A normál és cisztás vese nephronjainak háromdimenziós felépítése

Kapcsolatfelvétel: emily.li@wecistanche.com

Thomas Blanc1,2,7, Nicolas Goudin3,7, Mohamad Zaidan1,4,7, Meriem Garfa Traore3, Frank Bienaime1,5, Lisa Turinsky1, Serge Garbay1, Cle´ment Nguyen1, Martine Burtin1, Ge´rard Friedlander1,6, Fabiola1,6 Terzi1,8 és Marco Pontoglio1,8

A Cistanche jót tesz a veséknek

KULCSSZAVAK: cisztás vesebetegség; vese; nefron; nephronophthisis;szövettisztítás

A veseműködés döntően függ a nefronok összetett háromdimenziós szerkezetétől. Alakjuk bármilyen torzulásához vezethetveseműködési zavar. A hagyományos szövettani módszerek jelentős korlátokat jelentenek a háromdimenziós szövet-rekonstrukcióban. Itt kombináltuk a szövettisztítást, a többfoton-mikroszkópiát és a digitális nyomkövetést az egyes nefronok fiziológiás és patológiás körülmények közötti rekonstrukciójához. Készleteknefronokfunkciójuk szerint eltérő helyen, alakban és méretben azonosították. Érdekes módon a nefronok hajlamosak síkban feküdni. Amikor ezt a technikát alkalmazták egy modellrecisztás vesebetegség, a ciszták csak meghatározott nefronszegmensekben fejlődtek ki. Ugyanazon szegmens mentén a ciszták szomszédosak a normál, nem tágult tubulusokban. Ezenkívül a ciszták alakja a nefron szegmensének megfelelően változott. Így eredményeink értékes stratégiát nyújtanak a vesék összetett szerkezetének egyetlen nefron szintjén történő megjelenítéséhez, és ami még fontosabb, alapot adnak a kóros folyamatok, például a cisztogenezis megértéséhez.

Fordítási nyilatkozat

A tisztítási módszerek egyedülálló eszközt nyújtanak annak megértéséhez, hogy a morfológiai változások hogyan vezetnek kóros következményekhez. A vesék olyan kritikus szervek, amelyek fenntartják a test homeosztázisát a víz, a metabolitok és az elektrolitok kezelésén keresztül, amelyek döntően a nefronok összetett 3-dimenziós szerkezetétől függenek. Ha ez a szerkezeti felépítés megváltozik, a vese patofiziológiája következik be. Jelen tanulmányunkban egy optikai törlésen alapuló hatékony módszert fejlesztettünk ki,

multifoton mikroszkópia és digitális nyomkövetés a vese egynefron szintjén történő tanulmányozására fiziológiás és patológiás körülmények között. Konkrétan egy policisztás vese első 3-dimenziós rekonstrukcióját biztosítjuk az egyes nefronok skáláján. Ez a módszer számos kóros összefüggésben alkalmazható, lehetővé téve a vesekárosodás összetett folyamatának jobb megértését, és ennek következtében célzottabb terápiás stratégiák kidolgozását.

A vese komplex 3-dimenziós (3D) nefronszerkezetén keresztül tartja fenn a test homeosztázisát. Ha ez a szerkezeti felépítés megváltozik, a vese patofiziológiája következik be.Krónikus vesebetegségekveseelváltozások kialakulása jellemzi. Érdekes módon a patológusok széleskörű heterogenitásról számoltak be a krónikus vesebetegségek során előforduló elváltozások eloszlásában.1,2 Ez azt a tényt tükrözi-e, hogy bizonyos nefronszegmensek eltérően sérülhetnek, vagy azt, hogy egyes nefronok eltérően hajlamosak a sérülésekre, mint egészre. , ismeretlen. A probléma megoldásához kötelező rekonstruálni a nefronok 3D alakját kóros összefüggésekben.

Tudomásunk szerint,nefronokcsak soros 2D metszetekkel rekonstruálták teljesen.3–5. Bár a szabványos szövettani metszetek nagy felbontást biztosítanak, a 3D rekonstrukciók munkaigényesek és nehezen kivitelezhetők. Ez elsősorban a mechanikai torzulásoknak köszönhető, ami a szeletelési eljárás elkerülhetetlen hatása. Ezenkívül a 2D-s képekből történő 3D-s rekonstrukció nem teszi lehetővé a 3D-s struktúrák közvetlen képalkotását az egész szövetekben.

A többfoton mikroszkópia javította azon képességünket, hogy vastag metszetekben morfológiai változásokat észleljünk. Jelentős korlát azonban a fényszórás miatti sekély elérhető mélység. A törésmutató-különbségek minimalizálásával a tisztítószerek drámaian javították a képmélység képét.6,7 Annak ellenére, hogy az első tisztítószert egy évszázaddal ezelőtt vezették be,8 csak a közelmúltban fejlesztettek ki több tisztító protokollt, főleg az agy számára. .9–17 A legújabb vizsgálatok kimutatták, hogy képesek más szilárd szervek, például máj, hasnyálmirigy vagy vese képalkotására is.18–26

cistanche vesebetegségre

Policisztás vesebetegség, egy genetikailag heterogén rendellenesség, amely számos ciliáris gén mutációjával jár, és a leggyakoribb örökletes vesebetegség.27,28 A policisztás vesebetegségre jellemző a ciszták kialakulása, amelyek a vese teljes pusztulásához vezetnek.28 Mikrodisszekciós vizsgálatok azt sugallták, hogy a ciszták vagy egy nephron szegmens "kiszorításaként" alakul ki, mint az autoszomális domináns policisztábanvesebetegség; mint a gyűjtőcsatornák (CD-k) ektatikus tágulása, mint az autoszomális recesszív policisztábanvesebetegség; vagy kizárólag medulláris tubulusokban, mint a nephronophthisis (NPHP) esetében.27,29 A ciszták 3D-ben történő fejlődése, valamint egymással és a normál szomszédos tubulusokkal való szerveződése azonban még mindig nem ismert.

Itt kombináltuk az optikai törlést a többfoton-mikroszkóppal, hogy új betekintést nyújtsunk a módjábanefronokfiziológiás körülmények között alakulnak és szerveződnek, és hogyan módosulnak a betegségek, például a cisztogenezis során. Eredményeink azt mutatják, hogy a nefronoknak 3 típusa van, és az erek befolyásolhatják a nefronok térbeli szerveződését. Érdekes módon megfigyeltük, hogy a nefronok hajlamosak meghatározott síkokban feküdni. Amikor ezt a technikát jck egereken alkalmaztuk, váratlanul azt figyeltük meg, hogy a ciszták csak meghatározott nefronszegmensekben fejlődtek ki, és a fusiform ciszták normál tubulusokkal keveredtek.

EREDMÉNYEK

Kísérleti elrendezés

Az egész alakjának tanulmányozásanefronokkörnyezetükkel kapcsolatban optikai tisztításon és multifoton mikroszkópián alapuló technikát alkalmaztunk (S1A kiegészítő ábra). A különböző optikai törlési protokollok összehasonlításával megállapítottuk, hogy a vese számára a benzil-alkohol / benzil-benzoát (BABB) volt a legmegfelelőbb a hatékonyság szempontjából (S1B és C kiegészítő ábra és S1 kiegészítő táblázat).

A 3D rekonstrukció és a digitális nyomkövetés kiváló minőségű képeket igényel nagy felbontással és magas jel-háttér aránnyal. Megfigyeltük, hogy a natív flfluoreszcencia által biztosított optikai jel nem volt egyenletes a vesemetszeteken. Különösen a medulla képei voltak rosszul kontrasztosak az alacsony jel-háttér aránnyal (S2 kiegészítő ábra). A jel-háttér arány javítása érdekében a metszeteket periodikus sav-Schiff-fel festettük meg (kiegészítő S1D ábra), mert tapasztalati úton megállapítottuk, hogy ez a festés nagy kontrasztot eredményezett a vékony metszetekben a 2-foton fluoreszcencia során. A jel azonban nem volt egyenletes a vastag periodikus sav-Schiff-festett vesemetszetekben (S1E kiegészítő ábra). Ezért a vesemetszeteket flfluorokróm-kapcsolt lektinekkel festettük meg: földimogyoró-agglutinin és búzacsíra-agglutinin, amely megfesti a glomerulusokat és tubulusokat, valamint Griffonia simplicifolia agglutinin, amely az ereket jelöli.30 ​​Figyelemre méltó, hogy ezen lektinek kombinációjával a jel-to- a háttérarány összességében drámaian megnövekedettvese szakaszok, jelentős javulással mind az xy síkban, mind a z tengelyben (S1E kiegészítő ábra és S1 kiegészítő film).

3D nephron szegmens vizualizáció

Az egész nefronok alakjának megjelenítéséhez nyomon követtük útjukat, a glomerulus vizeletpólusától kezdve és a CD-elágazásig (S2 kiegészítő film). Annak ellenére, hogy a felhasznált lektinek globálisan megkötik az összes nefronszegmentumot, észrevettük, hogy gondos vizsgálat során ezek a lektinek sajátos mintázattal jellemezhetők a különböző nefronszegmensek bazális vagy luminális membránjainak megfestésében. Más szavakkal, kihasználtuk a lektinfestés sztereotip mintáját a különböző nefronszegmensek azonosítására. Ily módon könnyen azonosíthatunk 6 entitást: proximális tubulus (PT), Henle-hurok vékony végtagja (TL), HL vastag felszálló végtagja (TAL), distalis csavart tubulus (DCT), összekötő tubulus (CNT) ), és CD-t. A PT és a TL közötti átmenetet a tipikus PT kefe határjelének hirtelen elvesztése és a lumenszélesség csökkenése jellemezte, ami gyakorlatilag hiányzott a TL-ben (1a. ábra). Ezzel szemben a TL és a TAL közötti átmenetet a külső csőátmérő jelentős növekedése és a viszonylag állandó lumenszélesség jellemezte (1b. ábra). Mindenbennefronok, a TAL átmenetét DCT-be szisztematikusan a glomerulus vaszkuláris pólusánál találták meg. Ezt az átmenetet a külső csőátmérő hirtelen megnövekedése jellemezte, amely túlnyomórészt a lumenátmérő jelentős növekedésének volt köszönhető (1c. ábra). A DCT és a CNT közötti átmenetet mind a csőátmérő, mind a lumen csökkenése jellemezte (1d. ábra). Végül a CNT és a corticalis CD közötti kapcsolatot a tubuláris átmérő és a lumen hirtelen növekedése jellemezte (1e. ábra). Ezeknek a morfológiai átmeneteknek a számszerűsítése statisztikailag szignifikáns volt (1f. ábra), és helytállóságát specifikus cső alakú markerekkel történő festéssel igazolták (S3-S5 kiegészítő ábrák és S3-S5 kiegészítő film).

A PT-k alakja és mérete mélységük szerint különbözik

A festés vastagvese szakaszoklehetővé tette, hogy nyomon kövessük a teljes PT szegmensek térbeli fejlődésének koordinátáit. Érdekes módon felfedeztük, hogy alakjuk rendkívül változó, és a glomerulusaik kéregben elfoglalt helyzete határozza meg. Globálisan 3 mintát azonosítottunk. Az első kor a legfelszínesebb nefronokra (SN-ekre) reagált (2a. ábra; S6 kiegészítő film), amelyek a kéreg legkülső részét foglalták el (a legkülső 30 százalékot közel a vesekapszulához). Tekervényes részeik kompakt struktúrákat alkottak, mindössze 6-7 kanyarulattal a saját glomerulusuk körül, és nagyon kis és szorosan tömött tereket foglaltak el. Ezeknek az SN-knek a konvolúciója hosszú és egyenes pars recta-ban végződött, amely a velőbe ereszkedett. Ennek a spektrumnak az ellenkező végén egy második mintázatot figyeltünk megnefronoka kéreg legmélyebb részében található (40 százalékkal nagyobb belső mélység), a velő (juxtamedulláris nephronok [JN-ek]) mellett (2a. ábra; S6 kiegészítő ábra és S6 kiegészítő film). PT-jüket egy kezdeti rövid hurok jellemezte, amely szisztematikusan a papilla felé ereszkedett, majd az U megfordult, hogy a vese kapszula felé emelkedjen. Az SN-ekkel ellentétben a JN proximális tekercses tubulusokat nagy tekercsek jellemezték, amelyek saját glomerulusuk körül fejlődtek ki, és nagy, lazán csomagolt doméneket foglaltak el a juxtamedulláris kéregben. A JN-ek PT-jének csavart része 10-15 konvolúciót tartalmazott, amelyek nagy doméneket alkottak. Végül a harmadik mintázat a kéreg középső részében található nefronokat tartalmazta (középső nefronok [MN-ek]) (2a ábra; S6 kiegészítő film). Érdekes módon ezeknek a tubulusoknak olyan alakja és térbeli orientációja volt, amely átmenetet jelentett az SN-ek és a JN-ek között. Valójában 8-9 konvolúciót tartalmaztak olyan tekercsekkel, amelyek nagyobbak voltak, mint az SN, de kisebbek a JN-eknél. Ezenkívül az MN-ek hosszabb pars recta-val rendelkeztek, mint a JN-ek. Érdekes módon a PT-k alakjának globális összehasonlítása azt mutatta, hogy az SN-ek és az MN-k homogén mintázatot mutattak, míg a JN-ek rendkívül heterogének voltak (S6 kiegészítő ábra). Ezenkívül számos nefron térbeli rekonstrukciója feltárta, hogy a PT-k soha nem keverednek egymással (S6 kiegészítő film), ami azt jelzi, hogy minden nefron saját egyéni teret foglal el a kéregben.

A morfometriai elemzések megerősítették az SN-ek és JN-ek méretében és alakjában fennálló nagy különbségeket, az MN-ek köztes szempontjával. A JN-ek PT-je több mint 2-szer hosszabb volt, mint az SN-ek PT-je (2b. ábra); az egyenesség azonban nagyobb volt az SN-ekben, mint a JN-ekben (2c. ábra), összhangban azzal a megfigyeléssel, hogy a JN-tubulusok sokkal kanyargósabbak voltak (2a ábra; S6 kiegészítő ábra).

1. ábra|A nefronszegmensek azonosítására használt morfológiai kritériumok. (a–e) A nefron különböző szegmenseinek morfológiája kontroll egerekben. A nefronokat a glomerulus vizeletpólusától a gyűjtőcsatornáig vezettük (proximális tubulus [PT]: türkiz; a Henle-hurok vékony szára [TL]: világosszürke; a Henle-hurok vastag felszálló ága [TAL]: sötétszürke; disztális csavart tubulus [DCT]: rózsaszín; összekötő tubulus [CNT]: sárga; kérgi gyűjtőcsatorna [CCD]: narancs). A nyilak a különböző nefronszegmensek átmérőjét jelzik. (Folytatás)

1. ábra|(Folytatás) (f) A különböző nefronszegmensek külső csőátmérőjének számszerűsítése. Az adatokat átlagos SEM-ként fejezzük ki. Varianciaanalízis, majd a Tukey-Kramer teszt: **P < 0.01,="" ***p=""><>

3. ábra|A háromdimenziós (3D) nefron rekonstrukció 3 különböző típusú nefront tár fel. (a) Reprezentatív 3D képek egy teljes nefronról (bal oldali panelek) a glomerulusoktól a gyűjtőcsatornáig a felületes kéregben (kék), a középső kéregben (zöld) és a juxtamedulláris régióban (piros) a kontroll egerekben. Nefronszegmentáció (jobb oldali panelek) a 3 különböző típusú nefronhoz. Rúd ¼ 150 mm. (b) A Henle-hurok 2 szára közötti távolság mennyiségi meghatározása a 3 típusú nefron esetében. c) A nefron hosszának számszerűsítése a (folytatás)

3. ábra|(folytatás) 3 fajta nefron. (d) A nefron különböző szakaszai hosszának számszerűsítése a nefron típusa szerint. Az adatokat átlag -SEM-ként fejezzük ki. Varianciaanalízis, majd a Tukey-Kramer teszt: juxtamedullaris nephron (JN) versus felületes nefron (SN): ###P < 0.001;="" jn="" versus="" középső="" nefron="" (mn):="" *="" p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001.="" cnt,="" összekötő="" cső;="" dct,="" distalis="" csavart="" tubulus;="" pt,="" proximális="" tubulus;="" tal,="" a="" henle-hurok="" vastag="" felszálló="" ága;="" tl,="" a="" henle="" hurok="" vékony="">

A glomeruláris mérete a mélységtől függően változik

Ezután elemeztük a 3 zóna mindegyikéből véletlenszerűen kiválasztott glomerulusok mélységét és átmérőjét. A morfometrikus elemzések kimutatták, hogy a glomerulusok átlagosan 783, illetve 355 mm-re helyezkedtek el a vesekapszulától a JN-ben, illetve SN-ben. Amint arról korábban beszámoltunk, megfigyeltük, hogy a glomerulusok mérete a mélységüktől függően változott. Különösen a JN-ek glomeruláris térfogata volt háromszor nagyobb, mint az SN-ek és az MN-ek (2d. ábra).

3D nephron rekonstrukció

Ezután nyomon követtük a teljes nefronok térbeli fejlődését a PT-től a CNT-ig. A 3D-s rekonstrukciójuk globális képe megerősítette, hogy a nefron alakja különbözött az SN-ek, MN-ek és JN-ek között (3a. ábra; S7 kiegészítő film). Ez a különbség főként a PT szerkezetének köszönhető. Ezenkívül megfigyeltük, hogy a HL eltérő 3D-s térbeli szerveződéssel rendelkezik. Különösen a TL és a TAL távolabbi elkülönülés a JN-ekben, mint az SN-ekben és az MN-ekben (3b. ábra). A morfometriai elemzések kimutatták, hogy a JN-ek globálisan 2-szer hosszabbak, mint az SN-ek (3c. ábra). A megnövekedett hossz arányosan eloszlott minden szegmensben, kivéve a TAL-t és a DCT-t, amelyek általában hasonló abszolút hosszúságúak voltak minden nefrontípusban (3d. ábra). Ez arra utalt, hogy a nephron megnyúlása meglepően homogén mintázatú folyamat.

Az íves erek befolyásolják a juxtamedulláris PT konvolúciót

Ahhoz, hogy átfogóbb perspektívát nyerjünk avese szerkezete, kihasználtuk a Griffonia simplicifolia agglutinin festést, amely lehetővé tette, hogy nyomon kövessük az íves ereket és azok ágait a kortikális sugárerekbe (4a ábra; S8 kiegészítő film). Érdekes módon a nefronok és erek egyidejű 3D-s rekonstrukciója azt mutatta, hogy az íves erek meglepően párhuzamos térbeli szerveződésben vannak a közeli tubulusokkal. Különösen azt figyeltük meg, hogy a specifikus JN-ek (korlátozott JN-ek) által követett útvonal általában a közeli ér útját követi (4b. ábra; S9 kiegészítő film). Figyelemre méltó, hogy ez a torzítás (csak a JN-nefronok egy részében figyelhető meg) felelős a PT alakjainak nagy heterogenitásáért (S6 kiegészítő ábra). A morfometriai elemzések kimutatták, hogy a „korlátozott” PT-k szignifikánsan hosszabbak és kanyargósabbak (csökkentett egyenesség), mint a „nem kényszerítettek” (4c. és d. ábra). Érdemes megjegyezni, hogy mind az SN-ek, mind az MN-ek csavart részei az íves erek felett helyezkedtek el, és nem voltak korlátozva.

A tubulusok hajlamosak síkban feküdni

Érdekes módon a nefronok 3D-s alakjának vizsgálata azt mutatta, hogy hajlamosak síkban feküdni (5a. ábra; S1 kiegészítő film0). Ennek a paraméternek a számszerűsítésére és a konformáció lehetséges statisztikai torzításának felmérésére megmértük a tubulusok általános hajlamát arra, hogy kihajoljanak a hurok által meghatározott síkból. Méréseink azt mutatták, hogy összehasonlítva a véletlenszerű séta szimulált modelljével, amelyet ugyanazzal az egymást követő mért szöggel és az egymást követő pontok közötti hosszúsággal generáltak (5b. ábra), a tubulusok a síktól való kisebb eltéréssel fejlődtek (5c. ábra). Ez arra utalt, hogy a tubulusok hajlamosak voltak korlátozni útjukat egy sík mentén. A megfigyelt különbségek statisztikailag erősen szignifikánsak voltak (P <>

A cistanche javíthatja a veseműködést

A 3D-s nephron rekonstrukció a ciszták fejlődésének sajátos mintáját tárja fel

Annak megállapítására, hogy protokollunk lehetővé teszi-e a nefronok nyomon követését rendezetlen patológiás szövetekben, jellemeztük a ciszták alakját és térbeli eloszlását jck egerekben, amelyek az NPHP és a cisztás betegség széles körben használt modellje.31–33 3D képek azt mutatták, hogy ennek ellenére A kiemelkedő ciszták megjelenése alapján a nefronok általános 3D-s lefolyása nem különbözött szignifikánsan a kontroll egerekétől (S11 kiegészítő film). Hasonlóképpen, a morfometriai elemzések megerősítették, hogy a nefronok globális hossza, glomeruláris térfogata és hosszanefronszegmens összehasonlítható volt a kontroll egerekével (S7 kiegészítő ábra). Megjegyzendő, hogy a ciszták kialakulása miatt nem tudtuk megkülönböztetni a TL-t a TAL-tól a HL-ben. Minden nefronban fusiform ciszták alakultak ki (S11 és S12 kiegészítő filmek). Az egyik legszembetűnőbb jellemző az volt a megfigyelés, hogy a fusiform cisztás tágulások ugyanazon a helyen több helyen is előfordultak.nefronszegmensben (S12 és S13 kiegészítő filmek). Érdekes módon megfigyeltük, hogy ciszták soha nem fejlődtek ki a PT-kben és a HL leszálló végtagokban (6a ábra; S12 kiegészítő film). Ezzel szemben túlnyomórészt a HL felszálló végtagjaiban, DCT-ben, CNT-ben és a CD-k felső részében mutatták ki őket, a CNT-vel folytonosan (6a. ábra; S12 kiegészítő film). Különösen azt figyeltük meg, hogy a DCT, valamint a CNT szegmensek sajátosan megnövelték a ciszták kialakulásának valószínűségét a megfelelő távolabbi részeikben (6b. ábra). A 3D rekonstrukciós képek kvantitatív morfometriai elemzése azt mutatta, hogy a teljes ciszta térfogatnefronkülönösen magas volt a CNT-ben (7a. ábra). Ezenkívül megfigyeltük, hogy a HL-ben és a DCT-ben a ciszták megnagyobbodása nagyobb volt JN-ben, mint SN-ben és MN-ben (7a ábra; S12 kiegészítő film). Ezenkívül a ciszta előfordulási gyakorisága szignifikánsan magasabb volt a JN-ekben, mint a többi típusú nefronban (7b. ábra). Azt is megfigyeltük, hogy az átlagos glomeruláris távolság (a legközelebbi 5 glomerulusra számítva) különösen megnőtt cisztás egerekben, különösen a felületesebb kéregben (S8 kiegészítő ábra).

Számos ciszta 3D-s rekonstrukciója feltárta, hogy rendkívül változó alakúak és térfogatúak (6c. ábra; S11 és S13 kiegészítő filmek). A HL felszálló végtagjában a ciszták kis átmérőjű fusiform alakúak voltak. A DCT-ben a ciszták meglehetősen gömb alakúak és nagyobbak voltak, és nem kitágult tubulusok közé helyezkedtek el. Érdekes módon a DCT és a CNT közötti átmenetet szisztematikusan egy normál, nem tágított szerkezet jellemezte. Ezzel szemben a CNT-ben szisztematikusan megfigyeltünk egy összefüggő tágult cisztás struktúrát, amely közvetlenül érintkezik a CD-vel. Érdekes módon a CD-ben ez a szerkezet fokozatosan normál tubulusméretre zsugorodott. Disztálisabban a CD összefüggő részében nem lehetett további cisztákat kimutatni. Egy másik következetes jellemző volt a ciszták sajátos térbeli szerveződése a HL felszálló végtagban. Valójában bár a ciszták mélyebbek és közelebb voltak a hurokhoz az SN-ekben, felületesebbek és közelebb voltak a DCT-hez a JN-ekben (6c. ábra). Ismét a ciszták köztes helyzetet foglaltak el az MN-ekben (6c. ábra).

5. ábra|A nefron tubulusok hajlamosak lapos szerkezetként fejlődni. (a) A nephron proximális tubulusának tipikus útja. Ez az út szemlélteti annak hajlamát, hogy egy síkban feküdjön. Az útvonal fejlődésének síkszerűsége jobban látható, ha megfelelően elforgatjuk és a megfigyelői nézőponthoz igazítjuk (lásd ugyanannak a csőszakasznak a jobb oldali ábrázolását, amely a bal oldalon egy másikon van ábrázolva szög). (b) Egy 4 szegmensből álló cső alakú út sematikus ábrázolása (egy adott cső alakú útvonalat meghatározó 5 pont között példaként látható). Az, hogy az utak milyen mértékben szoktak kimenni "síkjukból", az itt "béta"-ként jelzett szöggel ábrázolható. (Folytatás)

5. ábra|(Folytatás) Ezt a szöget a p3-p4 szakasz között mérjük a síkhoz képest (amelyet a közvetlenül megelőző p3, p2 és p1 pontok határoznak meg), és egy sötétszürke téglalap ábrázolja a sémában. A béta-szögek kiszámítását ezután rekurzív módon kiszámítottuk egy cső alakú útvonal pontkészlete mentén. Ezen béta szögek torzításának mértékének értékeléséhez véletlenszerű sétát szimuláltunk (Monte Carlo szimuláció [MCs]) az egyes cső alakú útvonalak egymás utáni alfa-szögeinek ugyanazon halmazával (az összes egymást követő szegmens között mérve). Ez a véletlenszerű gyaloglás útvonalat generált azonos alfa-szögekkel és véletlenszerű béta-szögekkel. (c) A béta-szögek globális eloszlásának és az MC-k eredményének hegedűdiagramja a proximális tubulusban (PT), a Henle-hurok vékony végtagjában (TL), a Henle-hurok vastag felszálló végtagjában (TAL), a disztális tekercses tubulusban ( DCT) és kötőtubulus (CNT). MCs, P <>

VITA

A hagyományos szövettani módszerek korlátozottak a nefronok globális alakját befolyásoló kóros elváltozások kimutatására. Itt bemutatunk egy hatékony, a szövettisztításon alapuló megközelítést, amely a vese felépítésével kapcsolatos kulcsfontosságú kérdéseket képes megoldani, példátlan térbeli részletekkel normál és patológiás körülmények között. Eredményeink 3 féle nefron létezését igazolták, amelyek elhelyezkedésükben, alakjukban és méretükben különböznek egymástól, összhangban funkcionális sajátosságukkal. Ezenkívül kimutattuk, hogy a nefronok hajlamosak síkban feküdni és alkalmazkodni az edények térbeli szerveződéséhez. Érdekes módon, amikor ezt a technikát egy modellre alkalmaztukcisztás vesebetegség, megfigyeltük, hogy ciszták alakulnak ki minden

nephronok, de csak meghatározott szegmensekben. Érdekes módon kimutattuk, hogy a ciszták alakja a nefron szegmenstől függően változik, és hogy ugyanazon nefron mentén a ciszták interkalálódnak normál, nem kitágult tubulusokkal. Összességében ezek az eredmények biztosítják a nefronok és erek térbeli elrendezésének első 3D jellemzését, és fontos alapot adnak egy kóros folyamat, például a cisztogenezis megértéséhez.

A vese optikai tisztítása kihívást jelent a magas autofluoreszcencia és sejtsűrűség miatt. A különböző elszámolási protokollok összehasonlításával a BABB-ben azonosítottunk egy hatékony technikát a legmélyebben elhelyezkedő struktúrák megjelenítésének és rekonstrukciójának megvalósítására.vese, vagyis a medulla. Ezenkívül a BABB gyors és méretezhető, és a törlés után a minták hónapokig tárolhatók a képfelvétel előtt. Ennek a technikának egy másik fő előnye az alacsony költség. A tisztítószerek a struktúrák zsugorodását vagy megnagyobbodását eredményezhetik.9–17 Mivel azonban a vese méretének ezek a módosulásai izotrópok, a relatív méréseket várhatóan nem befolyásolja, és nem torzítja az értelmezésüket. Az egyik legfontosabb korlát a struktúrák annotációja, amely rendkívül időigényes. Ennek ellenére egyre több olyan mélytanuláson alapuló technika létezik, amelyeknek gyorsan le kell küzdeniük ezt a korlátot.

A klasszikus technikákkal kapott eredményekkel összhangban vizsgálatunk kimutatta, hogy a nefronok alakjuk és hosszuk helyzetük szerint különbözik. Különösen azt figyeltük meg, hogy a JN-ekben fejlettebb csavarodott PT-k és nagyobb glomerulusok vannak, és kétszer hosszabbak, mint az SN-ek. A megnövekedett hossz harmonikus folyamat eredménye, mivel a megnyúlás arányosan érinti az összes nefron szegmenst. Azt is megfigyeltük, hogy a JN-eknek nagyobb a HL-je. Összességében ezek az adatok egyértelműen azt mutatják, hogy az SN-ek és a JN-k mikroanatómiája jelentősen eltér, és hogy az MN-ek köztes jellemzőket mutatnak. Érdekes módon fiziológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a nefronok funkcionálisan is különböznek egymástól.2 A különbségek hátterében álló morfogenetikai események még nem ismertek. Így csábító az a feltételezés, hogy a JN-ek sajátos szerkezete magyarázhatja funkcióik sajátosságát.

Érdekes módon a nefronok és az őket körülvevő erek 3D-s rekonstrukciójának első alkalommal történő biztosításával térbeli korlátot fedeztünk fel az íves erek és a nefronok egy alcsoportja között. Így elképzelhető, hogy az edények diktálhatják az utatnefronok34,35 A nefronok 3D-s alakjának vizsgálata számítási szimulációkkal kombinálva azt is feltárta, hogy a nefronok soha nem keverednek egymásba, és minden nefron hajlamos egy síkban feküdni. Ennek a megfigyelésnek a funkcionális jelentőségét még tisztázni kell.

Ciszta kialakulása soránpolicisztás vesebetegségmég mindig izgalmas folyamat. Az NPHP, a ciszta kialakulásával jellemezhető kóros állapot a leggyakoribb genetikai betegség, amely végstádiumú vesebetegséget okoz gyermekeknél és serdülőknél. Eddig húsz NPHP gént azonosítottak.36 Közülük a NEK8 a soha nem mitózisban A-val kapcsolatos kinázcsalád egy tagját kódolja, amely szerepet játszik a csillók működésében és a sejtciklus progressziójában.37 A Nek8-at eredetileg úgy jellemezték, hogy a gén mutált. jck egerek.32 Nevezetesen kimutatták, hogy ugyanabban a fehérjedoménben egy mutáció NPHP9-hez vezet emberben.{7}}D vizsgálatok azt sugallták, hogy a ciszták kialakulása drámaian eltér a policisztás vesebetegség különböző formái között.27,29 Különösen. Az NPHP-ben úgy tűnik, hogy a ciszták kizárólag CD-ből és DCT-ből származnak.31 Bár informatívak, ezek az immunhisztokémiai vizsgálatok nem vitatják azt a lehetőséget, hogy a specifikus tubuláris markerek elvesztése39 mesterségesen magyarázza ezt a megfigyelést. Így 3D-s vizsgálatunk az első egyértelmű bizonyítékot szolgáltatja arra vonatkozóan, hogy a ciszták kialakulása olyan folyamat, amely csak meghatározott nefronszegmenseket érinthet. Érdekes módon, bár a NIMA (Never In mitosis gene A)–Related Kinase 8 (NEK8) minden nefronszegmens citoplazmájában expresszálódik, a csillókban kifejeződése a DCT-re és a CD-re korlátozódik. Mivel csak ezek a szegmensek hajlamosak ciszták kialakulására,31 feltételezhetjük, hogy a NEK8 ciliáris funkciójának megzavarása a cisztaképződés döntő eseménye. Érdekes módon azt is megfigyeltük, hogy a fusiform ciszták folytonosságban vannak a normál, nem kitágult tubulusokkal. Az a tény, hogy a recesszív csíravonal-mutáció csak a sejtek egy részében vezet kóros fenotípushoz, arra utal, hogy egy második esemény ciszta kifejlődést válthat ki ezekben a sejtekben, amint azt az autoszomális domináns policiszta esetében javasolják.vesebetegség.40,41

Azt is megfigyeltük, hogy a ciszta megnagyobbodás dominánsabb JN-ben, mint SN-ben, legalábbis figyelembe véve a PT és a CNT között elhelyezkedő cisztákat. Következetesen arról számoltak be, hogy a glomerulosclerosis összefüggésében a glomeruláris elváltozások gyakrabban fordulnak elő JN-ben, mint SN-ben.nefronA glomeruláris fifiltrációs ráta és a transzport/enzimatikus aktivitások felelősek a JN-k megnövekedett érzékenységéért a romlásra, egy érdekes hipotézis, amely további vizsgálatot érdemel.

Összefoglalva, egy új technikát írunk le a vesék 3D-s képalkotására, megfelelő molekuláris specifitással és felbontással, hogy közvetlenül rögzítsük a specifikusan jelölt belső struktúrák (nefronok, erek és ciszták) térbeli és mennyiségi eloszlását. Tekintettel a kényelemre, a gyorsaságra és a közvetlen számszerűsítés lehetőségére, arra számítunk, hogy ez a technika a vesepatofiziológia megértésének hatékony eszközévé válik.

6. ábra|A háromdimenziós (3D) nephron rekonstrukció azt mutatja, hogy a ciszták csak meghatározott nefronszegmensekben fejlődnek ki. (a) Reprezentatív 3D képek egy teljes nefron (bal oldali panelek) cisztatérfogatú renderelésével a glomerulusoktól a gyűjtőcsatornáig a felületes kéregben (kék), a középső kéregben (zöld) és a juxtamedulláris régióban (piros) jck egerekben. Nefronszegmentáció (jobb oldali panelek) a 3 különböző típusú nefronhoz. Rúd ¼ 150 mm. (b) Ciszták kialakulásának valószínűsége a különböző nefronszegmensekben jck egerekben. (Folytatás)

6. ábra|(Folytatás) A vízszintes tengely a nefronok normalizált hossza, amely 50 tartálynak felel meg (proximális tubulus [PT], türkiz; Henle hurok [HL], fehér; disztális tekercses tubulus [DCT], rózsaszín; összekötő tubulus [CNT], sárga) . (c) Reprezentatív 3D ciszták rekonstrukciós képek a HL (bal oldali panelek), a DCT-k (középső panelek) és a CNT-k és a kérgi gyűjtőcsatornák (CCD-k) (jobb oldali panelek) felszálló végtagjának cisztatérfogat-renderelésével a felületes (felső panelek), a középső részeken. (középső panelek) és juxtamedulláris (alsó panelek) nefronok jck egerekben. Rúd ¼ 50 mm.

MÓD

Állatok

Minden állatkísérletet jóváhagyott a "Services Vétérinaires de la Préfecture de Police de Paris" és az Université Paris Descartes etikai bizottsága. Két hónapos FVB/N egereket (n¼ 20) használtunk a vesetisztítás kísérleti feltételeinek beállítására. A vizsgálatot ezután 2-hetes jck hím egereken (n ¼ 4) és kontroll alomtársakon (n ¼ 3) végezték.

A veseszövetek előkészítése

Leölés előtt az egereket intrakardiális katéterezéssel perfundáltuk 25 ml heparinizált sóoldattal (1000 NE/l), majd 75 ml 4%-os paraformaldehiddel foszfáttal pufferelt sóoldatban (PBS). A kísérleteket xilazin (Rompun 2%, Bayer, Leverkusen, Németország, 6 mg/g testtömeg) és ketamin (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Franciaország, 120 mg/g testtömeg) érzéstelenítésben végezték.

A kitisztulási vizsgálatokhoz a veséket 4 százalékos paraformaldehidben fixáltuk 4 órán keresztül, majd 4 százalékos agarózba ágyaztuk, és 1,4 mm vastagságú vesecsontot körülvevő metszeteket vágtunk, és PBS-ben 4 C-on tároltuk.Vese szakaszokelőször megfestették, majd kitisztították.

Vékony metszeteken végzett immunhisztokémiai vizsgálatokhoz,veseegy éjszakán át 4 százalékos paraformaldehidben rögzítettük, majd paraffinba ágyazott és 4- mm-es metszeteket vágtunk.

Festés

Periodikus sav-Schiff festés. Az 1,{1}} mm-es vesemetszeteket tiszta vagy 1:100 arányban PBS-sel hígított periodinsav-Schiff-ben inkubáltuk 5 percig szobahőmérsékleten, mielőtt kitisztult volna.

Immunhisztokémia vékony paraffinbe ágyazott metszeteken. A paraffinba ágyazott vesék négy mikrométeres metszeteit melegítettük az antigén kinyeréséhez, és egy éjszakán át 4 C-on inkubáltuk flfluorokrómhoz kapcsolt lektinekkel a tubulusok nyomon követésére (rodamin-földimogyoró-agglutinin [RL-1072-5] és rodamin búzacsíra-agglutinin [RL{{gglutinin) 6}}], Vector Laboratories, Burlingame, CA, 1:200-ra hígítva) és szegmens-specifikus elsődleges antitesttel, amelyek különböző tubuláris szegmenseket ábrázolnak (biotinilált Lotus tetragonolobus lektin [B-1325], Vector Laboratories, 1 arányban hígítva: 100; egér anti-Calbindin D28K [D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Németország, 1:200 arányban hígítva; kecske anti-AQP2 [C-17], Santa Cruz, 1:200 hígítás) . Másnap a metszeteket a másodlagos antitesttel 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk (Alexa Fluor 488 konjugátum [S32354], Invitrogen; kecskeellenes Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; anti-egér Alexa Fluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; mindegyik 1:500 arányban hígítva), mielőtt 40,6-diamidino-2-fenil-indollal színezték volna. Minden kép Nikon Eclipse E800 mikroszkóppal (Champigny sur Marne, Franciaország) készült, és FiJi szoftverrel (1.50-es verzió) készült.

Lektin festés vastag metszeteken. Az 1.5-mm vastag vesemetszeteket 4 C-on 1 hónapig inkubáltuk Texas Red vagy flfluoreszcein izotiocianáthoz kapcsolt lektinekben: földimogyoró-agglutinin (RL-1072-5) és búzacsíra-agglutinin (RL{{6}). }), 0,1% PBS-aziddal és 0,1% Triton-X-szel 1:100 arányban hígítva. A metszeteket ezután minden nap 2 héten át PBS-sel mostuk tisztítás előtt.

Optikai törlés

A pikkelytisztításhoz 15- mm-es vesemetszeteket ScaleA2-ben (4 M karbamid, 0,1 százalék Triton X-100, 10 százalék glicerin) vagy ScaleB4-ben inkubáltunk. (8 M karbamid, 0,1% Triton X-100) 2 hétig, legfeljebb 1 évig, 4 C-on.

A BABB-tisztításhoz 1,{1}} mm-es vesemetszeteket dehidratáltunk szobahőmérsékleten, egymást követő etanolos öblítésekkel. A mintákat ezután BABB-ben (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) 1:2 arányban inkubáltuk legalább 2 napig 4 C-on.

Kétfotonos mikroszkópos képfelvétel

A szöveteket vizes géllel leképeztük fordított többfoton mikroszkópon (LaVision BioTec), amely Mai Tai HP Titanium-Sapphire lézerrel (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) volt felszerelve (S1A kiegészítő ábra). A gerjesztési hullámhossz 815 nm volt a teljesítmény 8 százalékánál. 20-os vízbe merítő objektívet használtunk (XLUMPLFL20XW, Olympus [Tokió, Japán]; numerikus rekesznyílás 0,95; munkatávolság 2,0 mm). A flfluoreszcencia felvételéhez nem deszkennelt detektort használtunk 80 százalékon, 593/40 nm-es sávszűrővel.

Az első lépés a 2D mozaik képfelvételből állt a középső z kötegnél, szuboptimális felvételi paraméterek (400 mm 400 mm és 1011 1011 pixel, 10 százalékos átfedéssel és 2-es átlagos vonallal) felhasználásával, a legrelevánsabb központi fimezők kiválasztásához. (S9A kiegészítő ábra). Miután meghatároztuk az xy rácsot és a z fifieldet, a paramétereket beállítottuk, hogy kiváló minőségű képeket kapjunk. Egy ilyen megközelítés az érdeklődési területet 5 12 fifieldre csökkentette z veremenként. Ezután 850 z-es kötegeket/optikai szeleteket szereztünk (1-mm-es lépésméret), amelyek körülveszik a vesehilumot a vese középső részén.vese szakasz.

Képek összefűzése, feldolgozása és nyomkövetése

Mindegyik köteg a Preibisch és munkatársai által kifejlesztett módszer szerint csempézett, 43 amely lehetővé teszi nagy képgyűjtemény összefűzését a Fiji-szigeteki szoftver "Rács/Collection stitching" pluginjával (http://fifiji.sc/Fiji) . Mivel az összeillesztés után fontos eltolódást figyeltünk meg 2 szomszédos kép között, Pythonban egyedi illesztőprogramot írtunk. Ez a program kompenzálja a képeltolódást, lehetővé téve a képek helyes igazítását (S9B kiegészítő ábra). Az összefűzött-javított képeket az Imaris 8.4.2-es verziójával elemeztük (Bitplane, Zürich, Svájc). A tubulusokat és az ereket az Imaris fifilamentum nyomkövető csomagjának manuális módjával követtük nyomon, és egy Imaris Xtension csatlakozott hozzájuk, amelyet a MATLAB-bal fejlesztettünk (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Csatlakozás{12) }} Filament_Tool.zip?dl¼0) (S9C kiegészítő ábra). A glomerulusokat és a cisztákat 3D-ben rekonstruáltuk az Imaris felületi csomagjának manuális módszerével. A 3D glomerulusok térbeli szerveződését az Imaris foltcsomagjának manuális üzemmódjában jelenítettük meg.

Morphometry

A tubuláris szegmens hosszát, a nefron hosszát és az egyenességet az Imaris fifilament tracer csomagjával határoztuk meg. Az Imaris szoftver szerint az egyenességet a 2 pont távolsága és a nefron szegmens útvonalának hosszának arányában határoztuk meg. 31 PT-t és 12 teljes nefront rekonstruáltunk és mértünk 3 vad típusú egérben, míg 37 PT-t és 17 teljes nefront rekonstruáltunk és mértünk 4 jck egérben. Ciszta és

A glomeruláris térfogatokat az Imaris "felszíni csomagja" segítségével határoztuk meg. Vad típusú, illetve jck egerekben harmincegy, illetve 34 glomerulust mértünk. Összesen hetvennégy cisztát mértek.

A csőszerű fordulatok "síkon kívüli" szögeit ("béta"-ként jelölve) a sík (amelyet 3 egymást követő pont határoz meg) és a tér következő, egymást követő negyedik pontjával jelzett irány között mértük (5b. ábra). A megfigyelt torzítás statisztikai jelentőségének értékeléséhez a béta szögek eloszlását szimuláltuk a béta szögek véletlenszerű elforgatásával (Monte Carlo szimuláció) olyan struktúrákban, amelyeket ugyanazok a szegmensek alkottak azonos alfa-szögkészlettel.

A cisztás elváltozás kialakulásának valószínűségének kiszámításáhoznefronszegmenseket, minden nefront a térben lévő pontok halmazával ábrázoltunk. Mindegyik pontot a ciszta jelenléte és a normál szerkezet és a szegmens típusa tekintetében annotáltuk. A valószínűséget minden egyes szabványos hosszúságnál (50 rekeszre állítva) a cisztás annotációval ellátott pontok száma és a tárolóban lévő pontok teljes száma közötti arányként számítottuk ki.

Az átlagos glomeruláris interdistance kiszámításához minden glomerulusra a legközelebbi 5 glomerulusra számított átlagos glomeruláris távolságot vettük figyelembe.

Adatelemzések és statisztikák

Az adatokat átlagos SEM-ként fejezzük ki. A kísérleti csoportok közötti különbségeket varianciaanalízissel értékeltük, majd ha szignifikáns volt (P < {0}}.05),="" tukey-kramer="" teszttel.="" amikor="" csak="" 2="" csoportot="" hasonlítottunk="" össze,="" a="" mann-whitney="" tesztet="" alkalmaztuk.="" a="" statisztikai="" elemzéseket="" graph="" prism="" szoftverrel="" (san="" diego,="" ca,="" 9.0.0="" verzió)="">

KÖZZÉTÉTEL

Egyik szerző sem nyilatkozott egymással versengő érdekekről.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönjük a Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese (LEAT), a Federative de Recherche Necker szövettani és képalkotó platformjainak a technikai segítségnyújtást. Köszönjük Pierre Isnardnak, Marie-Claire Gublernek és Nicolas Kuperwassernek a kézirat kritikus olvasását. Ezt a munkát az Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de la Recherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Ki vagyok én, Roche Pharma Research and Early Development (Bázel) támogatta. , Svájc), és Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Párizs, Franciaország).

A SZERZŐ HOZZÁJÁRULÁSAI

TB, NG és MZ tervezte és végezte el a kísérleteket és elemezte az adatokat. FB, LT, MGT és SG is végzett néhány kísérletet és elemezte az adatokat. Az MB és a CN végezte az egérkísérleteket. A kézirat megírásához TB és MZ is hozzájárult. GF átdolgozta a kéziratot. Az FT és az MP biztosította a koncepcionális keretet, megtervezte a tanulmányt, felügyelte a projektet és megírta a dolgozatot.

A cistanche tonizálhatja a vesét

KIEGÉSZÍTŐ ANYAG

Kiegészítő fájl (PDF)

S1 ábra. Kísérleti beállítás, gyűjtési eljárás és képfeldolgozás.

S2 ábra. Az autofluoreszcens jel határai xy és z felbontásban.

S3 ábra. Kétdimenziós kép a PT és TL közötti átmenetről 4- mm-es paraffinbe ágyazott vesemetszeteken.

S4 ábra. A TAL és a DCT közötti átmenet kétdimenziós képe 4- mm-es paraffinbe ágyazott vesemetszeteken.

S5 ábra. A DCT és a CNT közötti átmenet kétdimenziós képe 4- mm-es paraffinbe ágyazott vesemetszeteken.

S6 ábra. A háromdimenziós rekonstrukció a proximális tubulusok 3 különböző formáját tárja fel.

S7 ábra. A háromdimenziós rekonstrukció azt mutatja, hogy a ciszták nem befolyásolják a nefronok hosszát és szegmentációját.

S8 ábra. A glomerulusok sűrűsége a kontroll és a cisztás vesékben.

S9 ábra. Beszerzési eljárás és utókezelési képfeldolgozás.

S1 táblázat. Az elszámolási módszerek összehasonlítása. Kiegészítő fájl (filmek)

S1 film. A lektinfestés jelentősen javítja a felbontást és a jel-háttér arányt.

S2 film. Egy tubulus útjának nyomon követése.

S3 film. Egy kitisztult vese háromdimenziós rekonstrukciója, amely a proximális tubulus és a Henle-hurok vékony végtagja közötti találkozást mutatja.

S4 film. Egy kitisztult vese háromdimenziós rekonstrukciója, amely a Henle-hurok vastag felszálló végtagja és a disztális, csavarodott tubulus közötti találkozást mutatja.

S5 film. Egy kitisztult vese háromdimenziós rekonstrukciója, amely megmutatja a distalis csavart tubulus és az összekötő tubulus közötti találkozást.

S6 film. A proximális tubulusok alakja és mérete mélységük szerint különbözik.

S7 film. Háromdimenziós nephron rekonstrukció kontroll egerekben.

S8 film. Egy ér útjának nyomon követése egy íves értől a kérgi sugárerig.

S9 film. Az íves erek a juxtameduláris proximális tubulusok alakját modellezik.

S10 film. A nefronok hajlamosak egy síkban feküdni.

S11 film. A háromdimenziós nephron rekonstrukció sajátos mintát mutat a ciszta fejlődésére.

S12 film. A háromdimenziós nefronszegmentáció azt mutatja, hogy a ciszták meghatározott nefronszegmensekben fejlődnek ki.

S13 film. A nefronok és erek térbeli elrendezése és kölcsönhatása policisztás vesében

IRODALOM

1. Gazdag AR. A juxtamedullaris glomerulusok eddig nem leírt sebezhetősége lipoid nephrosisban. Bull Johns Hopkins Hosp. 1957;100:173–186.

2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. A nephron anatómiájának heterogenitása. Kidney Int Suppl. 1987;20:S25–S39.

3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB, et al. A patkány nefron háromdimenziós rekonstrukciója. Am J Physiol Physiol. 2014;306:F664–F671.

4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB és mtsai. Az egér proximális tubulusának digitális háromdimenziós rekonstrukciója és ultrastruktúrája. J Am Soc Nephrol. 2003;14:611–619.

5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn H, et al. Az egér nefron háromdimenziós rekonstrukciója. J Am Soc Nephrol. 2006;17:77–88.

6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Most már tisztán látjuk: optikai tisztítás és vesemorfometria. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2017;26:179–186.

7. Seo J, Choe M, Kim SY. Tisztítási és címkézési technikák nagyméretű biológiai szövetekhez. Mol Cells. 2016;39:439–446.

8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. Lipcse, Németország: S. Hierzel; 1914.

9. Hama H., Kurokawa H., Kawano H. és munkatársai. Skála: kémiai megközelítés az FL fluoreszcens képalkotáshoz és az átlátszó egéragy rekonstrukciójához. Nat Neurosci. 2011;14:1481–1488.

10. Ertürk A, Becker K, Jährling N, et al. Oldószerrel tisztított szervek háromdimenziós képalkotása 3DISCO segítségével. Nat Protoc. 2012;7:1983–1995.

11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P és munkatársai. ClearT: mosószer- és oldószermentes tisztítási módszer neuronális és nem neuronális szövetekhez. Fejlődés. 2013;140:1364–1368.

12. Ke MT, Imai T. Fixed agyminták optikai tisztítása SeeDB segítségével. Curr Protoc Neurosci. 2014;66:2.22.1–2.22.19.

13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY az idegrendszer feltérképezéséhez. Nat Methods. 2013;10:508–513.

14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. Advanced CLARITY az ép szövetek gyors és nagy felbontású képalkotásához. Nat Protoc. 2014;9:1682–1697.

15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP és mtsai. Egysejtű fenotipizálás átlátszó, ép szövetben az egész test tisztításával. Sejt. 2014;158: 945–958.

16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D és mtsai. Egész agy képalkotás egysejtű felbontással kémiai koktélok és számítógépes elemzés segítségével. Sejt. 2014;157:726–739.

17. Alanentalo T, Asayesh A, Morrison H és mtsai. Tomografikus molekuláris képalkotás és 3D-s kvantifikáció felnőtt egérszervekben. Nat Methods. 2007;4:31–33.

18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP és munkatársai. Tisztított egérszervek többfoton mikroszkópja. J Biomed Opt. 2010;15:036017.

19. Renier N, Wu Z, Simon DJ és társai. iDISCO: egyszerű, gyors módszer nagyméretű szövetminták immunjelölésére térfogati képalkotáshoz. Sejt. 2014; 159: 896–910.

20. Lee H, Park JH, Seo I és mtsai. A CLARITY elektroforetikus szövettisztító technológia továbbfejlesztett alkalmazása ép szilárd szervekre, beleértve az agyat, a hasnyálmirigyet, a májat, a vesét, a tüdőt és a beleket. BMC Dev Biol. 2014;14:1–7.

21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI, et al. A megnövekedett glomeruláris kapilláris nyomás és méret a glomerulosclerosis kialakulását közvetíti az SHR juxtamedullaris kéregben. Am J Physiol Physiol. 1998;274:F365–F373.

22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. A vese képalkotása: a fénytől a szuperfelbontású mikroszkópig. Nephrol Dial Transplant. 2021;36:19–28.

23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al. Háromdimenziós módszer validálása podociták számlálására és méretezésére teljes glomerulusokban. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3093–3104.

24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. A háromdimenziós architektúra szerepe a patkány vese belső velőjének vizeletkoncentráló mechanizmusában. Am J Physiol Physiol. 2008;295:F1271–F1285.

25. Saritas T, Puelles VG, Su XT et al. A vese optikai tisztítása a kálium által közvetített tubulusok átalakulását mutatja. Cell Rep. 2018;25:2668–2675.e3.

26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E, et al. A vese kombinált szerkezeti és funkcionális képalkotása jelentős axiális különbségeket tár fel a proximális tubulus endocitózisában. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2696–2712.

27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopathies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017;9:a028191.

28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, et al. Policisztás vesebetegség. Nat Rev Dis Prim. 2018; 4:50.

29. Wilson PD. Policisztás vesebetegség. N Engl J Med. 2004;350:151–164.

30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Változások a glikozilációs mintázatban egérvese embrionális fejlődése során, ahogy azt a lektin konjugátumok kimutatták. J Histochem Cytochem. 1987;35:55–65.

31. Smith LA, Bukanov NO, Husson H, et al. A policisztás vesebetegség kialakulása fiatalkori cisztás vese egerekben: betekintés a patogenezisbe, a ciliáris rendellenességekbe és az emberi betegség közös jellemzőibe. J Am Soc Nephrol. 2006;17:2821–2831.

32. Liu S, Lu W, Obara T et al. Egy új Nek-családba tartozó kináz hibája cisztás vesebetegséget okoz az egérben és a zebrahalban. Fejlődés. 2002;129:5839–5846.

33. Franke M, Baeßler B, Vechtel J és munkatársai. Mágneses rezonancia T2 térképezés és diffúziós súlyozott képalkotás a cisztogenezis és a terápiára adott válasz korai kimutatására policisztás vesebetegség egérmodelljében. Kidney Int. 2017;92:1544–1554. 34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B és mtsai. A nephron vaszkuláris specializációjának molekuláris meghatározói a vesében. Nat Commun. 2019;10: 5705.

35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Endothel-epiteliális kommunikáció policisztás vesebetegségben: a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor jelátvitel szerepe. Cell Signal. 2020;72:109624.

36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Sok gén – egy betegség? A nephronophthisis (NPHP) és az NPHP-vel összefüggő rendellenességek genetikája. Első Pediatr. 2017;5:287.

37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Sejtciklus szabályozása a proteinkinázok NEK családjával. J Cell Sci. 2012;125:4423–4433.

38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT, et al. A NEK8 mutációk befolyásolják a ciliáris és centroszomális lokalizációt, és nephronophthisist okozhatnak. J Am Soc Nephrol. 2008;19:587–592.

39. Wilson PD. Apiko-bazális polaritás a policisztás vesebetegség epitéliumában. Biochim Biophys Acta. 2011;1812:1239–1248.

40. Happé H, Leonhard WN, van der Wal A, et al. A Pkd1-deléciós egerekből származó vese toxikus tubulussérülése felgyorsítja a cisztogenezist, amelyet diszregulált planáris sejtpolaritás és kanonikus Wnt jelátviteli útvonalak kísérnek. Hum Mol Genet. 2009;18: 2532–2542.

41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, et al. Egy kritikus fejlődési kapcsoló határozza meg a vese ciszta képződésének kinetikáját a Pkd1 elvesztése után. Nat Med. 2007;13:1490–1495.

42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. A érési vesék mély kérgi glomerulusainak egyedi érzékenységének mechanizmusa súlyos fokális glomeruláris szklerózisra. Pediatr Res. 1990;28:270–276.

43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Csempés 3D mikroszkopikus képfelvételek globálisan optimális összefűzése. Bioinformatika. 2009;25: 1463–1465.