A citoprotektív és öregedésgátló hatást kifejtő Salinispora Arenicola lágy korall szimbiotikus mikroorganizmusból származó kivonat izolálása 1. rész

Absztrakt: A sejtek egy erősen integrált rendszert fejlesztettek ki, amely a proteom stabilitásáért felelős, nevezetesen a proteosztázis hálózatot (PN). Mivel a proteosztázis elvesztése az öregedés és az életkorral összefüggő betegségek jellemzője, a PN-modulok aktiválása valószínűleg meghosszabbíthatja az egészségi állapotot. Itt közöljük a Scleronephthya lewinsohni lágy korallból izolált Salinispora arenicola TM223-S2 törzsből tisztított kivonat (SA223-S2BM) bioaktivitását; ezt a korallt 65 m mélységben gyűjtötték az EAPC mezofotikus Vörös-tengeri ökoszisztémából (Eilat déli részén, Izrael). Az emberi sejtek SA223-S2BM-aktivált proteosztatikus modulokkal való kezelése csökkentette az oxidatív terhelést, és védelmet biztosított az oxidatív és genotoxikus stressz ellen. Ezenkívül az SA223-S2BM fokozta a proteaszóma és lizoszómális katepszin aktivitást a Drosophila legyekben, és bőrvédő hatást fejtett ki, amint azt a bőr öregedésével kapcsolatos enzimek, az elasztáz és a tirozináz hatékony gátlása bizonyítja. Azt javasoljuk, hogy az SA223-S2BM kivonat valószínűleg ígéretes forrás az öregedésgátló tulajdonságokkal rendelkező molekulák előtérbe helyezéséhez.

A cisztanche glikozidja növelheti az SOD aktivitását a szív- és májszövetekben, és jelentősen csökkentheti az egyes szövetek lipofuscin- és MDA-tartalmát, hatékonyan megkötve a különböző reaktív oxigéngyököket (OH-, H2O₂ stb.) és megvédheti az okozott DNS-károsodást. OH-gyökök által. A Cistanche feniletanoid glikozidok erős szabad gyökfogó képességgel rendelkeznek, nagyobb redukáló képességgel rendelkeznek, mint a C-vitamin, javítják a SOD aktivitását a spermiumszuszpenzióban, csökkentik az MDA-tartalmat, és bizonyos védő hatást fejtenek ki a spermium membrán működésére. A cistanche poliszacharidok fokozhatják a SOD és a GSH-Px aktivitását a D-galaktóz által okozott kísérletileg öregedő egerek eritrocitáiban és tüdőszöveteiben, valamint csökkenthetik a tüdő és a plazma MDA- és kollagéntartalmát, valamint növelhetik az elasztintartalmat. jó eltávolító hatás a DPPH-ra, meghosszabbítja a hipoxia idejét öregedő egerekben, javítja a SOD aktivitását a szérumban, és késlelteti a tüdő fiziológiás degenerációját kísérletileg öregedő egerekben A sejtmorfológiai degenerációval a kísérletek kimutatták, hogy a Cistanche jó antioxidáns képességgel rendelkezik és potenciálisan gyógyszer lehet a bőröregedési betegségek megelőzésére és kezelésére. Ugyanakkor a Cistanche-ban található echinakozid jelentős mértékben képes megkötni a DPPH szabad gyököket, és képes megkötni a reaktív oxigénfajtákat, és megakadályozza a szabad gyökök által kiváltott kollagén lebomlását, valamint jó helyreállító hatással van a timin szabad gyökök anionjainak károsodására.

Kattintson a Cistanches herba elemre

【További információ:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Kulcsszavak: öregedés; antioxidáns válaszok; tengeri mikroorganizmus; proteosztázis hálózat; Salinispora arenicola

1. Bemutatkozás

Az öregedést a funkcionális kapacitás és a stresszállóság időfüggő csökkenése, valamint a megnövekedett mortalitás és morbiditási arány jellemzi [1]. Az öregedés nem csupán passzív folyamat, hanem az evolúciós konzervált molekuláris és sejtes jelátviteli események szabályozzák [2,3]. Az élőlények állandó kihívást jelentenek mind a belső (anyagcserével kapcsolatos), mind a külső (étrendből vagy környezetből származó) stresszorokkal, amelyek a károsodott biomolekulák fokozatos felhalmozódásához vezethetnek, és végül veszélyeztethetik a sejt homeosztázisát [4,5]. A fehérjék minden kulcsfontosságú sejtfunkcióban részt vesznek, ezért a proteom homeosztázis (proteosztázis) kritikus a sejtek működése és túlélése szempontjából [6].

A proteomák integritását a proteosztázis hálózat (PN) tartja fenn, amely kiterjed az összes szubcelluláris kompartmentre, és sejt-, szövet- és szervezeti szinten szabályozza a szervezet egészségét és hosszú élettartamát [7]. A proteosztázis fenntartásához szükséges, hogy a sejtek koordinálják és szabályozzák az összes polipeptid szintézisét, hajtogatását, válogatását, szállítását és lebontását [8,9]. Ezeket a sejtfunkciókat többnyire a PN három fő, egymással összefüggő ága látja el, nevezetesen a molekuláris chaperonok hálózata, az ubiquitin-proteaszóma (UPP) és az autofágia-lizoszóma (ALP) proteolitikus útvonalak [10,11].

A molekuláris chaperonok biztosítják a fehérje megfelelő feltekeredését és a konformáció fenntartását, valamint együttműködnek a degradációs útvonalakkal [12]. Az UPP a fehérjeszintézis minőségellenőrzésének fő helyszíne, és részt vesz a normál, rövid élettartamú fehérjék, valamint a nem javítható hibásan összetekeredő vagy széttekeredő fehérjék újrahasznosításában [6], míg az ALP a fehérjeaggregátumok és a sérült organellumok felismeréséért és eltávolításáért felelős. [13]. A proteosztázis elvesztése az öregedés fémjelzi [14], valamint számos, életkorral összefüggő emberi patológia fő kockázati tényezője, beleértve a rákot, a cukorbetegséget, a szív- és érrendszeri betegségeket és a neurodegeneratív betegségeket [15]. Ezért a PN aktiválása ígéretes megközelítésnek tekinthető az öregedés és az életkorral összefüggő betegségek kialakulásának és/vagy progressziójának késleltetésében [16–18].

A bőr öregedését szerkezeti és funkcionális változások jellemzik (többek között) az extracelluláris mátrix komponenseiben, például az elasztinban [19]. Az elasztáz az az enzim, amely részt vesz az elasztin lebontásában, ami ráncok kialakulásához és rugalmasságának elvesztéséhez vezet [20]. A tirozináz kulcsenzim a melanin szintézisben, amely többek között az emberi bőr pigmentációjáért felelős [21,22]. A tirozináz túlzott aktiválódása azonban számos bőrbetegséggel jár, mint például a hiperpigmentáció és a melanoma[22,23]. Ezért az elasztáz és tirozináz gátlása kiemelkedő megközelítést jelent a bőröregedés ellen.

A természetes termékek (NP-k) hosszú múltra tekintenek vissza – jól dokumentálva, a modern tudomány és technológia születése előtt, különböző kultúrákban – az emberi betegségek kezelésében [24–26]. Így az NP-k nagymértékben dúsított kiindulási anyagokként és állványként szolgálhatnak a gyógyszerfejlesztéshez; sőt, az összes gyógyszer több mint fele vagy NP-k, NP-k eredetűek vagy NP-k által inspirált [27–29]. A legtöbb biodiverzitást rejtő tengeri világ nagyrészt feltáratlan, ezért ez lehet a legnagyobb erőforrás az új NP-k felfedezéséhez [30]. A tengeri környezetben élő organizmusok közül a puha korallok ígéretes bioaktív NP-szolgáltatók, és ismert, hogy számos különféle mikroorganizmust tartalmaznak [31,32].

Tekintettel ezekre a tényekre, jelenleg az NP-k kiterjedt, nagy áteresztőképességű szűrését végezzük, hogy azonosítsuk azokat a bioaktív molekulákat, amelyek potenciálisan késleltethetik a sejtek öregedését és/vagy in vivo öregedését. Az itt bemutatott tanulmányban a Salinispora arenicola (S. arenicola) TM223-S2 törzs metanolos kivonatát, nevezetesen az SA223-S2BM-et vizsgáltuk in vitro, valamint sejtalapú vizsgálatokkal. és in vivo biovezérelt megközelítések. A S. arenicola TM223-S2 törzset a lágy korallból, a Scleronephthya lewinsohniból (S. Levinson) izolálták (eredetileg Scleronephthya lewinsohni néven Verseveldt és Benayahu, 1978), amelyet fenntartható módon a mezofotikus Vörös-tengeri EAPC-ből (ökoszisztéma) nyertek. dél-Eilat, Izrael) 65 m mélységben. Az SA223-S2BM metanolos kivonat aktiválta a citoprotektív mechanizmusokat mind az emberi sejtekben, mind a Drosophila melanogaster (D. melanogaster) legyekben, és in vitro bőrvédő tulajdonságokat fejtett ki. Ezért az SA223-S2BM kivonat forrása lehet a potenciális citoprotektív és öregedésgátló tulajdonságokkal rendelkező molekulák valószínű azonosításának.

2. Anyagok és módszerek

2.1. SA223-Az S2BM kivonat eredete és izolálása

2.1.1. Korall Gyűjtemény

Az S. Levinson puha korallt egy ROV H800 (ECA Robotics) gyűjtötte össze, amelyet Sam Rothberg R/V, az InterUniverity Institute for Marine Sciences in Eilat (IUI) üzemeltetett. A helyszíni fényképezést gyenge fényű fekete-fehér VS300 (ECA Robotics) és 1CAM Alpha HD kamerával (SubC Imaging) végezték. A mintákat a ROV-kar az eilati mezofotikus zátonyról, az olajmóló termináljától (29◦300 47.0900 É, 34◦350 56.7100 K), 65 méteren, március 7-én vette. 2017. A gyűjtőhelyet mérsékelt lejtő jellemzi, sziklás foltokkal, amelyet homokos tengerfenék vesz körül. A begyűjtés után az anyagot azonnal lefagyasztottuk –80 ◦C-ra. Az utalványmintát 70 százalékos etanolban őrizték meg taxonómiai azonosítás céljából, és letétbe helyezték a Tel-avivi Egyetem Steinhardt Természettudományi Múzeumában (SMNHTAU_Co{16}}).

2.1.2. Törzs elkülönítése és azonosítása

A S. arenicola TM{0}}S2-t S. Levinson 1 ml-es mintájából izoláltuk. Az összegyűjtött lágy korallmintát steril tengervízben őröltük és 1 órán át 50 ◦C-on melegítettük. A kapott szuszpenziót sorozathígítottuk, szelektív izolációs agar táptalajra szélesztettük, és 28 °C-on inkubáltuk legalább 6 hétig. A Salinispora törzset izoláltuk, és a telepet tengeri húsleves agaron (MBA) (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) tisztítottuk, és –20 ◦C-on konzerváltuk 10 százalékos glicerines oldatban.

2.1.3. Filogenetikai vizsgálat

A filogén analízist a S. arenicola TM223-S2 genomiális DNS-éből amplifikált 16S rRNS gén fragmentumával végeztük. A TM223-S2 törzs genomiális DNS-ét DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) segítségével izoláltuk a gyártó utasításai szerint. A 16S riboszomális RNS fragmentumot PCR-rel amplifikáltuk 16S F 27, AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC AG (Tm: 56,3 ◦C) és 16S R 1492, TAC GG(CT) TAC CTT GTT (ACG ACT) primerek használatával. Tm: 57,5 ​​◦C). Az amplikonokat Sanger szekvenálással szekvenáltuk, és a szekvenciákat az NCBI Targeted Loci projektjének 16S riboszomális RNS adatbázisához igazítottuk MUSCLE segítségével. A beállítást manuálisan ellenőrizték, és a réseket eltávolították. Az evolúciós történetre a maximum likelihood módszer és a Tamura–Nei modell [33] segítségével következtettek, 1000 ismétléssel. A heurisztikus keresés kezdeti fát automatikusan megkaptuk a szomszéd-join és a BioNJ algoritmusok páronkénti távolságok mátrixára történő alkalmazásával, amelyeket a maximális összetett valószínűség (MCL) megközelítéssel becsültek meg, majd kiválasztottuk a felsőbbrendű log likelihood értékkel rendelkező topológiát. Az evolúciós elemzéseket a MEGA X 10.1.7-es verziójában végezték [34].

2.1.4. Termesztési feltételek

A S. arenicola TM{0}}S2 spórák –20 ◦C-on konzerváltak 10 százalékos glicerinben. A tenyésztés előtt a törzset 15 napig újraélesztettük MB-t (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) tartalmazó 15 cm-es Petri lemezen, amelyet 2% agarral (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) tartalmaztak. , USA). Steril tengervizet (4 × 10 ml) öntöttünk a lemez felületére, és a spórákat és a micéliumot eltávolítottuk a lemezről úgy, hogy a felületet szikével finoman megkarcoltuk, hogy létrehozzuk az oltóanyagot. A folyékony állapotú fermentációt (LSF) 2 literes Erlenmeyer-lombikban hajtottuk végre 20 napon keresztül 28 ◦C-on és 130 fordulat/perc keverés mellett. Amberlite XAD16 gyantát (30 g/l) (Amberlite XAD16HP N, Certis, Lenntech, Delfgauw, Hollandia) adtunk hozzá sterilizálás előtt, hogy lehetővé tegyük a mikrobiális metabolitok in situ befogását. Az oltóanyagból 5 ml-t használtunk 1 liter 30 g Amberlite XAD16 gyantát tartalmazó MB-re történő beoltására. Az agar-állapotú fermentációt szilárd fázisú extrakcióval (SPE) [35] MB táptalajon (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) hajtottuk végre, amelyet 2 százalék agarral (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) 20 napon keresztül 28 ◦C-on. Sterilizált Amberlite XAD16-ot (35 g) 35 ml inokulummal keverve homogén módon eloszlattuk 1 MB agar Petri lemez (25 cm × 25 cm) felületén.

Az LSF esetében az XAD16 gyantát szűréssel elválasztottuk a táptalajtenyészettől, és vízzel mostuk, majd etil-acetáttal (100 ml), majd metanollal (100 ml) eluáltuk. Az eluátumokat vákuumban szárazra pároljuk, és DMSO-ban 10 mg/ml koncentrációban szolubilizáljuk. A kapott SA223-S2LAE (etil-acetáttal extrahált) kivonatot használtuk fel a biológiai értékelésekhez.

Az SPE esetében az XAD16 gyantát az agarlemez felületének óvatos megkarcolásával nyertük ki. A visszanyert gyantát vízzel mostuk a biomassza eltávolítására, majd 100 ml etil-acetáttal, majd 100 ml metanollal eluáltuk. Az eluátumokat vákuumban szárazra pároljuk, és DMSO-ban 10 mg/ml koncentrációban szolubilizáljuk. A kapott SA223-S2BAE (etil-acetáttal extrahált) és SA223-S2BM (metanollal extrahált) kivonatokat használtunk fel biológiai értékelésekhez.

2.2. Elasztáz és tirozináz gátló hatások

Az elsőbbséget élvező kivonat elasztáz gátló aktivitását a sertés hasnyálmirigyéből (PPE) IV típusú elasztázzal (Merck KGaA, Darmstadt, Németország) és az N-szukcinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid szubsztráttal (Merck KGaA, Darmstadt, Németország), a korábban leírtak szerint [36]. Meghatároztuk a kivonat azon képességét, hogy gátolja a tirozináz katalitikus hatását az L-DOPA dopakrómmá történő oxidációjában, amint azt korábban közöltük [37].

2.3. Sejtvonalak, sejttenyésztési körülmények és sejtéletképességi vizsgálat

A humán fityma fibroblasztokat (BJ-sejteket) az American Tissue Culture Collection-től (ATCC), míg a humán immortalizált keratinocitákat (HaCaT-sejteket) az Elabscience, Inc.-től szereztük be. Mindkét sejtvonalat Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)-ben (Thermo Fisher) tenyésztettük. Scientific Inc., Waltham, MA, USA) 10% (v/v) borjúmagzati szérummal (FBS) és 1% (v/v) nem esszenciális aminosavval kiegészítve, és 5% CO2, 95% körülmény között tartották. páratartalom és 37 ◦C. Minden alkalmazott kísérleti eljárásban a sejteket tripszin/EDTA oldattal (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) tenyésztettük ki. Az SA223-S2BM kivonat sejtek életképességére gyakorolt ​​hatását az MTT-teszt segítségével becsültük meg, amint azt korábban közöltük [38]. A sejtkezelést hidrogén-peroxiddal (H2O2) és doxorubicinnel (DXR) végeztük az ábramagyarázatokban leírtak szerint; A H2O2-t és a DXR-t a Merck KGaA-tól (Darmstadt, Németország) szereztük be.

2.4. Drosophila vonalak és hosszú élettartam vizsgálat

Ebben a vizsgálatban a Bloomington Drosophila Stock Centertől (Bloomington, IN, USA) vásárolt Drosophila w1118 törzset használtuk. A legyeket 25 ◦C-on és 60 százalékos páratartalom mellett tartottuk 12 órás világos: 12 órás sötét ciklusban. Valamennyi bemutatott kísérletben csak a legyek szomatikus szöveteit (fej és mellkas) elemeztük, mivel a szaporodási szövetek a szomatikus szövetekhez képest eltérően szabályozzák a proteosztatikus mechanizmusokat és az öregedési sebességet [39].

A legyek élettartamát a korábban leírtak szerint [40] vizsgáltuk nőstény és hím legyek (nemenként egyenlő szám) felhasználásával, amelyeket a vizsgált kivonatot tartalmazó (vagy nem) tartalmazó fiolákban tenyésztettünk. A legyeket kétnaponta friss élelmiszert tartalmazó fiolákba helyezték, és naponta értékelték az elhullásokat. A túlélési görbékhez és a statisztikai elemzéshez a Kaplan–Meier eljárást és a log-rank (Mantel–Cox) tesztet alkalmaztuk; szignifikanciát p < 0,05 értéknél fogadtuk el.

2.5. Reaktív oxigénfajták (ROS) mérése

A sejteket vagy a legyek szöveteit CM-H2DCFDA festékkel (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) inkubáltuk 10 µM koncentrációban PBS-ben 30 percig sötétben (37 ◦C és 25 ◦C). A festék eltávolítása után a sejteket vagy legyek szöveteit PBS-sel inkubáltuk 15 percig sötétben (37 °C, illetve 25 °C), lízispufferben lizáltuk [150 mM NaCl, 1% (v/v) NP{{ 11}}, 50 mM Tris, pH 8,0], majd centrifugáljuk 14,{16}} g-vel 15 percig (4 ◦C). Ezt követően a fehérjetartalmat Bradford assay-vel (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), majd a keletkezett fluoreszcenciát Spark® multimódusú mikrolemez-leolvasóval (Tecan Trading AG, Männedorf, Svájc) mértük gerjesztéskor. 490, illetve 540 nm emissziós hullámhossz. A hidrogén-peroxidot (H2O2) pozitív kontrollként használták, mivel széles körben ismert, hogy oxidatív károsodást/stresszt okoz [41].

2.6. RNS-kivonás, cDNS-szintézis és kvantitatív valós idejű PCR (Q-RT-PCR) elemzés

A teljes RNS-t RNAiso plus (Takara Bio Inc., Shiga, Japán) alkalmazásával extraháltuk a sejtekből, és mennyiségileg meghatároztuk BioSpec-nano spektrofotométerrel (Shimadzu Inc., Kyoto, Japán). Ezt követően 1 µg RNS-t cDNS-vé alakítottunk a FastGene Scriptase II cDNS Kit (NIPPON Genetics, Düren, Németország) segítségével. A kvantitatív valós idejű PCR elemzésekhez az 5x HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermixet (Solis BioDyne, Tartu, Észtország) és a PikoRealTM Real-Time PCR rendszert (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) használtuk. A vizsgált humán gének specifikus primerjei a korábban leírtak voltak [42]. A HMBS gént használták normalizálóként.

2.7. Immunblot analízis és a proteaszóma és katepszin aktivitás mérése

Az immunblot vizsgálatokat a korábban leírtak szerint végezték [43]. Az elsődleges és a torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitesteket 1 órán át szobahőmérsékleten alkalmaztuk, és az immunblotokat fokozott kemilumineszcenciás reagenskészlettel (ClarityTM Western ECL Substrate, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) fejlesztettük ki. Az immunblot mennyiségi meghatározását pásztázó denzitometriával és ImageJ szoftverrel végeztük [44].

A sejtekben vagy legyek szöveteiben a proteaszóma és a katepszin enzimaktivitását VersaFluor™ fluorométer rendszerrel (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) mértük Suc-LLVY-AMC (kimotripszinszerű aktivitás, CT-L) alkalmazásával. és Z-FR-AMC fluorpeptidek (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA), a korábban leírtak szerint [42, 45, 46]. Pozitív kontrollként a 6-bróm-indirubin-30 --oximot (6BIO) használták, mivel ismert, hogy aktiválja az UPP-t mind az emberi sejtekben, mind a Drosophila legyekben [42,47]; a Rapamycin gyógyszert pozitív kontrollként használták az ALP és a katepszin indukcióhoz [48].

2.8. Felhasznált antitestek

Az 5 (sc-55009) proteaszóma alegység, NQO1 (sc-16464), Beclin 1 (BECN1) (sc-11427), klaszterin (CLU) (sc{{7}) elleni elsődleges antitestek }), a HSP27 (sc-13132), a HSP70 (sc-59570) és a GAPDH (sc-25778), valamint a torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitesteket Santa Cruztól vásároltuk Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA). Az 53BP1 (4937), a phospho-Histone H2A.XSer139 (H2A.X) (9718) és a phosphor-p53Ser15 (9286) elleni elsődleges antitesteket a Cell Signaling Technology, Inc.-től (Danvers, MA, USA) szereztük be. Az SQSTM1/p62 (BML-PW9860) elleni antitestet az Enzo Life Science, Inc.-től (Farmingdale, NY, USA) vásároltuk.

2.9. Statisztikai elemzések

A kísérleteket legalább két példányban végezték. A statisztikai elemzésekhez MS Excelt használtunk. A statisztikai szignifikanciát Student-féle t-próbával (t-próba) értékeltük. Az adatpontok a független kísérletek átlagának felelnek meg, a hibasávok pedig a szórást (SD); szignifikancia p < 0.05 vagy p < 0,01 értéket a grafikonokon egy vagy két csillag jelzi.

3. Eredmények

3.1. A lágy korallhoz kapcsolódó aktinomikéta azonosítása S. Levinson

A megcélzott mikrobiális törzset a S. Levinson korallból izolálták, amely a Vörös-tengerben endemikus lágy korall. Ennek a korallnak a kolóniái jellemzően mély helyeken találhatók, mind a felső mezofotikus korallzátony-ökoszisztémákban (30–60 m), mind az alsó mezofotikus korallzátony ökoszisztémákban (60–105 m) [49]. Ezenkívül egy azooxantellát lágy korall, amely energiaigényét szűrőtakarmányozással nyeri, ezért az erős vízáramoknak kitett élőhelyeken megtalálható.

A 16S rRNS szekvencián alapuló filogenetikai elemzésből kiderült, hogy a TM223-S2 izolátum a Salinispora nemzetségbe tartozik (1. ábra).

Mivel a S. arenicola a 16S rRNS szekvencia alapján megkülönböztethető a S. Pacificától és a S. tropicától [50], ezt az izolátumot S. arenicola TM223-S2-nek neveztük el, Genbank hozzáférési számmal MW446171. A törzset az Anyagok és Módszerek részben leírtak szerint tenyésztettük, és etil-acetáttal, illetve metanollal extraháltuk. Az előzetes biológiai vizsgálatok azt mutatták, hogy a folyékony tenyészetből származó SA223-S2BAE kivonat és a szilárd tenyészetből származó etil-acetátos kivonat, az SA223-S2LAE nem mutatott jelentős biológiai aktivitást (S1. ábra). Ezért ebben a vizsgálatban csak a szilárd tenyészetből származó, a szilárd fázisú extrakcióhoz kapcsolódó SA223-S2BM metanolos kivonatot használtuk.

3.2. Az SA223-S2BM kivonat nem mutat toxicitást az emberi sejtekben, és aktiválja a PN kulcsfontosságú összetevőit

Először is megvizsgáltuk az SA{0}}S2BM hatását a normál bőr BJ-fibroblasztjai és az ember által immortalizált HaCaT keratinociták életképességére az MTT toxicitási vizsgálattal. Ebből a célból a sejteket 24 órán keresztül inkubáltuk a kivonat növekvő koncentrációival, és amint az a 2A1, A2 ábrán látható, a kivonat nem fejt ki citotoxikus hatást a két vizsgált sejtvonal egyikére sem 10 µg/ml koncentrációig. ; magasabb koncentrációban (10 µg/mL felett) a kivonat leginkább a HaCaT sejtekben csökkenti a sejtek életképességét.

Ezután megvizsgáltuk a kivonat hatását a sejtpályákra, amelyek biztosítják a sejt proteom stabilitását. Megfigyeltük, hogy a BJ fibroblasztok rövid távú (24 órás) expozíciója a vizsgált kivonattal szignifikánsan indukálta a PSMB7 proteaszóma gén expresszióját (10 µg/ml koncentrációban), míg ezzel párhuzamosan a PSMB7 proteaszóma gén expresszióját fokozta. PSMB6 gén azonos koncentrációban (2B1. ábra). Ezenkívül a kivonat a 20S proteaszóma gén, a PSMB6 és a 19S proteaszóma gén, az RPN11 expresszióját indukálta 1 µg/ml koncentrációban HaCaT sejtekben (2B2. ábra). Ezenkívül a BJ fibroblasztok 24 órás kivonattal történő kezelése a 20S 5 proteaszóma alegység expressziós szintjének enyhe indukciójához vezetett 1 µg/ml koncentráció mellett (2C. ábra). Eredményeink alátámasztására a kivonat expozíciója szignifikánsan növelte a kimotripszin-szerű proteaszóma aktivitást mind a BJ fibroblasztokban, mind a HaCaT keratinocitákban 24 órás inkubáció után (2D1, D2 ábra); a BJ és HaCaT sejtek vizsgált kivonat koncentrációinak eltérő eredményei sejttípus-specifikus hatásokra vezethetők vissza.

Ezenkívül a Q-RT-PCR expressziós elemzések kimutatták, hogy a BJ fibroblasztok 24 órás kivonattal történő kezelése az ALP-vel rokon gének, a CTSB, CTSL, CTSD és SQSTM1 expressziós szintjét indukálta 10 µg/ml koncentrációban. 3A1. ábra). Megfigyeltük továbbá, hogy a HaCaT sejtek 24 órás expozíciója a kivonatnak az ALP funkcionalitásban részt vevő gének (CTSB, CTSL, CTSD és SQSTM1) expressziós szintjének indukciójához vezetett (3A2. ábra).

Ezekkel a megállapításokkal összhangban az autofágiával kapcsolatos fehérjék BECN1 és SQSTM1/p62 felszabályozását észleltük, miután BJ fibroblasztokat 1 µg/ml koncentrációban exponáltunk (3B1. ábra); a BECN1 és SQSTM1/p62 fehérjék megnövekedett expressziós szintjei szintén megfigyelhetők voltak a HaCaT keratinocitákban mindkét vizsgált koncentrációnál (3B2. ábra). Ennek megfelelően azt találtuk, hogy a kivonat fokozta a lizoszómális katepsinek enzimaktivitását mind BJ, mind HaCaT sejtekben (3C1, C2 ábra); A BJ és HaCaT sejtek kivonatának vizsgált koncentrációinak eltérő eredményei szintén sejttípus-specifikus hatásokra vezethetők vissza.

Továbbá megvizsgáltuk a kivonat hatását a kulcsmolekuláris chaperonok expressziós szintjére. Így az immunoblot elemzések kimutatták, hogy a kivonat indukálta a CLU molekuláris chaperonok expressziós szintjét (mindkét vizsgált koncentrációban) BJ-sejtekben (3D1. ábra), valamint a HSP27-t (1 µg/ml) és a HSP70-t (mindkét koncentrációban). HaCaT sejtekben (3D2. ábra).

【További információ:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】