Jabuticaba (Myrciaria Jaboticaba) A héj, mint a foszfolipid vezikulák által szállított antocianinok és ellagitanninok fenntartható forrása az oxidatív stressz enyhítésére az emberi keratinocitákban 2. rész

Kérjük, vegye fel a kapcsolatotoscar.xiao@wecistanche.comTovábbi információk

2.3. Keratinocitákkal végzett in vitro vizsgálatok

2.3.1.A hólyagok biokompatibilitása

A transzferszómák, különösen a polimerekkel dúsított állatok fizikai-kémiai tulajdonságainak értékelésére végzett vizsgálat megerősítette nagyobb stabilitásukat és ideális méretüket a bőrön való alkalmazásra. Minden fontos különbséget a polimer koncentrációk függvényében észleltünk (1 vagy 2 mg/ml). Ennek értékeléséhez a következő vizsgálatok elvégzéséhez a legmagasabb polimer koncentrációval (2 mg/ml) módosított vezikulákat használtuk fel. Biokompatibilitásukat keratinociták felhasználásával értékeltük, és a vizes diszperzióban lévő kivonat biokompatibilitását is értékeltük, és összehasonlításként használtuk. A keratinocitákat azért választották, mert ezek az epidermisz legreprezentatívabb sejtjei, és rétegenkénti beállítást alkalmaztak, mivel különleges differenciálódásukban a bőr fő gátját képezik, amely szabályozza a bőr hidratáltságát és megakadályozza, hogy az exogén anyagok behatoljanak bele és azon keresztül. A keratinocitákat 48 órán át kezeltük diszperziós kivonattal, vagy négy különböző hígításban beépítettük a hólyagokba, majd megmérték a sejtek életképességét (3. ábra). A kivonattal inkubált sejtek életképessége diszperzióban ~88% volt (p<0.05 versus="" the="" viability="" measured="" using="" extract="" loaded="" vesicles),="" indicating="" that="" the="" extract="" is="" not="" toxic.="" the="" viability="" of="" cells="" treated="" with="" extract-loaded="" transfersomes="" and="" hyaluronan-transfersomes="" at="" higher="" dilutions="" was~100%="" (p="">0,05 e csoport között). A HE cellulóz-transzferszómákkal és hialuronan-transzferszómákkal végzett kezelés tovább javította a sejtek életképességét. Minden készítmény nagyon biokompatibilis volt, függetlenül a használt polimertől és hígítástól. Valójában a sejtek életképessége 100% -kal egyenlő vagy annál magasabb volt, még a vezikulum terhelésével járó proliferatív hatásról is tanúbizonyságot téve.

Kérjük, kattintson ide, ha többet szeretne megtudni

2.3.2. A kivonat diszperziós vagy vezikulákba töltött védő hatása a hidrogén-peroxid által keratinocitákban okozott károsodásokkal szemben

A keratinocitákat hidrogén-peroxiddal hangsúlyoztuk, majd a kivonattal diszperzióban kezeltük, vagy transzferszómákba töltöttük. A sejtek életképességét 4 órán keresztül mértük, és ezt használtuk a készítmények oxidatív stressz elleni védőhatásának értékelésére (4. ábra). A mintákat a sejtközeggel hígítottuk, hogy két különböző koncentrációt érjünk el (4 és 0,4 ug/ml). A hidrogén-peroxid-feszültség magas sejtpusztulást okozott, és akár ~50%-kal is csökkent az életképessége (p<0.05 versus="" the="" viability="" of="" cells="" treated="" with="" the="" extract="" in="" dispersion="" or="" loaded="" in="" vesicles)[35].="" hydrogen="" peroxide="" is="" considered="" one="" of="" the="" most="" dangerous="" oxidative="" molecules="" among="" the="" different="" reactive="" oxygen="" species,="" capable="" of="" promoting="" apoptosis="" and="" cell="" death.="" the="" treatment="" of="" stressed="" cells="" with="" the="" aqueous="" dispersion="" of="" the="" extract="" was="" capable="" of="" reducing="" the="" damaging="" effect="" of="" hydrogen="" peroxide="" as="" the="" viability="" increased="" up=""><0.05 versus="" the="" viability="" of="" cells="" treated="" with="" the="" extract="" loaded="" in="" hecelluose-transfersomes="" at="" a="" higher="" dilution="" and="" hyaluronan-transfersomes),="" although="" the="" complete="" restoration="" of="" normal="" conditions="" was="" not="" achieved="" (figure="" 4).="" treatment="" with="" the="" extract-loaded="" transfersomes="" protected="" the="" cell="" to="" the="" same="" extent="" as="" the="" extract="" in="" dispersion="" (~82%,p="">0,05 versus a diszperzióval kezelt sejtek életképességével szemben). A legjobb eredményt a HE cellulóz-transzferszómákkal (nagyobb hígításban) és hialuronán-transzferszómákkal töltött kivonat kapta, amely ~104%-os életképességet ért el(p<0.05 versus="" the="" values="" of="" other="" treatments).="" the="" restored="" normal="" conditions="" and="" even="" slightly="" promoted="" cell="" proliferation,="" probably="" due="" to="" the="" synergic="" effect="" of="" the="" extract="" and="" the="" polymer-immobilized="" vesicles.="" the="" vesicle="" behavior="" was="" not="" affected="" by="" the="" dilution="" levels="" of="" the="">

2.3.3. In vitro sebgyógyító hatások

Az in vitro karcolási vizsgálatot keratinociták monorétegével végeztük annak ellenőrzése érdekében, hogy a kivonat vizes diszperzióban képes-e, vagy vezikulákba építették be a sejtek proliferációjának és migrációjának stimulálására. Az üres hólyagokat nem vizsgálták, mivel egy korábbi vizsgálatban nem észleltek javulást a sebgyógyulásban, amikor üres hialuroszómákat használtak [37]. Az elvégzett seb lezárását 48 órán keresztül figyeltük (5. ábra), és a zárás%-át a sérülési területek mérésével számítottuk ki (6. ábra). A kezeletlen sejtek sebzárása nagyon lassan történt - 13% 24 óra, 28% 36 óra, és csak 40% 48 órakor. A kivonattal végzett kezelés vízben diszperzióban kissé javította a folyamatot, és a zárást 48 órán át 50% -ra emelte. Az extrahált vezikulákkal végzett kezelés 48 órán keresztül 90%-os zárást ért el transzferszómák és HE cellulóz-transzferszómák alkalmazása esetén, és körülbelül 100%-os zárást hialuronán-transzferszómák alkalmazásakor. Mint láthatjuk, a sebzárás szinte teljes volt, megerősítve a kivonattal töltött hialuronan-transzferszómák helyreállító tulajdonságait.

Általános eredményeink megerősítették a hialuronán-transzferszómák magas biokompatibilitását, amelyek szintén a leghatékonyabbak voltak a bőrsejtek proliferációjának és migrációjának stimulálásában, valamint az oxidatív stressz által a bőrben okozott károsodás ellensúlyozásában.

3. Anyagok és módszerek 3.1. Anyagok

A Lipoid S75-öt (amely ~70% szójafoszfatidilkolinból, 9% foszfatidil-jatanol-amint és 3% lizo-foszfatidilkolint tartalmaz) a Lipoid GmbH-tól (Ludwigshafen, Ger-many) vásárolták. Az alacsony molekulatömegű (200-400 kDa) és 1,4 Mw/Mn polidiszperzibilitású nátrium-hialuronátot a DSM Nutritional Products AG Branch Pentapharmtól (Svájc) vásárolták. A Tween 80, glicerin, DPPH gyök (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil), vas-klorid-hexahidrát, gallikus, kloogén és aszkorbinsavak, katechin, tetrazoliumsó, 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-vl)-2,5-difeniltetrazolium-bromid (MTT), kvercetin, Neosporin, Folin-Ciocalteu fenol reagens,2,4,6-trisz(2-piridil)-S-triazin(TPTZ) és pvrocatechol ibolya a Sigma-Aldrichtól (Milánó, Olaszország) vásárolták. A kálium-hexaciano-ferrátot (III.I.) a Merck(Darmstadt, Németország) segítségével nyertük. A vízmentes nátrium-acetátot, a réz-szulfát-pentahidrátot és a réz-klorid-dihidrátot vWR Chemi-cals BDH(8)(Frankfurt, Németország) anyagból nyertük. A cianidin-3-O-glükozidot (≥95%) és a delphinidin 3-O-glükozidot (≥95%) az Extrasynthese-től (Lyon, Franciaország) vásárolták. A jégecetet és a foszforsavat (85%) a J.T.Bakertől (Mallinckrodt Baker Inc., Utrecht, Hollandia) szerezték be. A sejttenyészethez használt összes reagenst és műanyagot a Life Technologies Europe-tól (Monza, Olaszország) vásárolták.

3.2. Jabuticaba Pees: extrakció, kémiai jellemzés és antioxidáns aktivitás

Jabuticaba gyümölcsök (Myrciaria jabuticaba (Vell.) O.Berg)cv. A Sabarát érett érési szakaszban szüretelték Araucaria városában, Paranåban, Brazíliában (földrajzi koordináták∶25°2924.7" S49°2637.8"W) 2018 decemberében. A gyümölcsöket megmostuk és fertőtlenítettük (NaOCl 100 mg/l/15 perc), leöblítettük és kézzel pépesítettük. A héjakat 35 °C-on 50 órán át szárítottuk, őröltük, hogy elérjük a 42 Tyler hálót, és gyorsított oldószer-elszívóban (ASE-350, Dionex, Sunnyvale, CA, USA) extraháltuk, 100 bar (98,7 atm) nyomást alkalmazva két extrakciós ciklusban 50 °C-on. Oldószerként citromsavval (pH 2,10)-vel savanyított vizet használtunk, és az extrakciókat négyszer megismételtük. Ezután a kivonatokat minőségi papírral szűrtük, és vákuum alatt 120 órán át fagyasztottuk. Ezt követően a százalékban kifejezett extrakciós hozamot az eljárás során felhasznált nyersanyagra vonatkozóan számították ki.

A Cistanche javíthatja az immunitást

Az összes kondenzált tannint (TPC, mg galluszsav-egyenérték 100 g-ra, mg GAE/100 g)az összes kondenzált tannint (TCT, mg katechin-egyenérték/100 g, mg CE/100 g), az összes flavonoidot (TF, mg CE/100 g) és az összes orto-difenol-tartalmat (TOD, mg klorogénsav-egyenérték 100 g-ra, mg CAE/100 g-ra) három példányban mértük UV-Vis spektrofotometriával a do Carmo és munkatársai által teljes mértékben leírt eljárások szerint. 20].

Az antocianinokat (cianid 3-O-glükozid és delphinidin 3-O-glükozid) nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) számszerűsítettük egy Sweetnt 1100 (Agilent Technologies Inc., Espoo, Finnország) eszközzel, amely diódasor-detektálással (DAD) van felszerelve. Az elválasztást gemini C18 oszloppal (150 mm×4,6 mm, 5 μm) végeztük, 5 μm acetonitril gradiens elúciójával, amelyet hangyasavval savanyítottak 5%- on. Az összes ellagitannin-tartalmat savas hidrolízis után határoztuk meg Mattila és Kumpulainen szerint [38], és galluszsavat határoztunk meg egy Inertsil ODS-3 oszloppal (150 mm ×4,0 mm, 3 μm) és az acetonitril gradiens elúciójával 50 mmol/l H3PO4-re (pH 2,5). Az elemzéseket három példányban végeztük, és az eredményeket mg/100 g-ban fejeztük ki. A főbb ellagitanninok és antocianinok jellemzésére ultra-nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát (UHPLC) és nagy felbontású tömegspektrometriát (MS) alkalmaztunk. Az Acquity UPLC-Xevo G2 QTOF tömegspektrométert (Waters, Milford, MA, USA) Water Acquity BEH C18 (1,7 μm,2,1 mm × 150 mm) oszloppal szerelték fel, és az elválasztást acetonitril gradiensével végeztük 0,1% hangyasavval savanyított vízzé, Santos et al. szerint [39]. Az áramlási sebesség 0,55 ml/perc volt, az oszlopos kemence hőmérséklete 45 °C, a befecskendezési térfogat pedig 1,0 μL volt. Negatív és pozitív üzemmódban elektrospray interfészt (ESI) használtunk -1 kV, illetve +0,5 kV kapilláris feszültséggel. Az Argont ütközésgázként használták. Az MS analíziseket adatfüggetlen beszerzési (MSE) centroid adatmodellel végeztük egy teljes vizsgálat m/z 50-1500-as vizsgálatban, 0,2 másodperces szkennelési idővel. Az MSE függvényben az MS prekurzorionjait széttöredezték, és nagy ütközési energiát mértek 25-ről 45 V-ra.

A kivonat antioxidáns aktivitását három példányban elemeztük különböző vizsgálatokkal: szabadgyök-tisztító aktivitás a DPPH gyökhöz viszonyítva, vas redukáló antioxidáns teljesítmény (FRAP), réz-ioncsökkentő antioxidáns kapacitás (CUPRAC), redukáló teljesítmény és Cu2+ kelátképző képesség. Az eredményeket mg GAE/100 g (redukáló teljesítmény), mg aszkorbinsav-egyenérték 100 g-ra, mg AAE/100 g(DPPH, FRAP és CUPRAC) és mg EDTA-egyenértékben/100 g-ban (fém kelátképzés) fejeztük ki. Az összes alkalmazott módszert korábban alaposan leírta Do Carmo et al. és Fidelis et al. [9,20].

3.3. Vezikulum előkészítése

Transzferszómákat, hidroxi-etil-cellulózzal dúsított transzferszómákat (HEcellulóz-thansferomes) és nátrium-hialuronáttal dúsított transzferszómákat (hialuronán-transzferszómákat) készítettünk foszfolipid (S75, 180 mg/ml), Tween 80(20 mg/ml), kivonat (40 mg/ml) kivonat (40 mg/ml) és polimer (hidroxi-etil-cellulóz vagy nátrium-hialuronát 1 és 2 mg/ml), adott esetben vízben történő diszpergálásával és a keverékek hidratálásában hagyva néhány órán át. Ezt követően a diszperziókat szonikáltuk (4 ciklus 2 az 5-ön 15,0μ amplitúdóból), 5 percet várva az egyes ciklusok között, hogy elősegítsük a hűtést és elkerüljük a minta túlmelegedését. Egy nagy teljesítményű Soniprep 150 szonikátort (MSE Crowley, London, EGYESÜLT KIRÁLYSÁG) használtak az összes diszperzió szonikálására annak érdekében, hogy kis méretű homogén rendszert kapjunk [15]. Ezzel az eljárással elkerülhető a készítményhez használt komponensek elvesztése, ami nagy mennyiségű, nagy mennyiségű kivonatot tartalmazó, nagy teljesítményű vezikulák képződéséhez vezet.

3.4. A hólyagok jellemzése

A hólyagok átlagos átmérőjét és polidiszperzitási indexét (a méreteloszlás szélességének dimenzió nélküli mértéke) foton korrelációs spektroszkópiával mértük Zetasizer Ultra (Malvern Instrument, UK) segítségével. Ugyanezt a berendezést használták a hólyagok zétapotenciáljának mérésére a részecskék elektroforetikus mobilitásának mérésével [40]. A mintákat a mérés előtt megfelelően hígítottuk, hogy optikailag tiszták legyenek, és elkerüljük a kimutatható szórt fény csökkenését. A vezikulákba ténylegesen beépített kivonat mennyiségének értékeléséhez a diszperziókat dialízissel tisztítottuk a nem beépített kivonatból. A vezikulum diszperziókat (1 ml) polikarbonát dialíziscsövekbe (Spektrumok/Pormembránok:12-14 kDa MW levágás, pórusokkal 3 nm-es vágással) helyeztük be; Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez, CA, USA), és desztillált vízbe [2 L] merítve 25 °C-on 2 órán keresztül, keverés közben. A vizet egy óra elteltével felfrissítettük, így 4 liter vizet használtunk fel az 1 ml vezikulum diszperzióba (40 mg) nem beépített bioaktív molekulák oldhatóságára. A vezikulum szuszpenziókban lévő kivonat mennyiségét a dialízis előtt és után számszerűsítettük, mérve antioxidáns aktivitásukat a DPPH vizsgálat segítségével. A vezikulák belsejében lévő kivonat beszorulási hatékonyságát a mintáknak a tisztítási folyamat előtti és utáni antioxidáns aktivitása közötti százalékos arányban számítottuk ki [41-43].

3.5. A vezikulák stabilitása a tárolás során

A diszperzióban lévő hólyagok stabilitását úgy értékeltük, hogy az átlagos méretüket, a polidiszperzibilitási indexet és a felületi töltést 90 napig figyeltük, miközben a diszperziókat szobahőmérsékleten (25± 1 °C) tartottuk.

3.6.A minták antioxidáns aktivitásának mérése a DPPH kolorimetriás teszt segítségével A hólyagokba töltött jabuticaba héjkivonat antioxidáns aktivitását a DPPH lebontására való képességének függvényében mérték. A diszperziókat (10 μL) hígítottuk (1∶100)DPPH(0,4 ug/ml) metanolos oldattal. A hígított mintákat szobahőmérsékleten és sötétben 30 percig tároltuk, majd az oldatok abszorbanciáját 517 nm-en UV spektrofotométerrel mértük. A készítmények antioxidáns aktivitását az (1) egyenlet szerint számítottuk ki: (1)Antioxidáns aktivitás%=[(ABSDPPH-ABSample)/ABSpPPH]×100

3.7.A minták biokompatibilitása és védő hatása a keratinociták oxidatív stressze ellen

A halhatatlanná vált emberi keratinocitákat (HaCaT) monorétegként termesztették 37 °C-on, 100% páratartalommal és 5% CO2-vel a Dulbecco módosított sasközeg (DMEM) magas glükózát használva, amelyet magzati szarvasmarhaszérummal, penicillinnel és sztreptomicinnel egészítettek ki növekedési közegként. A készítmények biokompatibilitásának értékeléséhez a sejteket 96 lyukú lemezekbe vetettük 7,5 × 10°-os sejt/lyuk sűrűséggel. 24 óra elteltével a sejteket 48 órán át jabuticaba kivonattal kezeltük vizes diszperzióban, vagy a DMEM-mel megfelelően hígított vezikulákba töltöttük, hogy elérjék a kivonat különböző koncentrációit (40, 4, 0,4 és 0,04 ug/ml). Az inkubáció végén minden vájathoz MTT-t [3(4,5-dimetil-tiazolil-2)-2, 5-difeniltetrazolium-bromidot](100 μL, 0,5 mg/ml végső koncentráció) adtunk, és három óra elteltével a képződött formazánkristályokat dimetil-szulfoxiddal oldottuk. Az egyes vájatok abszorbanciáját 570 nm-en mértük mikrolemez-olvasóval (Synergy 4 Reader, BioTek Instruments, AHSI S.p.A, Bernareggio, Olaszország). Minden kísérletet legalább háromszor megismételtünk, minden alkalommal háromszor. Az eredményeket a sejtek életképességének százalékában mutatjuk be a kezeletlen kontrollsejtekhez képest (100% -os életképesség).

Értékelték a készítmények in vitro védő hatását az oxidatív stressz okozta károsodások ellen is. A sejteket 96 lyukú lemezekbe vetettük, 7,5× 10cells/vájat sűrűséggel. 24 órás inkubálás után a sejteket hidrogén-peroxiddal hangsúlyoztuk (30%-ban hígítottuk 1:40 000 v/o PBS-sel), és vizes diszperzióban kezeltük a kivonattal, vagy vezikulákba töltöttük, és két különböző koncentráció elérésére hígítottuk (4 és 0,4 ug/ml,). A hidrogén-peroxiddal stresszes sejteket csak negatív kontrollként, míg a kezeletlen sejteket pozitív kontrollként használták. 4 órás inkubálás után a sejteket friss közeggel mostuk, és életképességüket az MTT-vizsgálat határozta meg. Az eredményeket a kezeletlen sejtek százalékában (100% -os életképesség) jelentették.

3.8. In vitro sebgyógyító tulajdonságok

A hólyagokba töltött jabuticaba héjkivonat képességét a bőrelváltozások átalakítására és gyógyulásuk elősegítésére úgy értékeltük, hogy a sejtes monorétegben lévő lézió mérésére szolgáló sejttágulást egy sejt monorétegben lévő lézión mérték. A sejteket 6 kútlemezen tenyésztettük, amíg el nem értük a teljes és homogén monoréteget. Lineáris sebet generáltunk steril műanyag pipettacsúcs segítségével. A szétszórt sejttöredékeket friss közeggel történő gyengéd mosással távolítottuk el. A vizes diszperziót vagy extraktummal töltött vezikulákat sejtközeggel hígítottuk legfeljebb 4 ug/ml extraktummal, és a léziós sejtes egyrétegű rétegek kezelésére használtuk. A sejtelváltozások megfigyelésre kerültek, és a képeket 24, 36 és 48 óra inkubálással rögzítettük egy 10× objektív optikai mikroszkóppal. A kezeletlen sejteket negatív kontrollként használtuk. A rögzített képek területi elváltozásait a Java J képszoftverével (http://rsb.info.nih.gov, hozzáférésük 2021 áprilisában-júniusában) mértük. A sebek lezárását a (2) egyenlet segítségével számítottuk ki:

ahol ao a sebesült terület közvetlenül a karcolás után, és a a a sebesült terület 24, 36 és 48 óra sebességgel mérve [44].

3.9. Statisztikai elemzés

Az eredményeket úgy fejezzük ki, ± a szórás és a szignifikancia átlagát 0,05-ös valószínűségi szinten (p) vizsgáltuk. A méret, a zéta-potenciál, a viszkozitás, a gyógyszerfelhalmozódás és a citotoxicitás tekintetében a variancia (ANOVA) egyirányú elemzését használtuk a csoportok közötti statisztikai különbségek alátámasztására, majd Tukey tesztjét, míg a Student t-tesztjét két minta összehasonlítására használtuk az XLStatistic for Excel segítségével.

4. Következtetések

A liofilizált jabuticaba héj kivonatot transzferszómákba és polimerekbe (hidroxi-etil-cellulóz és nátrium-hialuronát) dúsított transzferszómákba építettük be azzal a céllal, hogy stabilizálják a kivonatot és javítsák annak terápiás hatékonyságát. A kapott hólyagok kis méretűek és homogénen diszpergáltak voltak. Mindkét polimer hozzáadása csak valamivel nagyobb hólyagok kialakulásához vezetett, az alkalmazott polimer koncentrációk közötti különbségek nélkül. A polimerrel dúsított hólyagok ideálisnak tűntek helyi alkalmazásra, és képesek voltak a bioaktív anyagokban gazdag kivonatot nagy mennyiségben beépíteni. Különösen a foszfolipid, a Tween 80 és a nátrium-hialuronát kombinációját választották ki a hialuronán-transzferszómák előállításához, mint a stabilitás és a keratinocitákkal való kölcsönhatás képességének legjobb összetételét, mivel csak ezek a hólyagok voltak képesek hatékonyan ellensúlyozni a sejtekben a hidrogén-peroxid használata során okozott károsodást, és elősegíteni a sebgyógyulást az emberi keratinocitákban. Összességében eredményeink azt sugallták, hogy a hialuronán-transzferszómák ígéretes rendszert jelenthetnek a bőrbetegségek vagy az oxidatív stresszel kapcsolatos bőrsebek kezelésére. Ezenkívül először mutatjuk be a jabuticaba héj kivonat használatát bőrgyógyászati adagolórendszerben.

A szerző hozzájárulásai:D.G., M.L.M., M.M.: koncepcionálás, formális elemzés, adatgondozás, írás és áttekintés; I.C., M.A., J.H: formális elemzés és írás. Minden szerző elolvasta és elfogadta a kézirat megjelent változatát.

Finanszírozás:Ez a kutatás nem kapott külső finanszírozást. Intézményi Felülvizsgálati Testületi Nyilatkozat: Nem alkalmazható. Tájékoztatáson alapuló beleegyező nyilatkozat: Nem alkalmazandó.

Adat-rendelkezésre állási nyilatkozat:A nyers adatok rendelkezésre állnak, és közvetlenül a szerzőkhöz kérhetők.

Összeférhetetlenség:A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.

Minta rendelkezésre állása:A jaboticaba héjkivonat mintái a szerzőktől állnak rendelkezésre.

Ez a cikk a Molekulák 2021, 26, 6697-ből származik. https://doi.org/10.3390/molecules26216697 https://www.mdpi.com/journal/molecules