cistanches Herba meglévő metabolikus adatainak többsége egészséges állatokon végzett metabolikus vizsgálatokból származik[12–15]. Ezért nagyobb klinikai jelentőségű lenne a CTE metabolikus profiljának vizsgálata(Cistanche tubulosa kivonat)kóros állapotában bioaktív összetevőinek tisztázásában és antidepresszív hatásának hatásmechanizmusának megértésében.

Jelen tanulmányunkban a CTE metabolikus profiljának jellemzésére törekszünk(Cistanche tubulosa kivonat)egészséges és CUS-indukált depressziós modellpatkányokban is ultra-performance folyadékkromatográfiás kvadrupol repülési idő tömegspektrometriával (UPLC-Q-TOF-MS). Normál és depressziós kóros patkányok gyomornedvét, bélnedvét és mikrobiotáját használták a CTE metabolikus folyamatának szimulálására.(Cistanche tubulosa kivonat)a gyomor-bél traktusban in vitro, függetlenül és szekvenciálisan. Az in vivo metabolitok a CTE orális adagolása után is tisztázódnak(Cistanche tubulosa kivonat)normál és CUS patkányokban. Ez a tanulmány új betekintést nyújt a CTE metabolizmusába és aktív metabolitjaiba(Cistanche tubulosa kivonat)depresszióra.

2. Anyag és módszer

2.1. Anyag

A C. tubulosa szárított szárait Hetian megyéből (Xinjiang, Kína) gyűjtöttük. Az utalványmintákat Prof. Xiaobo Li hitelesítette, és a Shanghai Jiao Tong Egyetem (Sanghaj, Kína) Gyógyszerészeti Iskola herbáriumában helyezték el. Az extrakciós módszert a korábbi publikációnkban [4] leírtak szerint alkalmaztuk. AzCistanche tubulosa kivonatA (CTE) mintákat 4 fokon tároltuk, és felhasználás előtt újra feloldottuk steril vízzel. A CTE steril vizes oldatai(Cistanche tubulosa kivonat)A mintát ezután egy 0,22 μm-es membránon átszűrtük, és a szűrleteket steril csövekbe gyűjtöttük.

Az echinakozidot Dr. Pengfei Tu laboratóriuma, a PekingUniversity (Peking, Kína) biztosította. Az akteozidot, az izoakteozidot, a 2'-acetil-lakteozidot és a cisztanozidot a Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd.-től (Chengdu, Kína) vásároltuk. A hidroxi-tirozolt, a kávésavat, a 3,4-dihidroxi-benzol-propionsavat, a 3-hidroxi-fenil-propionsavat és a 3-fenil-propionsavat az Aladdin IndustrialInc.-től vásároltuk. (Shanghai, Kína). Az egyes komponensek tisztaságát HPLC-UV vizsgálattal 95 százalék felettinek határoztuk meg. A HPLC-minőségű acetonitrilt a Mercktől (Darmstadt, Németország) vásároltuk. Az ionmentesített vizet desztillált vízből állítottuk elő Milli-Q víztisztító rendszerrel (Millipore, Bedford, MA, USA). Az összes többi felhasznált reagens és vegyszer analitikai minőségű volt.

2.2. Állatkísérletek

A hím Sprague-Dawley patkányokat (200 ± 20 g) a Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company-tól (Peking, Kína) szereztük be, és a Shanghai JiaoTong Egyetem (Sanghaj, Kína) Laboratory Animal Centerében helyezték el. Az állatokat csoportosan, szabályozott szobahőmérsékleten (25 ± 2 fok, 55 ± 10% relatív páratartalom) tartottuk, 12:12 órás világos-sötét ciklussal. A patkányok 1 hétig szabadon hozzáférhettek a normál laboratóriumi patkányok táplálékához és vízéhez. Az állatokra vonatkozó létesítményeket és protokollokat a Shanghai Jiao Tong Egyetem (Sanghaj, Kína) Állat-etikai Bizottsága hagyta jóvá.

Egyhetes akklimatizáció után tizenkét naiv patkányt véletlenszerűen két csoportra (n=6) osztottunk, a kontrollcsoportra és a krónikus előre nem látható stresszes (CUS) csoportra. A CUS patkányokat korábbi jelentésünkben [4] leírtak szerint fejlesztettük ki, amelyek különféle stresszhatásoknak voltak kitéve: fehér zaj (100 dB) 1 órán át, éjszakai alacsony intenzitású stroboszkópos megvilágítás (120 villanás/perc), vízhiány 24 órán keresztül, üres vizes palackok 1 órán át (vízmegvonás után), 24 órás táplálékmegvonás, fizikai korlátozás (1-2 óra), kényszerúszás (5 perc), szennyezett ketrec 24 óráig (200 ml víz 100 g fűrészporos ágyneműben), farokcsípés ( 1 perc), sokk 30 percig, 45 fokos ketrec dőlés 24 óráig és éjszakai megvilágítás (12 óra). A stresszorokat folyamatosan és véletlenszerűen alkalmaztuk 4 hétig, a részletes elrendezést az S1 táblázat ismerteti. 4 hét stressz után a szacharózpreferencia tesztet, a nyílt terepen végzett tesztet és az újdonság-elfojtott takarmányozási tesztet a korábban leírtak szerint végezték el [4]. A CUS és a viselkedési teszt vázlata az S1. ábrán látható. Viselkedési tesztek után minden patkányból legalább 4 székletszemcsét vettünk, és steril kúpos csövekbe helyeztük a CTE in vitro analíziséhez.(Cistanche tubulosa kivonat)anyagcsere.

2.3. A CTE gasztrointesztinális metabolizmusa(Cistanche tubulosa kivonat)normál és CUS patkányokkal in vitro

2.3.1. A CTE metabolizmusa(Cistanche tubulosa kivonat)szimulált gyomor- és bélnedvekben

Ötven milligramm CTE(Cistanche tubulosa kivonat)adtunk 10 ml szimulált gyomornedvhez, illetve bélnedvhez. Aztán CTE(Cistanche tubulosa kivonat)37 fokon 4 órán át gyomornedvben és 6 órán át bélnedvben inkubáltuk. A tenyésztett keveréket (1 ml) 3 ml vízzel telített n-butanollal azonnal leállítottuk a gyomornedvben 0 és 4 óra elteltével, valamint 0 és 6 óra múlva a bélnedvben. A felhasznált minta feldolgozási módja a korábban leírtak szerint történt [9].

2.3.2. A CTE metabolizmusa(Cistanche tubulosa kivonat)normál és CUS patkány bélmikrobióta által

A friss normál és CUS patkány székletmintákat először összekevertük és 25-szörös térfogatú GAM táptalajjal homogenizáltuk. Az üledékeket három darab gézen történő szűréssel távolítottuk el. A szuszpenziót ezután 37 fokon inkubáltuk egy anaerob inkubátorban, amelyben a levegőt gázkeverékkel helyettesítették (H2 5 százalék, CO2 10 százalék, N2 85 százalék). Ötven milligramm CTE-t adtunk 5 ml normál és CUS patkány széklet szuszpenzióhoz külön-külön, és a szuszpenziót 37 °C-on 48 órán át inkubáltuk. A tenyésztett keveréket eltávolítottuk, és vízzel telített butanollal extraháltuk 0, 12, 24 és 48 óra elteltével. A mintafeldolgozási módszert korábban leírtuk [9].

2.3.3. A CTE szekvenciális metabolizmusa(Cistanche tubulosa kivonat)a gyomornedv, a bélnedv, a normál és a CUS patkánybél mikrobióta által

Először is, 100 mg CTE(Cistanche tubulosa kivonat)1{{10}} ml szimulált gyomornedvhez adtuk, és 37 fokon 4 órán át inkubáltuk. A teljes reakciót háromszoros térfogatú vízzel telített n-butanollal leállítottuk, és 3000 fordulat/perc mellett 15 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót nitrogénáram alatt elpárologtattuk. gáz 37 fokon. Másodszor, a maradékot újra feloldottuk 0,4 ml steril vízben, hozzáadtuk 8 ml szimulált bélnedvhez, és 37 °C-on 6 órán át inkubáltuk. A gyomornedvvel ellátott mintát hasonló módon készítettük elő. Végül a maradékot újra feloldottuk 0,3 ml steril vízben, 6 ml normál és CUS patkány székletszuszpenzióhoz adtuk, és 37 °C-on 48 órán át inkubáltuk anaerob inkubátorban. A reakció egy milliliterét 3 ml vízzel telített n-butanollal azonnal leállítottuk 0 és 4 órában gyomornedvben, 0 és 6 órában bélnedvben, valamint 0, 12, 24 és 48 órában patkány bélmikrobiótában. . A mintát a CTE-vel azonos módon dolgoztuk fel(Cistanche tubulosa kivonat)szimulált gyomornedvben.

2.4. A CTE metabolizmusa(Cistanche tubulosa kivonat)normál és CUS patkányokkal in vivo

A két csoport mindegyik patkányt ezután egyéni metabolikus ketrecben helyeztünk el. Egy éjszakai éheztetést követően, amely csak a vízhez engedte szabadon hozzáférni, minden patkánynak orálisan adagoltunk 2 ml vizet agasztrikus szondán keresztül. Üres vizelet- és székletmintákat vettünk az összes patkánytól 0 óra és 12 óra között. Továbbá CTE(Cistanche tubulosa kivonat)(400 mg/kg) szondán keresztül adtuk be. A vizelet- és székletmintákat 0 órától 24 óráig gyűjtöttük. Az összes vizelet- és székletmintát azonnal –80 fokon tároltuk.

A normál és CUS patkányokból származó vizelet- és székletmintákat a korábban leírtak szerint előkezelték [12]. Az összes kapott mintát UPLC-Q-TOF-MS módszerrel elemeztük.

2.5. Analitikai módszer

Az UPLC-t Waters ACQUITY UPLC rendszeren (WatersCorp., Milford, MA, USA) végeztük ACQUITY UPLC BEH C18 oszloppal (100 mm × 2,1 mm belső átmérő, 1,7 μm, Waters Corp. , USA) gradiens elúcióval {{10}},1% hangyasav-acetonitril (A) és 0,1% hangyasav vízben (B) alkalmazásával 0,4 ml/perc áramlási sebesség mellett. . A gradiens profil: 0-5 perc (A:5-20 százalék), 5-7,5 perc (A: 20-30 százalék), 7,5-10 perc (A: 30-70 százalék), 10-11 perc (A) : 70–100 százalék), és 1,5 percig tartottuk. A gradienst 0,5 perc alatt visszavezettük 5 százalékra, és 2,5 percig tartottuk a következő futtatáshoz. Az injekció térfogata 3 μl volt. Az oszlopkemence hőmérsékletét 35 fokra állítottuk be.

A tömegspektrometriát Waters Vion IMS tömegspektrométerrel (Waters Corp., Milford, MA, USA) végeztük. Az ionizációt negatív elektrospray (ESI−) módban végeztük. Az MS paraméterek a következők voltak: kapilláris feszültség, −2.0 kV; kúpfeszültség, 20 V; forráshőmérséklet, 120 fok ; deszolvatációs hőmérséklet, 500 fok ; a kúp és a deszolvatáció gázáramlása 50, illetve 1000 l/h. A pontos tömegmérés érdekében leucin-enkefalint használtunk zárótömegként [M-H]− ion előállításához (m/z 554,2615). Az MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) kísérletet két letapogatási funkcióban a következőképpen végeztük: 1. funkció (alacsony energia): m/z 50–1000, 0,25 s pásztázási idő, 0,02 s szkennelési késleltetés, 6 eV ütközési energia; 2. funkció (nagy energia): m/z50–1000, 0,25 s pásztázási idő, 0,02 s pásztázási késleltetés, ütközési energiarámpája 20–45 eV.

2.6. Adatfeldolgozás

Az adatokat UNIFI 1.8.1 szoftverrel (Waters Corp., Milford, MA, USA) dolgoztuk fel a metabolitok azonosítására az MSE-n keresztül gyűjtött, pontos tömeges teljes letapogatású nyers adatokon belül. A vegyületeket pontos tömeg, fragmentumok alapján azonosították nagyenergiás tömegspektrometriával. Az intenzitás küszöbértéke 100,0 számláló volt. A cél azonosítása, a töredékegyezési tűrés és egyéb paraméterek automatikusan beálltak.

3. Eredmények

3.1. Viselkedésbeli változások a CUS által kiváltott depressziós patkányban

A CUS által kiváltott depressziós tüneteket mutató patkányokat viselkedési tesztekkel értékelték, beleértve a szacharózpreferencia tesztet, a nyílt terepen végzett tesztet és az újdonság-elfojtott táplálkozási tesztet. A Student-féle t-teszt kimutatta, hogy a szacharózpreferencia tesztben a szacharózpreferencia (p < 0,001),="" a="" szabadföldi="" tesztben="" megtett="" teljes="" távolság="" (p="">< 0,001)="" és="" az="" evés="" késleltetése="" az="" újdonság-elfojtott="" etetési="" tesztben="" (p="">< 0,01)="" szignifikáns="" volt.="" eltér="" a="" kontrollcsoporthoz="" képest="" 4-hetes="" cus-kezelés="" után="" (1.="" ábra).="" ezek="" az="" eredmények="" azt="" mutatták,="" hogy="" a="" krónikus,="" előre="" nem="" látható="" stressz="" modellt="" sikeresen="">

3.2. A CTE kémiai összetevőinek jellemzése(Cistanche tubulosa kivonat)

A CTE prototípus-összetevőinek átfogó elemzése(Cistanche tubulosa kivonat)UPLC-Q-TOF-MS segítségével végeztük. Összesen 27 összetevő a CTE-től(Cistanche tubulosa kivonat)kimutatták és próbaképpen jellemezték, beleértve 20 PhG-t, 5 iridoidot és iridoid glikozidot és 2 oligoszacharidot. A részletes információkat, beleértve a retenciós időt, a pontos MS-t és az MS/MS-fragmensionokat, a támogató információk (S2 táblázat) sorolják fel, hogy betekintést nyújtsanak ezen kémiai összetevők szerkezetébe. A CTE UPLC-Q-TOF-MS teljes ionkromatogramja (TIC) az S2. ábrán látható.

3.3. A CTE gasztrointesztinális metabolizmusa(Cistanche tubulosa kivonat)normál és CUS patkányokkal in vitro

Ebben a vizsgálatban a CTE lehetséges metabolitjai(Cistanche tubulosa kivonat)A normál és a CUSpatkányok in vitro vizsgálatát a TIC-kből detektáltuk, és elemi összetételek és MS/MS fragmens tömegspektrumok kombinációjával azonosították, miután összehasonlították őket a kontroll mintákkal. A CTE összes metabolitja(Cistanche tubulosa kivonat)szimulált gyomor- és bélnedvekben a normál és a CUS patkány bélmikrobióta az 1. táblázatban található.

3.3.1. A CTE metabolizmusa(Cistanche tubulosa kivonat)szimulált gyomor- és bélnedvekben

A CTE hét metabolitja(Cistanche tubulosa kivonat)szimulált gyomornedvben próbaképpen azonosították pontos tömeg- és MSE-fragmentum-információkkal: M1 (m/z315,1074, C14H20O8, 1,66 perc), M4 (m/z 459,1501, C20H28O12, 2,36 perc), M5 (m/z 45,10, C107 45,1 H). 2,60 perc), M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 perc), M12 (m/z: 785,2481, C35H46O20, 4,77 perc), M16 (m/z: 827,2580, C37H48O23, M3,/6,8, 18, z. .1968, C29H36O15, 5,81 perc). A deglikozilációt, dehidroxilezést, dehidrogénezést és izomerizációt a gyomornedvben a CTE fő metabolikus útvonalának tekintették. Megállapították, hogy az M4 és az M5 molekulatömege 2 Da-val, illetve 16 Da-val kisebb, mint a prototípus-komponensük, a koffeoil-lakteozid, és így azonosították annak dehidrogénezett, illetve dehidroxilált termékeiként. Az M12-t az echinakozid izomerjeként azonosították, amely ugyanazokat az ionokat termeli, mint az echinakozid, m/z 623,2178, 477,1601, 315,1055, 161,0237.

Ugyanezeket a metabolitokat detektáltuk a CTE után(Cistanche tubulosa kivonat)inkubáció a bélnedvben. Figyelemre méltó, hogy a PhG-kben a C-6′ pozícióban lévő koffeoilcsoportot az emésztőenzimek könnyen metabolizálták a bélnedvben, hogy dekoffeil-metabolitjait és kávésavat hozzon létre.

3.3.2. A CTE metabolizmusa(Cistanche tubulosa kivonat)normál és CUS patkány bélmikrobióta által

Összesen 20 metabolit biotranszformált CTE-ből(Cistanche tubulosa kivonat)normál ratintestinalis mikrobiótát detektáltunk és azonosítottunk (2. ábra). Az eredményekből megfigyelhető, hogy a PhG-k aglikon-hidroxi-tirozolra (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 perc) és kávésavra (CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 perc) bomlottak le. tovább metabolizálódtak M3-ra (m/z 163,0390, C9H8O3, 2,02 perc), M6-ra (m/z181,0501, C9H10O4, 2,76 perc), M10-re (m/z: 195,0655, C10H12O4, C10H12O4, C10H12O4),/z 4,15 (m) 4,15. , C9H10O3, 4,36 perc) dehidroxilezéssel, redukcióval és metilezéssel. Ezenkívül a normál patkánybél-mikrobiótában a CTE-ből származó PhG prototípusvegyületek közvetlen metabolitjait előállító központi anyagcsereútvonalak a redukció, a metoxiláció, a deglikoziláció, a koffeoil-csoport, a dehidrogénezés és az izomerizáció.

CUS-indukált depresszióban való inkubálás után patkány bélmikrobióta, CTE(Cistanche tubulosa kivonat)20 metabolittá alakult át ugyanazokon a metabolikus útvonalakon, mint a normál patkányoknál.

3.3.3. A CTE szekvenciális metabolizmusa a gyomornedv, a bélnedv, a normál és a CUS patkánybél mikrobiota által

Gyomornedvben, bélnedvben, normál és CUS patkánybél mikrobiótában, CTE szekvenciális inkubáció után(Cistanche tubulosa kivonat)14 metabolittá metabolizálódott (ebből 8 gyomornedvvel, 7 bélnedvvel, 11 normál és 10 CUS patkánybél mikrobióta). Ezek közül az M2(HT) és az M11 (3-hidroxi-fenil-propionsav, 3-HPP) voltak a PhG-k végső metabolitjai a CTE szekvenciális inkubációja után.(Cistanche tubulosa kivonat)a gyomornedvben, a bélnedvben és a bélmikrobiótában. Nem volt szignifikáns különbség a metabolitokban a normál és a CUS patkányok között.

Az M8, M9, M14, M17, M19 és M20 csak a CTE független metabolizmusában volt kimutatható normál és CUS patkány bélmikrobióta által. Ezek a metabolitok főként metabolikus intermedierek voltak, amelyek a CTE szekvenciális metabolizmusának vizsgálata során teljes mértékben metabolizálódtak végső metabolitokká, és ezért nehéz kimutatni őket.

3.3.4. Különbségek a CTE metabolikus sebessége között a normál és a CUS ratintestinális mikrobióta szerint

A CTE metabolikus sebessége közötti különbségek tisztázása(Cistanche tubulosa kivonat)Normál és CUS patkány bélmikrobióta alapján a 27 prototípus vegyület és 20 metabolit relatív tartalmát gyomornedvvel, bélnedvvel, normál és CUS patkány bélmikrobiótával történő inkubáció után külön és egymás után határoztuk meg (S3 és S4 táblázat). Az eredmények azt mutatták, hogy bár nem volt szignifikáns különbség a CTE között(Cistanche tubulosa kivonat)normál és depresszív patkányok metabolitjainál szignifikáns különbséget figyeltek meg metabolikus sebességükben. Például a C2 és C5 8-epilogánsavként vagy izomerjeként azonosították. Normál mintákban 12 órás inkubáció alatt teljesen metabolizálódtak. A kórosan depressziós patkány bélmikrobiótában azonban 48 órás inkubáció után alaposan metabolizálódtak. Nyilvánvaló volt, hogy a normál patkányban az anyagcsere gyorsabb volt, mint a CUS patkányban. Hasonló eredményeket fedeztek fel a C18-ból (izoakteozid). Figyelemre méltó továbbá, hogy az M12 (echinakozid izomerizációja) és M16 (tubulozid A izomerizációja) csúcsterülete a normál mintákban sokkal nagyobb volt, mint a CUS mintákban, ami azt jelzi, hogy a CTE izomerizációs reakciója(Cistanche tubulosa kivonat)gyakrabban fordult elő normál patkánybél mikrobiotában, mint depressziós patkány bélmikrobiótában.

3.4. A CTE metabolizmusa normál és CUS patkányban in vivo

A CTE-vel kezelt csoport biológiai mintáit összehasonlítva a vakbiológiai mintákkal, a CTE összesen 26 metabolitja (1-26. vegyület)(Cistanche tubulosa kivonat)rendellenes és CUS patkányokat mutattunk ki (2. táblázat). A normál és CUS patkány vizeletminták tipikus UPLC kromatogramjait a 3. ábra mutatja be.

3.4.1. A CTE metabolitjainak jellemzése normál és CUS raturinban

Összesen 18 in vivo CTE metabolit(Cistanche tubulosa kivonat)normál patkányok vizeletmintáiban feltételesen azonosították. A PhG-k lebomlási metabolitjai, beleértve a HT-t és a CA-t, és további szulfatálási (1, 2, 3, 5, 8 és 16 vegyület), metilációs (6, 21, 22 és 24) és metoxilezési (13 és 14) metabolitjai voltak a fő metabolitok normál patkányvizeletben. Az iridoid glikozidok könnyen metabolizálódtak aglikonokká (23, 25 és 26) degglikoziláció révén. Figyelemre méltó, hogy a normál patkányvizelet-mintában egyetlen prototípus-komponens sem volt kimutatható.

A depressziós patkány vizeletmintában a CTE 22 metabolitja(Cistanche tubulosa kivonat)kimutatták és jellemezték. Egy prototípus vegyületet, az 8-epilogánsavat mutatták ki kóros patkányvizeletben. Az egyéb metabolitok összhangban voltak a normál patkányvizeletben találtakkal, beleértve a szulfatált metabolitokat (1, 2, 3, 8, 10 és 16), metilált metabolitokat (6, 11, 19 és 22), metoxilált metabolitokat (13 és 14). HT és CA, valamint az iridoid glikozidok aglikonjai (25 és 26).

3.4.2. A CTE metabolitjainak jellemzése(Cistanche tubulosa kivonat)normál és CUS patkányürülékben

Ebben a vizsgálatban a CTE-nek csak egy metabolitja (20. vegyület, 3-HPP).(Cistanche tubulosa kivonat)normál patkányürülékben azonosították. A legtöbb PhG először CA-vá bomlott, és ennek következtében tovább metabolizálódott a fő mikrobiális metabolitjává, a 3-HPP-vé. A CUS-patkányból származó székletmintában 3 metabolitot jellemeztek alaposan, beleértve a szulfatált 3-HPP-t (16. vegyület) és a szulfatált HT-t (2. és 3. vegyület).

3.4.3. Különbségek a CTE in vivo metabolitjai között normál és CUSpatkányokban

A CTE szájon át történő alkalmazása után(Cistanche tubulosa kivonat), az in vivo metabolitok nyilvánvaló különbségeket mutattak egészséges és depressziós modellpatkányokban. 21 metabolitot (1–3., 5., 6., 8–14., 16., 17. és 19–26. vegyület) mutattunk ki mind az egészséges, mind a CUS patkánymintákban. A 23-as vegyületet (deglikozilált genipozidsav) csak egészséges patkánymintákban azonosították, míg a 4-es (HT), 7-es (8-epilogánsav), 15-ös (3, 4-dihidroxi-benzol-propionsav) és 18-as ({{) 19}}HPP glükuronid konjugáció) csak CUS modell patkány mintákban volt kimutatható. Összefoglalva, a prototípus-összetevőket csak CUS-patkányokban mutatták ki, míg a több fázisú metabolitokat normál patkányokban fedezték fel.

4. Megbeszélés

Ebben a vizsgálatban három in vitro inkubációs modellt, köztük gyomornedvet, bélnedvet, normál és CUS patkány bélmikrobiótát alkalmaztak egymástól függetlenül és egymást követően a CTE gasztrointesztinális metabolikus profiljának vizsgálatára.(Cistanche tubulosa kivonat)in vitro. Azt találták, hogy a PhGsand iridoid glikozidok CTE-ben(Cistanche tubulosa kivonat)könnyen metabolizálódtak másodlagos glikozidokká és aglikonokká a CUS-indukált depresszív patkánybél-mikrobióta hatására. Ezt követően a CTE in vivo metabolizmusa(Cistanche tubulosa kivonat)normál és CUS patkányokban is igazolták. A CTE javasolt metabolikus útvonalai(Cistanche tubulosa kivonat)egészséges és CUS-indukált depressziós patkányokban a 4. ábra mutatja be. A PhG-k, mint az echinakozid és az akteozid, HT-vé és CA-vá metabolizálódtak, és a CA további metabolizmuson ment keresztül fő mikrobiális metabolitjává, a 3-HPP-vé. A HT, CA és 3-HPP ezután szulfatált, metilezett és metoxilált metabolitjaivá metabolizálódott. Az iridoid glikozidok, beleértve a genipozidsavat, a kankanosid A-t és a kankanosid N-t, deglikozilációval aglikonokká metabolizálódtak. Ezek továbbá bebizonyították, hogy a PhG-k és az iridoid glikozidok CTE-ben(Cistanche tubulosa kivonat)könnyen metabolizálódtak másodlagos glikozidokká és aglikonokká CUS-patkányokban. Ezek a metabolitok általában jobb bélrendszeri felszívódást és biológiai hasznosulást mutatnak, hogy később felszívódnak a vérben, és biológiai aktivitást fejtenek ki [16–18]. Érdemes megjegyezni, hogy a gyomor-bél traktusban az izomerizáció elterjedt volt a PhG-k esetében, és a releváns metabolitokat azonosították, miután összehasonlították prototípusaik UPLC retenciós idejével az optimalizált ideális UPLC gradiens profil alapján.

A kávésav volt a CTE elsődleges bomlásterméke(Cistanche tubulosa kivonat)depressziós kóros patkánybél mikrobióta által. Korábbi publikációk arról számoltak be, hogy a kávésav antidepresszív hatást vált ki az egereken végzett kényszerúszási teszt során. Mind az agyból származó neurotróf faktor (BDNF) mRNS szintje a frontális kéregben, mind a TrkB mRNS szintje a theamygdalában szignifikánsan csökkent a kényszerúszás teszt után, előbbi csökkenést pedig jelentősen gátolta a kávésav [19]. A hidroxitirozol a PhG-k aglikonja, amely védi a neurogenezist és a kognitív funkciókat azáltal, hogy megakadályozza a BDNF idegi fehérje stressz által kiváltott leszabályozását [20]. Ezért fokozott figyelmet kell fordítani egyes bioaktív metabolitokra (pl. HT és CA), amelyeket orális adagolás után a bélmikrobióta transzformál.

Ezen túlmenően, a jelen eredmények bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a depresszív bélmikrobiótában a másodlagos glikozidok és aglikonok termelésére irányuló metabolikus képesség jelentősen gyengébb volt, mint az innormális patkány bélmikrobiótáé. Ennek oka valószínűleg a bélmikrobióta depresszió által kiváltott szerkezeti változásaira vezethető vissza, ami a bélmikrobióta által termelt metabolikus enzimek aktivitásának csökkenéséhez vezet [21]. Érdekes módon egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy a Bacteroidetes törzs kódolta a legnagyobb mennyiségben előforduló glikozid-hidroláz- és poliszacharid-liáz-géneket a glikozid-hidrolízishez és a komplex szénhidrátok eliminációs mechanizmussal történő hasításához [22]. Pontosabban, a Bacteroides spp. beleértve a B. caccae, B. dorei, B. finegoldii, B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis és B. A xylanisolvens domináns összszámú GH-t és PL-t kódoló gént mutatott. A Parabacteroides distasonis is ugyanezekkel a tulajdonságokkal rendelkezik [22]. Korábbi vizsgálataink megerősítették, hogy a 28-napos krónikus, előre nem látható stresszstimuláció csökkentette a Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas és Weissella nemzetségek relatív abundanciáját, míg patkányokban megnövelte a Ruminococcus és Deinococcus fajok számát [4]. Figyelemre méltó, hogy a Bacteroides és a Parabacteroides volt a két legelterjedtebb mikrobiális taxon, amelyek körülbelül 20 százalékos relatív abundanciát képviseltek normál patkányokban. A CUS-kezelés után a Bacteroides és Parabacteroides relatív abundanciája meredeken, körülbelül 5 százalékra csökkent depressziós modellpatkányokban. Ezért ez elkerülhetetlenül a GH és PL enzimek teljes számának csökkenéséhez vezet CUS patkányokban, és tovább zavarja a CUS depresszív bélmikrobióta deglikozilált reakcióját a CTE orális adagolása után.(Cistanche tubulosa kivonat)modellpatkányokban.

5. Következtetés

Ebben a tanulmányban az UPLC-Q-TOF-MS technikát hozták létre és alkalmazták a metabolitok szűrésére és azonosítására.Cistanche tubulosa kivonatnormál és CUS depressziós patkányokban in vitro és in vivo. Az eredmények azt mutatták, hogy a CTE(Cistanche tubulosa kivonat)az egészséges és a depressziós bélmikrobióta aglikonokká és PhG-k és iridoid glikozidok bomlástermékeivé metabolizálódott. A CTE szájon át történő alkalmazása után(Cistanche tubulosa kivonat)fázis II. fázisú aglikonok metabolitjait, valamint a PhG-k és iridoidglikozidok bomlástermékeit túlnyomórészt patkányok vizeletében találták meg. A depresszív patkányok bélmikrobiótájának metabolikus képessége másodlagos glikozidok és aglikonok előállítására sokkal gyengébb volt, mint a normál patkányok bélmikrobiótájában, ami a CUS depressziós patkányok bélmikrobióta által termelt rendezetlen glikozid-hidrolázoknak tulajdonítható. Ez a tanulmány új perspektívát kínál a későbbiek számára. a CTE fejlesztése(Cistanche tubulosa kivonat)mint potenciális antidepresszáns.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Kutatási és Fejlesztési Program (2017YFC1702400) támogatásai támogatták.

A. függelék Kiegészítő adatok

A cikkhez kapcsolódó kiegészítő adatok a HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728 címen találhatók.

Forrás: ' In vitro és in vivo metabolizmusaCistanche tubulosa kivonatnormál és krónikus, előre nem látható stressz-indukált depressziós patkányokbanYang Li és mtsai

---Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728

Hivatkozások

[1] Chinese Pharmacopoeia Commission, The Pharmacopeia of the People's Republic of China, 2015 ed., China Medical Science Press, Peking, China, 2015, p. 135 I. rész.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Analysis of chemical constituents in Cistanche fajok, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: kémiai, farmakológiai és farmakokinetikai tulajdonságainak áttekintése, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Antidepressant-like effects ofCistanche tubulosa kivonatkrónikus, előre nem látható stresszes patkányokon a bél mikrobiota homeosztázisának helyreállítása révén, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Bél-agy tengely: hogyan befolyásolja a mikrobiom a szorongást és a depressziót, Trends Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Legutóbbi fejlemények a bélmikrobióta agyi egészségben és betegségekben betöltött szerepének megértésében, Ann. NY Acad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Variations in gut microbiota and fecal metabolic phenotype asssociated todepress by 16S rRNS génsequencing and LC/ MS-alapú metabolomika, J. Pharm. Biomed. Anális. 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Transfering the blues: Depressio-asssociated gut microbiota induces neuro-viselkedési változások patkányban, J. Psychiatr. Res.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, A Cistanches Herba vízkivonat humán gastrointestinalis metabolizmusa in vitro: a metabolikus profil tisztázása átfogó metabolit azonosításon alapuló gyomornedvben, intestinalis lé, emberi bélbaktériumok és bélmikroszómák, J. Agric. Food Chem. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Humán bélbaktériumok által termelt echinakozid metabolitok azonosítása ultra-teljesítményű folyadékkromatográfiával/kvadrupol repülési idő tömegspektrometriával, J. Agric. Food Chem. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Cistanches Herba három tipikus fenil-etanol-glikozid metabolitjának szűrése és azonosítása humán bélbaktériumok által UPLC/Q-TOF-MS segítségével, J. Pharm. Biomed. Anális. 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li: A Cistanche deserticola és a C. tubulosa vizes kivonat metabolitjai közötti különbségek gyors szűrése és azonosítása patkányokban UPLC-vel. Q-TOF-MS kombinált mintafelismerési analízis, J. Pharm. Biomed. Anális. 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, A Cistanche tubulosa echinakozid és akteozid metabolitjainak szisztematikus jellemzése patkányplazmában, epében, vizeletben és székletben UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, Egy megközelítés a szekvenciális metabolitok azonosításához egy tipikus feniletanoid-glikozid, az echinakozid, amely a folyadékkromatográfiás ioncsapda időn alapul.
repülési tömegspektrometriás elemzés, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolism of echinacoside, a good antioxidant, in patkány: izolálása és biliáris metabolitjainak azonosítása, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Understanding the molekuláris mechanizmusok a növényi gyógyszerek és a bélmikrobióta közötti kölcsönhatásban, Med. Res. Rev. 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, A ginzenozidok felszívódása és diszpozíciója szájon át Panax notoginseng kivonat beadása patkányoknak, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Interactions of gut microbiota with funkcionális élelmiszer-komponensek és nutraceuticals, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, A kávésav mérsékli a kérgi BDNF mRNS expressziójának csökkenését, amelyet a kényszerített expozíció okoz. úszásstressz egerekben, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng: Az anyai hidroxitirozol adagolása javítja a neurogenezist és a kognitív funkciókat prenatális stresszben utóda, J. Nutr. Biochem. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, The influence of gut microbiota on drug metaboly and toxicity, Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, A szénhidrát-aktív enzimek bősége és változatossága a humán bélmikrobiótában, Nat. Rev. Microbiol. 11 (2013) 497–504.