A vese epiteliális célzott mitokondriális transzkripciós faktor A hiánya súlyos cisztás betegséggel összefüggő progresszív mitokondriális kimerülést eredményez
Mar 23, 2022
Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ken Ishii, Hanako Kobayashi, Kensei Taguchi és társai.
BEVEZETÉS
A mitokondriális (mt) diszfunkció a gyakori vesebetegségek jól felismerhető patológiás jellemzője, és sejtkárosodást, gyulladást és fibrózist válthat ki. A vesében a tubuláris epiteliális sejtek nagymértékben függenek az oxidatív foszforilációból (OXPHOS) keletkező adenozin-trifoszfáttól (ATP), mivel több energiaigényes epiteliális transzport funkciót látnak el. Ezért a hatékony mt ATP termelés fenntartása elengedhetetlen a normál veseműködéshez és a szisztémás elektrolit homeosztázishoz. Ezenkívül a legújabb bizonyítékok azt mutatják, hogy a mitokondriumok jelentős szerepet játszanak a génszabályozásban, a sejtjelátvitelben és a sejtdifferenciációban a közbenső metabolitok és a reaktív oxigénfajták (ROS) létrehozása révén.2 Ezen előrelépések ellenére az mt jelátvitel szerepe a patogenezisben a gyakori vesebetegségek nem teljesen ismertek.
Az mt funkció vizsgálatához a vese homeosztázisában és patogenezisében, micélzott mitokondriális transzkripciós faktor A(TFAM). TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)egy sejtmag által kódolt faktor, amely nélkülözhetetlen az mt működéséhez, az mt kópiaszámának fenntartásához és az mt DNS szerkezeti stabilitásához, mivel szabályozza az mt genom replikációját és transzkripcióját a promoter DNS meghajlításával.3 Az emlős mt DNS 37 gént tartalmaz, amelyek közül 13 kódolja a légzési lánc komplex fehérje alegységei, 22 transzfer RNS-t és 2 riboszomális RNS-t kódol. És így,TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)közvetlenül részt vesz az mt elektrontranszport és az ATP szintézis szabályozásában olyan gének transzkripcióján keresztül, mint a mitokondriálisan kódolt citokróm b (MT-CYB), a mitokondriálisan kódolt citokróm c oxidáz 1. alegység (MT-CO1) és a mitokondriálisan kódolt szubunit membrán szintáz 6 (MT-ATP6).3 AnélkülTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A), a sejtek elveszítik ATP-termelési képességüket az OXPHOS-on keresztül, nem tudnak jelentős mennyiségű mt ROS-t előállítani, és fokozatosan kiürülnek a mitokondriumokból. - Genetikai vizsgálatok kimutatták, hogyTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)nélkülözhetetlen a normális embriogenezishez, mivel globális homozigótaTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)Az inaktiváció az embrionális 10.5. napon intrauterin letalitást eredményezett, míg a heterozigóta hiány, bár -40 százalékkal csökkentette az mt kópiaszámot, és légzési lánc hiányhoz vezetett, nem vezetett embrionális letalitáshoz. Így a genetikai célzásTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A) hasznos kísérleti stratégia a progresszív mt diszfunkció sejtdifferenciálódásban és szöveti homeosztázisban betöltött szerepének vizsgálatára. Sejttípus-specifikus feltételes inaktiválásaTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)azt javasolta, hogy az OXPHOS és/vagy mt ROS generálása kritikus fontosságú a sejtek differenciálódása, működése és normál fiziológiája szempontjából.{0}}o
A nukleáris vagy mt génmutációk miatt kialakuló elsődleges mt-rendellenességek vesebetegséggel járhatnak, amely leggyakrabban tubulointerstitialis sérülésként vagy izolált tubuláris diszfunkcióként nyilvánul meg.1,12 Bár egyes emberi betegségek, például neurodegeneratív rendellenességek, specifikus mutációk a TFAM-ban szerepet játszanak.(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)nem jelentettek vesebetegséget okozó. Újabban csökkentveTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)expresszióját a krónikus vesebetegséghez kapcsolták. Az mt integritás elvesztése miattTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)Az inaktiváció tubulointerstitialis megbetegedést és veseelégtelenséget okozott egerekben, ami részben az mt DNS stressz által kiváltott ciklikus GMP-AMP szintáz (cGAS)-interferon gének (STING) függő gyulladásos válaszok aktiválódásának tudható be.
Itt közöljük, hogy az egerek feltételesTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A) A sine oculis-szal összefüggő homeobox 2(SIX2)-t expresszáló nephron progenitor sejtekben bekövetkező inaktiváció súlyos cisztás betegségben szenved, és fiatal, fiatal egerekként idő előtt elpusztul veseelégtelenségben.TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/-egereket a nefronérés hibái jellemeztek, ami a mt kimerülésével, az OXPHOS csökkenésével és a glikolízis felé történő metabolikus eltolódással járt együtt.TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-7-vesehám. Tekintettel a cisztás betegség súlyosságáraTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-7-egereken elemeztük a policisztás vesebetegség (PKD) 2 egérmodelljét, amelyek vagy a policisztin-1 (Pkd1) vagy cisztin-1 (Cys1), valamint humán mutációiból származnak. autoszomális domináns policisztás vesebetegségben (ADPKD) szenvedő betegek szövetei. Ezt megállapítjukTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)mind az egér, mind a humán PKD szövetekből származó cisztákban szabályozatlan. Összességében tanulmányaink arra utalnak, hogy a TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)A diszreguláció és a mt-kiürülés a vese cisztás megbetegedések jellemző jellemzői, és hozzájárulhatnak patogenezisükhöz.
EREDMÉNYEK
TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)A SIX2 sejtvonalbeli sejtekben az inaktiváció súlyos cisztás betegséget okoz, ami veseelégtelenséget eredményez
A vesehámban lévő mt funkció vizsgálata érdekében inaktiváltukTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)HAT2-expresszáló progenitor sejtekben, amelyek a gyűjtőcsatorna (CD) kivételével az összes nefron szegmentumot eredményezik.15Ehhez kereszteztük aTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)floxed allél bakteriális mesterséges kromoszóma transzgenikus egerekkel, amelyek fokozott zöld fluoreszcens fehérje/Cre rekombináz fúziós fehérjét (eGFP/Cre) expresszálnak a Six2 promoter transzkripciós szabályozása alatt (la ábra)."Az egerek homozigótaTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)a floxed allélokat és az eGFP/Cre transzgén heterozigótáit (Six2-eGFP/Cre plus ; T fam) innentől kezdve Six2-Tfam-/- mutánsoknak nevezik. Hat 2-Tfam-/- egér a várt mendeli arányokkal született, és születésükkor szemrevételezéssel nem volt megkülönböztethető a Cre-alomtárs kontrolloktól. Azonban a testsúly különbségei a hat között2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)A {{0}}mutánsok és alomtárs kontrollok a szülés utáni napon (P)14 nyilvánvalóvá váltak (5,7±0,3 g a mutánsok, szemben a 7,5± 0,3 g a kontrollok,n{11} } mindegyik, P=0,004; S1 kiegészítő táblázat). Hat2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A) a mutáns egereket megnagyobbodott vesék jellemezték a kontrollokhoz képest (vese/testtömeg arány 1,45% ± 0,19% a mutánsoknál, vs.0,60% ±0,02% a kontrolloknál , n=4 mindegyik, P<0.001; figure="" lb,="" supplementary="" table="" s1)and="" died="" between="" age="" p20="" and="" p30(figure="" lb).="" juvenile="" lethality="" in="" the="" mutant="" cohort="" was="" associated="" with="" renal="" failure="" from="" severe="" cystic="" disease="" with="" blood="" urea="" nitrogen="" levels="" of="" 68.40±5.32="" mg/dl="" for="" mutant="" mice="" versus="" 16.8±2.0mg="" dl="" for="" controls(n="6" and="" 7,="" respectively;=""><0.0001; figure="" lb="" and="" c).="" furthermore,="">TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-7- mutánsoknál jelentős albuminuria alakult ki (a vizelet albumin/kreatinin aránya=362,4 ± 75,18 mg/g hatban2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)--mutánsok vs. 43,58±3,39 mg/g a kontrollokban P14-nél, n=6-nál és 10-nél;P<0.0001). this="" is="" consistent="" with="" the="" expression="" pattern="" of="" cre="" recombinase="" in="" six2="" nephron="" progenitor="" cells,="" which="" give="" rise="" to="" cap="" mesenchyme-derived="" renal="" tubules="" and="" podocytes.="" in="" contrast="" to="">TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-'mutánsok, heterozigóta egerekTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)A normálisan kialakult SIX2 progenitor sejtek hiánya termékeny volt, és nem alakult ki nyilvánvaló vesebetegség (S1 kiegészítő ábra).
1. ábra|A SIX2 sejtvonalbeli sejtekben a Tfam inaktivációja súlyos cisztás betegséget és veseelégtelenséget eredményez.(a) Egy vázlat, amely szemlélteti a kísérleti megközelítést és a célzott szekvenciák elhelyezkedését a Tfam floxed allélen belül. Az alomtárs kontrollból (Cre ) és hat {{0}}tenyészetből izolált teljes genomiális vese DNS polimeráz láncreakciós elemzése a születés utáni 7. napon (P); a nem rekombináló Tfam floxed allélt a 2-lox (2) jelöli; a rekombinált allél a 1-lox, a vad típusú allél a wt; þ vagy - jelzi a Six2-eGFP/Cre transzgén jelenlétét vagy hiányát. (b) Bal oldali panelek, fényképek a Cre-kontrollból származó vesékről és hat 2-Tfam egérről P20 éves korban. A vese tömegét (KW) a testtömeg százalékában (BW) fejezzük ki (n ¼ 4–14). Jobb oldali panelek, a vér karbamid-nitrogén (BUN) szintje a Cre alomtárs kontroll (co) és a Six{11}}Tfam egerekben P7 korban (n ¼ 7, illetve 6), valamint Kaplan-Meier túlélési görbék a Cre kontroll és a Six{ {16}}Tfam egerek a log-rank teszttel összehasonlítva (n ¼ 10–13). (c) Formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott vesemetszetek reprezentatív képei Cre-kontrollból és hat 2-Tfam egérből P7 és P29 korban, hematoxilinnel és eozinnal (H&E) festve, és immunhisztokémiával e-simaizom-aktinra elemezve. (ACTA2) és cluster differenciációs (CD) antigén 31. A számjelek cisztás struktúrákat, a csillagok pedig a glomerulusokat ábrázolják. ¼ 1 mm-es rudak a teljes vese keresztmetszeténél, 100 mm-es nagy teljesítményű H&E-képeknél és 50 mm-es IHC-képeknél. Az adatokat átlagos SEM-ként fejeztük ki, és a 2-farokú Student-féle t-teszttel elemeztük. ***P < 0,001.="" a="" kép="" megtekintésének="" optimalizálásához="" tekintse="" meg="" a="" cikk="" online="" változatát="" a="">www.kidney-international.org.
cistanche férfi előnyök
Hat elemzése2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/-egerek, amelyek a ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre riporter allélt is kifejezték, a továbbiakban Six2-mT/mG-nak nevezzük;TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-7 egér, ami azt jelzi, hogy a cisztás struktúrák túlnyomó többségeTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/-vesék (S3 kiegészítő ábra). Ezek az eredmények összhangban vannak a megnövekedett foszforilált extracelluláris szignál által szabályozott kináz (p-ERK) és -catenin szintjével hatban2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/- veseszövet (S3 kiegészítő ábra). Összességében adataink azt mutatják, hogy hat2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/ a vesék olyan molekuláris jellemzőket mutatnak, amelyek gyakran társulnak a vese cisztás betegségeivel.
A nephron érése hibás a hatban2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/egerek Mert akár több hétig is eltarthat, mire az egerek szövetspecifikusakTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)inaktivációs fejlődési patológiát, ezután megvizsgáltuk a vesebetegség kialakulásának időbeli lefolyását hatban2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A){{0}}egerek. P0, P7 és P14 korú kontroll és mutáns egerek veséit gyűjtöttük, és szövettani módszereket, immunfluoreszcens (IF) festést és génexpressziós elemzést használtunk teljes vese kivonatokban. Az IF SIX2 és E-cadherin festése P0 életkorban azt mutatta, hogy a kontroll és a Sic veséi{7}}TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/-szövettanilag hasonlóak voltak. A kortikális nefrogén zónás struktúrák, például a SIX2 plusz sapka mezenchima, az E-kadherint expresszáló uretercsúcsok és a születő nefron struktúrák, például a vesevezikulák, valamint a vessző- és S-alakú testek kialakulását nem blokkolták a Six-ben{{7} }TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-7- vese (2a. ábra). Ezek a szövettani eredmények összhangban voltak a nefrogén markereket kódoló gének expressziós szintjével. A Six2, a páros box 2 (Pax2), a LIM homeobox protein 1 (Lhx1) és a spalt-like transzkripciós faktor 1 (Sall) mRNS szintjei nem különböztek szignifikánsan a kontroll és a Six között2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/az egerek teljes vesében homogenizálódnak P0 vesékből (2b. ábra). Ez arra utaltTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)A SIX2 nephron pro-genitorokban végzett inaktiváció nem befolyásolta szignifikánsan a nefrogén struktúrák kialakulását.
2. ábra|Hat2-Tfam-7egerekben a nefronérés hibás.(a) Reprezentatív képek a Cre~ kontroll és a Six2-Tfam-/vese formalinnal fixált, paraffinba ágyazott metszeteiről a születés utáni napon (P) 0. A vesemetszeteket toluidinkékkel megfestettük, és immunfluoreszcenciával elemeztük a szinuszos oculushoz kapcsolódó homeobox 2(SIX2) és E-cadherin (ECAD) expresszióját illetően. Az uréterfákat szaggatott fehér vonalak jelölik. A sapka mesenchyma (CM), a vessző alakú test (CSB), az S-alakú test (SSB) és az uretercsúcs (UT) fel van tüntetve. (b) Bal oldali panel, a fejlődési markerek relatív mRNS expressziós szintje kvantitatív polimeráz láncreakcióval hat 2-Tfam-/mutáns teljes vesehomogenizátumában PO életkorban, összehasonlítva a Cre alomtárs kontrollokkal (egyenként n =6) ). Jobb panel, relatív glomeruláris (glom) és nefronszegmens-specifikus génexpresszió hat 2-Tfam7 mutáns teljes vesehomogenizátumában P7 éves korban, összehasonlítva a Cre-alomtárs kontrollokkal (egyenként n =4). PT, proximális tubulus; mTAL, Henle vastag felszálló ága; DT, disztális tubulus; CD, gyűjtőcsatorna. (c) Alcian-kék/periodikussav-Schiff (AB-PAS) festett vesemetszetek P0, P7 és P14 életkorban. A nyilak a PAS-pozitív tubulusokat jelzik ecsetszegéllyel, a csillagok a glomerulusokat, a számjelek pedig a cisztás tubulusokat, az AB-PAS képeknél=100 um, a toluidin kékkel festett képeknél és az IF-képeknél pedig 50 um. Az adatok átlag± SEM-ben vannak kifejezve;2-farkú Student-féle t-teszt;*P<><><0.001.agp1,aquaporin 1;agp2,aquaporin="" 2;lhx1,lim="" homeobox1;napi2a,="" sodium-phosphate="" cotransporter="" 2a;="" ncc,="" thiazide-sensitive="" sodium-chloride="" cotransporter;="" nkcc2,="" sodium-potassium-chloride="" cotransporter="" 2;pax2,="" paired="" box="" 2;="" sall1,="" spalt="" like="" transcription="" factor="" 1;="" scnn1a,="" epithelial="" sodium="" channel="" 1="" alpha="" subunit;="" trpv5,="" transient="" receptor="" potential="" cation="" channel="" subfamily="" v="" member="" 5;="" umod,="" uromodulin.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">www.kidney-international.org.
cistanche vélemények
Bár a születőben lévő nefronszerkezet képződését nem gátolta, az alciánkék/periodikus sav-Schiff és lótusz tetragonolobus lektinnel végzett festés hibás terminális nefronérést jelez Hatban2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A){{0}}egerek P0 korban. Alcian blue/periodikus sav-Schiff, amely megfesti a tubuláris alapmembránokat és a kefeszegélyt, és a lótusz tetragonolobus lektin, amely specifikus oligoszacharidokat azonosít a proximális tubulussejtek kefeszegélyében, egyaránt csökkent mutáns vesékben. A 2c. ábra az alcian blue/periodikus sav-Schiff festést mutatja a P0, P7 és P14 időpontokban. A Lotus tetragonolobus lektin hisztokémiája és a Wilms tumor 1 fehérje IF-festése a P0, P7 és P14 időpontokban az S4 kiegészítő ábrán látható. PO életkorban az a relatív terület, amely pozitívan festődött lótusz tetragonolobus lektinnel 2,10 százalék ±0,51 százalék és 0,39 százalék ± 0,1 százalék életkor P7 versus 6,25 százalék ± 0,28 százalék, illetve 6,2 százalék ±1,1 százalék a kontrolloknál (n=3-4, P=0,0004 és 0,0007; Kiegészítő S4 ábra). Ezekkel a szövettani eredményekkel összhangban van a glomeruláris és nefronszegmens-specifikus markereket kódoló gének expressziójának jelentős csökkenése: podocin, nephrin, aquaporin 1 (Agp1), nátrium-foszfát kotranszporter 2a (NaPi2a), uromodulin, nátrium-kálium-klorid kotranszporter 2 (Nkcc2) és a tiazidokra érzékeny nátrium-klorid kotranszporter (Ncc) in Six2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/ egerek (2b. ábra). Összességében ezek az adatok arra utalnak, hogy hat2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/- a vesékben fokozatosan csökken az érett proximális nefronszegmensek és glomerulusok száma.
Mivel a Six{0}}eGFP/Cre tevékenység eredményeTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-hiányos cap mesenchyma eredetű nephron szegmensek, előrejelzésünk szerint a húgyhólyag eredetű CD-hámsejtek érése nem lesz hatással hat2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/ vesék. Ezzel a felfogással összhangban van, hogy a Dolichos biflorus agglutininnel való festés, amely reakcióba lép az N-acetil-D-galaktózzal a disztális tubulusban és a CD-ben, a Dolichos biflorus agglutinin-pozitív struktúráinak relatív túlreprezentáltságát jelezte hatban2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/- vesék. P7 életkorban a Dolichos biflorus agglutininra pozitívan festődött területek a mutánsok teljes területének 13,91 százalékát ±0,9 százalékát tették ki, szemben a kontrollé 1,93 százalék ± 0,1 százalékkal (n {{11} }, P=0.0002; Kiegészítő S4 ábra). A nátriumcsatorna epiteliális 1 alfa alegységének (Scnnla) vagy az aquaporin 2 (Agp2) mRNS expressziója, amelyek mindkettő CD-hámsejtekben expresszálódnak, nem csökkent szignifikánsan a a vezérlő (2b. ábra).A hattal ellentétben2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/-vese,TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)inaktiváció a homeobox B7 (HOXB7) progenitor sejtekben, amelyek CD epiteliális sejteket eredményeznek, ami a CD nephron marker expressziójának elvesztését és enyhe tubuláris dilatációt, de nem cisztogenezist eredményez (kiegészítő S5 ábra). Összességében adataink azt mutatják, hogy a veszteség aTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)funkció a SIX2 progenitor sejtekben nem gátolja a születő nefron struktúrák fejlődését, de gátolja a terminális nefron érését.
TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/-ciszták hiányosak a közös nephron szegmens markerekből
A hisztogenetikai eredet jellemzéséreTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-7veseciszták, IF elemzéseket végeztünkTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/kidneys at age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter(distal tubule), and aquaporin 2(CD). The majority of cysts with a maximal diameter of>50 um did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation(Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 um-t az uromodulin intraluminális lerakódásai jellemeztek, ami a proximális tubulustól távolabbi nephron szegmensekből és a Henle leszálló hurokból való eredetre utalt (3b. ábra).
3. ábra ITfam-/cysták nem fejeznek ki közös nefronszegmens-specifikus markereket.(a)Representative images of formalin-fixed, paraffin-embedded kidney sections from Six2-mT/mG; Tfam-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2(AQP2)by immunofluorescence (IF). 4'6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 um. (b) Hat2-mT/mG formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott vesemetszeteinek reprezentatív képei; A Tfam-7egereket P14 korban eGFP-re és uromodulinra festette IF. A csillagok cisztákat ábrázolnak intraluminális uromodulinnal. Az intraluminális uromodulin jelenlétét vagy 50-100 um maximális átmérőjű cisztákban, vagy 100 um-nál nagyobb maximális átmérőjű cisztákban vizsgálták. Rúd =(a,b)100 um. A kép megtekintésének optimalizálásához tekintse meg ennek a cikknek az online változatát a www.nere-international.org címen.
Progresszív rendellenességek az mt funkcióban és morfológiábanTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-7-hámsejtek
A metabolikus következmények időbeli lefutásának jellemzéseTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)deléciónál először megvizsgáltuk a mRNS szintjétTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)ésTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)- szabályozott mt-Col, mt-Cyb és mt-Atp6 inTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/-vesék PO, P7 és P14 korban. Ahogy az várható volt,TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A), mt-Col, mt-Cyb és nt-Atp6 mRNS szintje jelentősen csökkent (4a. ábra). Az eGFP-vel jelölt T fam{5}} hámsejtek (Six2-mT/mG; Tfam-7egerek) szignifikánsan csökkentették az MT-CO1 fehérje expresszióját (S7 kiegészítő ábra). Az mt DNS kópiaszáma 63 százalékkal csökkent, ami összhangban van az mt kimerülésével, ami aTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)hiányosság (4a. ábra). Ezzel szemben a nikotinamid-adenin-dinukleotidot kódoló nukleáris gének expressziója: az ubikinon-oxidoreduktáz mag 3-as alegysége (Ndufs3) és a szukcinát-dehidrogenáz komplex flavoprotein A-alegysége (Sdha) nem változott P0 életkorban, de csökkent P14 P7 éves korban. (4a. ábra). Ezek az mt gén és fehérje analízis eredményei összhangban vannak a Tfam-/-epithelium mt kópiaszámának fokozatos csökkenésével.
Ezt követően a metabolikus hatásait vizsgáltukTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)inaktiváció a P7 életkorban izolált primer proximális tubulus epiteliális sejtekben (PTEC).TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-7 A PTEC-k szignifikáns csökkenést mutattak a bazális oxigénfogyasztás mértékében (40,77 ± 4,10 a mutánsok, vs. 61,75 ± 5,18 pmol/perc/10 sejt a kontrolloknál, n=3 egyenként, P= 0.034 ),ATP-kapcsolt légzés (33,11 ± 3,91 mutánsoknál vs. 46,92 ± 4,91 pmol/perc/10* sejt a kontrolloknál, n=3 mindegyik, P=0,093), maximális légzés (116,8 ± 4,91 14,19 mutánsoknál vs. 225,5 ± 13,55 pmol/perc/10* sejt a kontrolloknál, n= 3 egyenként, P=0,005) és tartalék légzési kapacitás (76,05 ± 10,18 mutánsoknál vs. 163,7 ± 163,7 ± 8,61 pmol/perc/10* sejt a kontrollokhoz, n=3 mindegyik, P= 0,003; 4b. ábra).
cistanche reddit
A mt kimerülés és károsodás mértékének további jellemzésére megvizsgáltukTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/- vesék transzmissziós elektronmikroszkóppal és 3-dimenziós strukturált megvilágítási mikroszkóppal (3D SIM). A P7 éves korban a mitokondriumok szabálytalan alakúak és léggömbszerűsödést mutattak, ami összhangban van a korábbi eredményekkel.TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)kiütött egerek. Transzmissziós elektronmikroszkópos analízis azt mutatta, hogy a mitokondriumok szerkezeti rendellenességei, mint például a megnövekedett méret és a kóros cristae, posztnatálisan előrehaladtak, mivel a mutánsok és a kontroll közötti morfológiai különbségek kevésbé voltak nyilvánvalóak P{0}} életkorban, és az életkorral súlyosbodtak (4c. ábra). ).3D SIM-kártyát használtunk a mt mennyiség és a hálózat méretének vizsgálatára hat2- mT/mG-ban;TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/ mutánsok összehasonlítva hat2-mT/mG kontroll egérrel P7 életkorban; Az mt térfogatot metszetenként 5-8 tubulus keresztmetszetében mértük, 25-40 eGFP-pozitív kortikális hámsejtet vizsgálva, amelyeket IF-festéssel festettek meg feszültségfüggő anion-szelektív 1-es csatornára. Azt találtuk, hogy az eGFP-pozitív sejtenkénti teljes mt-térfogat szignifikánsan csökkent (62,66 ± 16,46 um/sejt mutánsoknál vs.177,4±30,17 μm'/sejt a kontrolloknál, egyenként n=3 , P= 0.0289), és a teljes sejttérfogat arányának változásával járt együtt a teljes sejttérfogathoz viszonyított 0,230 ±0,01-ről a kontrollokban 0,089 ± 0,016-ra hatban. 2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-7 mutánsok (egyenként n= 3, P=0.0017; 4c. ábra). A maximális mt hálózat mérete, amely az összes vizsgált eGFP-pozitív cellában talált legnagyobb mt hálózatot méri, hatban csökkent2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/ vesék (143,2 ± 23,2 μm² mutánsoknál vs. 318,3 ± 49,45 um² kontrolloknál, mindegyik n= 3, P= 0,0327). Összességében az ultrastrukturális és SIM-leletek, valamint az mt gén- és fehérjeanalízis eredményei összhangban vannak az mt kópiaszámának progresszív csökkenésével.TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-7-hám.
4. ábra| A Tfam-/vese epitéliumot progresszív mitokondriális kimerülés jellemzi.(a) Mitokondriális (mt) génexpresszió kvantitatív polimeráz láncreakcióval a születés utáni életkorban (P){{0}}, P7 és P14 (szeres változás a kontrollhoz képest, mindegyik n =6) és mt DNS-tartalom (P7) a Cre~ alomtárs kontroll (co) és a Six{5}}Tfam-/egerek teljes vesehomogenizátumában. (b) Oxigénfogyasztási ráta (OCR) a Cre alomtárs kontrollból és hat 2-7családi veséből izolált primer proximális tubuláris epiteliális sejtekben (PTEC) 7 éves korban Seahorse XFe24 platformon. Reprezentatív OCR mérések oligomicin A-val (oligo A, adenozin-trifoszfát [ATP] szintáz gátlás), karbonil-cianid-p-trifluor-metoxifenil-hidrazonnal (FCCP, szétkapcsoló) és az oxidatív rotenon-foszfor inhibitoraival kezelt kontroll és Tfam{11}}PTEC-ekben és antimycin A(AA). Szintén látható a számított alap- és maximális légzés, az ATP-hez kötött légzés és a tartalék légzési kapacitás (mindegyik n =3). (c) Mitokondriumok ultrastrukturális elemzése transzmissziós elektronmikroszkóppal. Reprezentatív transzmissziós elektronmikroszkópos képek a Cre-kontroll és hat2-Tfam-7egerek vesemetszeteiről P0 és P7 korban, a piros nyilak a mitokondriumokat ábrázolják. Bar=500 nm. (d) Háromdimenziós strukturált megvilágító mikroszkópos felvételek Six2-mT/mG (co) és Six{24}}mT/mG vesemetszetekről; Tfam-/- egerek P7 korban. A fokozott zöld fluoreszcens fehérjét (eGFP), a citokróm c-oxidáz 4-es alegységét (COXⅣ) és a feszültségfüggő anion-szelektív csatornát (VDAC) immunfluoreszcenciával detektáltuk.4',6-diamidino-2-fenil-indol (DAP) ). szoftver (Oxford Instruments, Abingdon, Egyesült Királyság; n =3 mindegyik). Teljes (összes) mt térfogat (térfogat) eGFP-pozitív sejtenként (25-40 sejt/elemzett minta), a teljes mt térfogat aránya a teljes cellatérfogatonként, és az mt hálózat cellánkénti maximális (max.) méretét. Az mt hálózat méretét cső alakú keresztmetszetben határoztuk meg, keresztmetszetenként 5 cellával. Bars =4 um. Az adatok ábrázolva mint átlag± SEM, és Student-féle t-teszttel elemeztük *P<><><0.001, mt-atp6,="" mitochondrially="" encoded="" atp="" synthase="" membrane="" subunit="" 6;="" mt-co1,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" c="" oxidase="" 1;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b;="" ndufs3,="" nadh:="" ubiquinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" sdha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a;="" tfam,="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)hiánya a vese epiteliális anyagcseréjét a glikolízis irányába tolja el
A vesében található PTEC-ek zsírsav-oxidációt és OXPHOS-t használnak az ATP előállításához, és glükoneogenetikusak. fok Annak érdekében, hogy további betekintést nyerjünk a Tam inaktiválásával összefüggő metabolikus változásokba, RNS-szekvenálási elemzést végeztünk a Six-ből származó veséken2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/- és Cre~ alomtárs kontroll egerek P7 korban. Megállapítottuk, hogy a glikolízisben részt vevő kulcsfontosságú szabályozó gének, mint például a hexokináz 2 (Hk2) és az enoláz 2 (Eno2) felszabályozottak. Ezzel szemben a trikarbonsavciklusban részt vevő legtöbb gén expressziója csökkent (pl. izocitrát-dehidrogenáz 1[Idh1), csakúgy, mint a zsírsav-oxidációban részt vevő gének, mint például az acetil-koenzim A aciltranszferáz 1B(Acaalb), közepes láncú acil-koenzim A dehidrogenáz (Acadm) (5a és b ábra, S8 kiegészítő ábra). Összhangban a trikarbonsavciklus szabályozásában és a mutáns vesékben részt vevő gének csökkent expressziójával P7 életkorban Seahorse XFe24 platform használatával (Agilent, Santa Clara, CA). A mutáns PTEC-eket a bazális glikolízis szignifikáns növekedése jellemezte (protonkiáramlási sebesség=117,4 ± 12.07 pmol/perc a mutánsoknál és 73,34 ± 6,33 pmol/perc a kontrollnál, n{{25) }}, P=0.{{30}}032) és az mt oxigénfogyasztási ráta és a glikolitikus protonkiáramlás arányának csökkenése 0,73 ± 0,08-ról a kontrollban 0,34 ± 0,02-re mutáns PTEC-ekben (n=3,P=0,0074). Összességében ezek az adatok azt mutatjákTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/- az epiteliális sejtek metabolikus eltolódáson mentek keresztül az OXPHOS-ról és a zsírsav-oxidációról a glikolízis irányába (5d. ábra).
5. ábra A vese epiteliális mitokondriális transzkripciós faktor A (TFAM) hiánya fokozott glikolízissel és abnormális zsírsav-anyagcserével jár.(a) A metabolikus génexpresszió elemzése hat2-Tfam-/- és Cre-alomtárs kontroll (co) egérből izolált teljes vesekéreg RNS-szekvenálásával a szülés utáni nap (P) 7. életkorában (n {{6) }} minden egyes). Az ábrán a glikolízisben és a trikarbonsavciklusban részt vevő, eltérően szabályozott metabolikus gének láthatók. A statisztikailag szignifikánsan megnövekedett mRNS-expressziót mutató gének piros színnel, a csökkent expressziójú gének zöld színnel láthatók.(b) A kiválasztott, differenciálisan szabályozott gének mRNS expressziós szintjei kvantitatív polimeráz láncreakcióval (n=4-6). (c) Megváltozott zsírsav-anyagcsere hat2-7Tfam-7mutáns egérben. Reprezentatív képek olajvörös O-festett vesemetszetekről Six2-Tfam-7és Cre-alomtárs kontrollegerekből P14 éves korban. A nyilak az olajvörös O-pozitív cellákra mutatnak, a sián szám pedig a költségeket jelzi. Oszlop=10 um.(d) A Cre alomtárs kontrollból izolált primer proximális tubuláris epiteliális sejtek (PTEC) glikolitikus fluxusanalízise és hat 2-Tfam-/vese P7 éves korban (egyenként n=4) ) Seahorse XFe24 platformon. Az ábrán a glikolitikus proton kiáramlási sebesség (gliko PER) reprezentatív mérései láthatók a kontroll és a Tfam{21}}PTEC-ekben, amelyeket 2-dezoxiglükózzal (2-}DG) és oxidatív foszforilációt gátló rotenonnal és antimycin A(AA) kezeltek. . Szintén látható az átlagos gliko PER alapvonalon, valamint a mitokondriális (mt) oxigénfogyasztási ráta (OCR) és a gliko PER aránya. Az adatokat átlag ± SEM formában adtuk meg, és a Student-féle t-próbával elemeztük. (Folytatás)
CsökkentTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)Az egér és humán PKD szövetekben történő expressziója az mt depléciójához kapcsolódik
Mert hat2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/ a vesék erősen hasonlítanak a PKD vesékhez, ezután megvizsgáltuk, hogy vajonTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)diszregulált volt a PKD szövetekben. Először megvizsgáltukTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)és a TFAM által szabályozott génexpresszió 2 jól bevált genetikai PKD egérmodellben.TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)Az mRNS szintek szignifikánsan csökkentek a Pkd1-/- és Cyspk/pk egerek teljes vese homogenizátumaiban, amelyek mutációkat hordoznak a Pkd1-ben vagy a Cys1-ben. Ez a mitokondriálisan és a nukleárisan kódolt mt gének expressziójának csökkenésével, valamint a glikolitikus gén expressziójának diszregulációjával volt összefüggésben. Hathoz hasonló2-TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)-/vesék, a Pkd1-7 és CysPkpk veséket az emelkedett Eno2 és Hk2, valamint szignifikánsan csökkent foszfoglicerát kináz (Pkg)1, piruvát-dehidrogenáz kináz (Pdk)1 és Pdk4 transzkriptum szintje jellemezte (6a. ábra).TFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)a fehérje expressziója, az IF-festéssel értékelve, csökkent a cisztát bélelő hámsejtekben, összehasonlítva a szomszédos, nem cisztás tubulusokból származó epiteliális sejtekkel (6b. ábra). Ez a csökkent mt-Co1 és mt-Atp6 expresszióval volt összefüggésben az RNS fluoreszcencia in situ hibridizációja révén (6b. ábra, S9 kiegészítő ábra); A 3D SIM-vel meghatározott mt térfogat 55 százalékkal csökkent a szomszédos, nem cisztás tubulusokból származó hámsejtekhez vagy a normál kontrollvesék PTEC-jéhez képest. Nem találtunk különbséget a normál kontroll PTEC-ek és a nem cisztás tubulusokból származó PTEC-k között a mt térfogatban (6c. ábra).
6. ábra| A mitokondriális transzkripciós faktor A (TFAM) expressziója csökken a Pkd1-7- és CysPkepk vesecisztákban.(a) A mitokondriálisan és a nukleárisan kódolt mitokondriális és glikolitikus gének relatív mRNS expressziós szintjei (a Cre alomtárs kontrollhoz képest) Pkd1-7-ban és Cyskidney-ben (n=3-5).(b) Reprezentatív képek a veséről a Pkd1-7 és az alomtárs kontroll egerek metszetei a születés utáni napon (P)22. Az ábrán láthatók a TFAM immunfluoreszcens (IF) festése és a mitokondriálisan kódolt citokróm c oxidáz 1 (mt-Co1) és a mitokondriálisan kódolt ATP szintáz membrán 6. alegység (mt-Atp6) transzkriptumok fluoreszcens in situ hibridizációja (RNS-FISH). A fehér nyilak azonosítják a cisztát bélelő hámsejteket, amelyekben erősen csökkent TFAM, mt-Co1 vagy mt-Atp6 expresszió. A glomerulusokat gl jelöli. A TFAM-ot expresszáló tubuláris struktúrákat vörös fluoreszcenciával azonosítjuk. A csillagok tubuláris hámsejteket mutatnak kimutatható mt-Co1 és mt-Atp6 transzkriptumokkal.4',6-diamidino-2-fenilindolt (DAPI) használtunk a magfestéshez (kék fluoreszcencia). oszlopok=25 um IF-képeknél és 10 μm RNA-FISH-képeknél. (c) Háromdimenziós strukturált megvilágítású mikroszkóp. A képeken Pkd1-7-vesékből származó vesemetszetek láthatók, amelyeket hisztokémiai elemzéssel lótusz tetragonolobus lektinnel (LTL) és IF-fel a citokróm c-oxidáz 4-es alegység (COXIV) és a feszültségfüggő anion-szelektív csatorna 1 (VDAC) expressziója szempontjából vizsgáltunk. A mitokondriális (mt) térfogatot Imaris szoftverrel határoztuk meg COXIV festés alapján. A nyilak a cisztát bélelő hámsejteket, a számjelek a ciszta luminát, a csillagok pedig a nem cisztás tubulusokat ábrázolják. A cisztát bélelő hámsejteket szaggatott vonalak körvonalazzák. Bar=10 μm a bal oldali panelen és 3 μum a jobb panelen. Az adatokat átlag ± SEM formában adtuk meg, és a Student-féle t-teszt *P segítségével elemeztük<><0.01, and=""><0.001.eno2, enolase="" 2;="" hk2,="" hexokinase="" 2;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b:="" ndufs3.="" nadhubiguinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" pdk1,="" pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 1;="" pdk4.pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 4;="" ppargc1a,="" peroxisome="" proliferator-activated="" receptor="" gamma="" coactivator="" 1-alpha:="" pgk1,="" phosphoglycerate="" kinase="" 1:="" ptec,="" proximal="" tubule="" epithelial="" cell;="" sudha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
Annak vizsgálatára, hogy a veszteségTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)expressziója a humán PKD közös molekuláris jellemzője, 5 ADPKD-beteg nephrectómiás mintáit elemeztük immunhisztokémiával, IF festéssel, RNS fluoreszcens in situ hibridizációval és 3D SIM-vel. CsökkentTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)expressziót az immunhisztokémiával elemzett vese ciszták 75,2 ± 7,5 százalékában figyeltek meg. Ez az MT-CO1 és MT-ATP6 csökkent expressziójával volt összefüggésben az RNS fluoreszcencia in situ hibridizációval (7a. ábra, S10. kiegészítő ábra); A cisztát bélelő hámsejtekben az mt térfogata körülbelül 70%-kal csökkent a 3D SIM-vizsgálat alapján (7b. ábra). Összességében 2 PKD egérmodell és humán ADPKD szövetek elemzése arra utaltTFAM(célzott mitokondriális transzkripciós faktor A)a hiány és az mt-kiürülés gyakori lelet a PKD-szövetekben, és valószínűleg befolyásolja a vese cisztás betegségének patogenezisét.
7. ábra| A mitokondriális transzkripciós faktor A (TFAM) expressziója csökkent policisztás vesebetegségben szenvedő betegek vese cisztáiban.(a) Normális emberi vesékből és policisztás vesebetegségben (PKD) származó betegek veséiből származó formalinnal fixált paraffinba ágyazott metszetek reprezentatív képei immunhisztokémiával TFAM expresszióra, immunfluoreszcenciával (IF) a feszültségfüggő anion-szelektív 1. csatornára (VDAC) ) expresszióját, valamint RNS fluoreszcens in situ hibridizációval mitokondriálisan kódolt citokróm c oxidáz 1 (MT-CO1) és mitokondriálisan kódolt ATP szintáz membrán 6-os alegység (MT-ATP6) mRNS expressziójához. , a csillagok pedig a glomerulusokat ábrázolják. Bar=100 μm kis nagyítású képeknél és 10 um nagy nagyítású képeknél (b) Reprezentatív 3-dimenziós strukturált megvilágítású mikroszkópos képek az emberi PKD vesemetszetekről IF segítségével VDAC expresszióra elemezve.4',{ A magfestéshez (kék fluoreszcencia) {17}}diamidino-2-fenil-indolt (DAPl) használtunk. A szaggatott vonalak a tubulusokat jelölik, a számjelek pedig a csőszerű vagy cisztás luminátot. A mitokondriális (mt) térfogatot az Imaris szoftverrel (n=5) határoztuk meg. Oszlop =4 μm. Az adatok átlag ± SEM-ként vannak ábrázolva, és a Student-féle t-teszttel elemeztük.*P<0.05. to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
