Hogyan használjunk vese-tonizáló formulát a MES23.5 sejtek oxidatív károsodásának védelmére?
Mar 16, 2022
Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Yihui Xu,1Wei Lin,2Shuifen Ye,3Huajin Wang,4Tingting Wang,5Youyan Su, 5Liangning Wu,6Yuanwang Wang,7Qian Xu,5Chuanshan Xu,8és Jing Cai 5 , *
Absztrakt
Oxidatív károsodáskritikus szerepet játszik a neurodegeneratív rendellenességek, köztük a Parkinson-kór (PD) etiológiájában. Tanulmányunkban egy ősi kínaivese-tonizálóA Cistanche-ból, Epimedii-ből és Polygonatum cirrhifolium-ból álló formulát a MES23.5 dopaminerg neuronok hidrogén-peroxid (H2O2-) által indukált ellen történő védelmére vizsgálták.oxidatív károsodás. A H2O2 káros hatásai aMES23.5 cellákvalamint a KTF védő hatásai ellenoxidatívA stresszt MTT-teszttel, transzmissziós elektronmikroszkóppal (TEM), immuncitokémiával (ICC), enzimkapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA) és immunoblot-vizsgálattal értékelték. Az eredmények azt mutatták, hogy a sejtek életképessége drámaian csökkent 12 órás 150 μM H2O2 expozíció után. A TEM megfigyelés szerint a H2O2-kezeltMES23.5 celláksejtorganellum-károsodást mutatott be. Ha azonban a sejteket KTF-fel (3,125, 6,25 és 12,5 ug/ml) inkubáltuk 24 órán keresztül a H2O2 expozíció után, jelentős védőhatást figyeltek meg a H2O{10}}indukált károsodással szembenMES23.5 cellák. ICC segítségével azt találtuk, hogy a KTF gátolta a H2O2 által indukált tirozin-hidroxiláz (TH) redukcióját, fokozta a HO-1, CAT és GPx-1 mRNS- és fehérjeexpresszióját, valamint csökkentette a kaszpáz 3. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a KTF védelmet nyújthat a neuronoknak a H2O2-indukált sejtkárosodás ellen, javítvaoxidatívEredményeink új potenciális stratégiát kínálnak a Parkinson-kór megelőzésére és kezelésére.
CISTANCHE HASZNÁLAT:Parkinson-kór kezelése
1. Bemutatkozás
A neurodegeneratív betegségek az utóbbi időben fontos népegészségügyi problémává váltak. A Parkinson-kór (PD) egy neurodegeneratív betegség, amelyet a substantia nigra dopaminerg neuronjainak fokozatos elvesztése jellemez. Annak ellenére, hogy a PD okát még tisztázni kell, több bizonyíték is ezt sugalljaoxidatív károsodásés a mitokondriális diszfunkció fontos szerepet játszik a PD kóros mechanizmusaiban [1–3]. Megnövekedettoxidatívközötti egyensúlyhiányból fakad a stresszoxidatívolyan termékek, mint a reaktív oxigénfajták (ROS) és antioxidáns molekulák a sejtben [4]. Az agysejtek antioxidatív kapacitásának fokozása hatékony stratégiává vált az idegsejtek oxidatív stresszel szembeni károsodásával szembeni védelmében.
A PD egy nehezen kezelhető betegség, amely világszerte fenyegeti az időseket. A jelenlegi terápiás gyógyszerek korlátozott hatékonysággal rendelkeznek, súlyos mellékhatásokkal. A hagyományos kínai gyógynövényeket és tápszereket már régóta széles körben használják a népi gyógyászatban a neurodegeneratív betegségek, köztük a PD kezelésére. A kínai orvoslás elmélete szerint a hiány avesea PD fő patológiás mechanizmusa. A Cistanche deserticola YC Ma, az Orobanchaceae családjába tartozó Cistanche faj, a hagyományos kínai orvoslásban jól ismert gyógynövény ún.vese-tonizálóhatékonyságát és kezelésére használjákvesehiány, női meddőség, morbid leucorrhea, neuraszténia és időskori székrekedés [5]. Beszámoltak arról, hogy a Cistanche teljes glikozidjai védő hatást fejtettek ki a substantia nigra dopaminerg neuronjaira egérmodellekben és PD sejtekben [6, 7]. Ezenkívül a Cistanche hatóanyagairól dokumentálták, hogy neuroprotektív hatást fejtenek ki azáltal, hogy fokozzák az antioxidáns kapacitást és gátolják a neuronok apoptózisát [8–15]. A Herba Epimedii szintén hagyományosvese-tonizálóJelentős antioxidáns hatású kínai gyógynövény, amelyet széles körben alkalmaznak csontritkulás és szív- és érrendszeri betegségek kezelésére, valamint a szexuális és neurológiai funkciók javítására [16]. A Polygonatum sibiricum-ot gyakran alkalmazzák asszisztensként az uralkodó gyógyszer hatékonyságának javítására és a hagyományos kínai receptben szereplő ministráns gyógyszer hatékonyságának javítására. Egy friss jelentés kimutatta, hogy a Polygonatum sibiricum vizes kivonatai természetes antioxidánsok.
Ezen előnyök alapján az ősi kínaiakvese-tonizálóképlet (KTF), amely Cistanche, Epimedii és Polygonatum cirrhifoliumból áll, feltételeztük, hogy a KTF megvédheti a MES23.5 dopaminerg neuronokat a hidrogén-peroxid (H2O2-) indukálta ellen.oxidatív károsodás. Itt a koncepció bizonyításaként kísérletsorozatot végeztünk a KTF sejthalálra és az antioxidáns enzimek expressziójára gyakorolt hatásának vizsgálatára a kezelt H2O2-ben.MES23.5 cellák.
A vese-tonizáló formula megvédi a MES23.5 sejtek oxidatív károsodását
2. Anyagok és módszerek
2.1. Vegyszerek és reagensek
A HO-1, CAT, kaszpáz 3 és -aktin antitesteket a Cell Signaling Technology Inc.-től (Boston, USA) szereztük be. A GPx-1 antitest az Abcam-tól (Cambridge Science Park, Egyesült Királyság) származott. A nyúl anti-tirozin-hidroxiláz a Boster-től (BA1454, Kína) származott. A torma-peroxidáz jelöléshez konjugált kecske anti-nyúl IgG1 a Santa Cruz Biotechnology Inc.-től (Kalifornia, USA) származott. A Dulbecco módosított Eagle táptalajt (DMEM) a GIBCO BRL Co. Ltd.-től (Gaithersburg, MD, USA) vásároltuk. Az összes többi reagens a Sigma Chemical Co.-tól származott (St. Louis, MO, USA), hacsak másképp nem jelezzük. A RevertAid™ First Strand cDNS Synthesis Kit a Fermentas Inc.-től (Burlington, USA) szerezte be. A DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) a Fermentas Inc.-től (Burlington, USA) származott. A Bio DL100 a BioFlux cégtől (Tokió, Japán) származott. A Polink-2 plus Polymer HRP Detection System for Rabbit Primary Antibody (PV-9001) és DAB (3,3′-diaminobenzidin-tetrahydrochloride) (ZLI-9032) a ZSGB-BIO-tól (Peking, Kína). A CAT, GPx-1 és GSH mérésére szolgáló ELISA készleteket a Hufeng Biotechnology Inc. (Sanghaj, Kína) szerezte be. A ginkgo biloba kivonat (GE) a Shanghai Sine Promod Pharmaceutical Co., Ltd.-től (Sanghaj, Kína) származott.
2.2. Vese-tonizáló formula készítése és szabványosítása
Az összetevők avese-tonizálóA tápszert, a Cistanche deserticola, az Epimedium brevicornum és a Polygonatum sibiricum fajokat a Fujian Hagyományos Kínai Orvostudományi Egyetem Second Affiliated People's Hospital szállította, és gondosan hitelesítették a kínai gyógyszerkönyv szerint (The Pharmacopoeia Commission of China, 2005). A KTF-minták elkészítéséhez Cistanche deserticola, Epimedium brevicornum és Polygonatum sibiricum 1 : 1 : 1,2 tömegarányban összekevertük és porrá őröltük, majd összesen 10-szeres (w/v) desztillált vízbe merítettük 1 órán át. h és 2 órán át forraljuk. Az oldat szűrése után a szűrletet összegyűjtjük. A teljes maradékot összegyűjtöttük, és további forraltuk összesen nyolcszoros (w/v) desztillált vízzel 2 órán át. Az oldatot szűrjük, a két szűrletet egyesítjük, bepároljuk és fagyasztva szárítjuk. A végső szárított kivonat hozama a kiindulási növényi nyersanyagok 25%-a (w/w) volt, és felhasználásig -20 fokon tároltuk. A KTF törzsoldatot (10 mg/ml) úgy állítottuk elő, hogy a KTF-et foszfát-pufferoldatban (PBS) feloldottuk, majd ultrahanggal kezeltük, 100 fokon sterilizáltuk és szűrtük.
2.3. Sejtkultúra és H2O2 kezelés
MES23.5 celláktenyésztettük és tették ki H2O2 hatásának, ahogy azt előző cikkünkben leírtuk [10]. Röviden,MES23.5 cellákDMEM/F12 (GIBCO BRL Co. Ltd., Gaithersburg, MD, USA) táptalajban tenyésztették, amely 5% (térfogat/térfogat) FBS-t tartalmazott (GIBCO BRL Co. Ltd., Gaithersburg, MD, USA), 1{{12} }0 egység penicillin/sztreptomicin, 2 mM L-glutamin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) és Sato's (50 × Sato: 25 mg inzulin; 25 mg transzfer; piroszőlősav, 243 mg; putreszcin 20 mg; 1 mg/ml nátrium-szelenát, 25 ul; 0,315 mg/ml progeszteron) 37 °C-on 5% CO2-tartalommal. Egyik napról a másikra nőttMES23.5 celláktovább inkubáltuk 150 μM H2O2-val 12 órán át.
2.4. KTF kezelés
MES23.5 cellákvéletlenszerűen kontrollcsoportra (friss táptalaj), H2O2 csoportra (H2O2 táptalaj), Ginkgo biloba kivonat (GE) csoportra (H2O2 és GE táptalaj) és KTF csoportokra osztották, beleértve az alacsony dózisú KTF kezelést, egy közepes adagot. FTF kezelés, és nagy dózisú KTF kezelés.MES23.5 celláka logaritmikus fázisban poli-L-lizinnel (PLL) bevont tenyésztőlemezre oltottuk 24 órán át. A kontrollcsoport sejtjeit friss tápközeggel, az összes többi csoport sejtjeit pedig 150 μM H2O2-t tartalmazó tápközeggel kezeltük 12 órán keresztül. A GE-csoport sejtjeit 12,5 ug/ml GE-t tartalmazó tápközeggel, az alacsony dózisú KTF-csoportban, a közepes dózisú KTF-csoportban és a nagy dózisú KTF-csoportban lévő sejteket pedig 3,125, 6,25 koncentrációjú KTF-fel kezeltük. és 12,5 ug/ml 24 órán keresztül.
2.5. Sejt életképesség
20 órás KTF-kezelés után a sejteket MTT-vel (0,5 mg/ml) 4 órán át 37 °C-on inkubáltuk, majd a tápközeget óvatosan eltávolítottuk, és 150 μl DMSO-t adtunk minden egyes lyukba. A formazán kristályokat 10 percig feloldottuk, és az abszorbanciát 490 nm-en mértük. Az egyes lyukak optikai sűrűségét (OD) spektrofotométerrel (BIO-TEK ELX 800, BioTek Instruments Inc., Vermont, USA) mértük. Negatív kontrollként friss sejttenyésztő tápközeget használtunk.
A vese-tonizáló formula megvédi a MES23.5 sejtek oxidatív károsodását
2.6. Ultrastrukturális morfológiai megfigyelés
24 órás KTF kezelés után a sejteket összegyűjtöttük, szuszpendáltuk, és 3 százalékos glutáraldehiddel fixáltuk 1,5 százalékos paraformaldehid oldatban (pH 7,3) 4 fokon 24 órán át. A sejtszuszpenziókat ezután kétszer öblítettük PBS-sel, majd utófixáltuk 1%-os ozminsavval és 1,5%-os kálium-hexaciano-ferrát (II) oldattal (pH 7,3), majd 4°C-on 2 órán át inkubáltuk; majd a sejtszuszpenziókat dehidratáltuk alkoholban, egyenként 5 percig. A dehidratált pelleteket háromszor propilén-oxiddal ágyaztuk be 1 órán át, majd gyanta/propilén-oxid keverékkel infiltráltuk 1:1 arányban 2 órán át, majd gyantával 12 órán át szobahőmérsékleten. A zárványt epoxigyantával 618 és Araldittal készítettük, és a polimerizációt 60 fokon 48 órán keresztül végeztük. Végül az ultravékony metszeteket (80 nm) uranil-acetáttal festettük, majd ólom-citráttal festettük 5 percig. A megfestett sejteket H7650 transzmissziós elektronmikroszkóppal (Hitachi, Japán) vizsgáltuk.
2.7. A tirozin-hidroxiláz (TH) immuncitokémiai vizsgálata
24 órás KTF-kezelés után a sejteket kétszer 2 percig mostuk PBS-sel, és 4 százalékos paraformaldehiddel fixáltuk 15 percig. A rögzített sejteket háromszor mostuk, majd 20 percig 0,5% Triton X-100-el kezeltük. Ezt követően a sejteket háromszor mostuk, és 10 percig 3 százalékos H2O2-vel kezeltük. A H2O2-kezelt sejteket háromszor mostuk, majd 20 percig kecskeszérummal blottoltuk. Blottolás után nyúl anti-TH-t (1:400) adtunk minden egyes mintához 4 fokon egy éjszakán át. A mintákat ezután háromszor mostuk, és 20 percig Polymer Helperrel kezeltük. Polimer kezelés után a sejteket háromszor mostuk, és poli-HRP anti-nyúl IgG-vel kezeltük 20 percig. A sejteket háromszor mostuk, és 3 percig DAB-val kezeltük. Végül a mintákat folyó vízzel mostuk és hematoxilin ellenfestéssel kezeltük 1 percig, majd folyó vízzel mostuk, és a legfontosabb rögzítőközeggel lezártuk.
2.8. Antioxidáns enzimek mérése ELISA-val
24 órás KTF kezelés után az intracelluláris CAT, GPx-1 és GSH aktivitási szintjét ELISA kit (Hufeng Biotechnology Inc., Shanghai, Kína) segítségével mértük a gyártó utasításai szerint. Röviden, a kezelt sejtek lizátumának 100 μL homogenizált felülúszóját adtuk az ELISA-lyukakba, majd 37 °C-on 30 percig inkubáltuk. Ötszöri mosás és szárítás után 50 μL enzimmel jelölt antitest munkaoldatot adtunk minden egyes lyukba (várható kontrollcső). A kapott oldatot 30 percig 37 °C-on inkubáltuk, ötször mostuk és szárítottuk. Szubsztrát munkaoldatot (150 μL) adtunk minden egyes lyukhoz, és 15 percig 37 °C-on inkubáltuk. Végül egy stop oldatot (50 μL) adtunk minden egyes lyukhoz, és az abszorbancia értéket 450 nm-en határoztuk meg egy automatikus ELISA olvasó segítségével (XL800, BioTex, Incorporated, Houston, TX, USA).
2.9. Western Blot analízis
24 órás KTF-kezelés után a sejteket jéghideg PBS-sel mostuk, és a fehérjéket 50 mM Tris-HCl-t (pH 7,4), 1 mM EDTA-t, 150 mM NaCl-t, 1 százalék Nonidet P{{-t tartalmazó lízispufferben extraháltuk. 9}}, 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid és 10 ug/ml aprotinin. A fehérjekoncentrációt BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific Pierce, Rockford, Illinois, USA) segítségével határoztuk meg. A fehérjét SDS-PAGE elektroforézissel választottuk el, és PVDF-re (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) vittük át. A blokkolást 5 százalékos zsírmentes szárított tejjel végeztük; a membránt nyúl anti-patkány HO-1, CAT, kaszpáz 3, -aktin antitesttel (1:1000, Cell Signaling) és nyúl anti-patkány GPx-1 antitesttel (1:1000) inkubáltuk. , Abcam) éjszaka 4 fokon . A kezelt membránt mostuk, majd torma-peroxidáz címkével konjugált kecske anti-nyúl IgG1-nek (1:5000, Santa Cruz, USA) 2 órán át szobahőmérsékleten tettük ki. További öt mosás után a keresztreaktivitást elektrochemilumineszcenciás (ECL) Western-blot detektáló reagensekkel tettük láthatóvá, és pásztázó denzitometriával elemeztük Image Systemben (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
2.10. RT-PCR analízis
A HO-1, CAT, GPx-1 és -actin PCR-primerjeit a Sangon Biotech Co. Ltd.-től (Sanghaj, Kína) vásároltuk. 24 órás KTF kezelés után a sejtek teljes RNS-ét Trizol reagenssel izoláltuk a gyártó utasításai szerint. A reverz transzkripciót (RT) az AMV reverz transzkripciós rendszerrel (Fermentas, Burlington, USA) végeztük. A cDNS fragmentumot és az aktint Green PCR master MIX Kit (Fermentas, Burlington, USA) segítségével amplifikáltuk. A DNS-t azonnal amplifikáltuk egyetlen ciklussal 94 fokon 5 percig és 30 ciklussal 94 fokon 30 másodpercig és 58 fokon 30 másodpercig és 72 fokon 30 másodpercig az -aktin esetében, és az utolsó kiterjesztési lépést 72 fokon 10 perc. Az etidium-bromiddal festett géleket beszkenneltük és Tanon Image Software segítségével minősítették. Az egyes sávok intenzitását az -aktin intenzitásával szemben normalizáltuk.
2.11. Statisztikai analízis
A statisztikai elemzést az SPSS 18.{1}} (SPSS Inc., Chicago, IL) segítségével végeztük. Az összes adatot átlag ± SD (standard deviáció) formában mutattuk be, és a különbség statisztikai szignifikanciáját egyutas ANOVA és LSD (lineáris szórás) segítségével végeztük. A különbséget akkor tekintettük szignifikánsnak, ha P <>
A vese-tonizáló formula megvédi a MES23.5 sejtek oxidatív károsodását
3. Eredmények
3.1. A H2O2 károsító hatása a MES23.5 sejtekre és a KTF védő hatása az oxidatív stressz ellen
Amint az 1(a) ábrán látható, a H2O2 dózis- és időfüggő gátlást mutatott a MES23.5 dopaminerg neuronális sejtek életképességében. 12 órás 50 μM H2O2 expozíció után a sejtek életképességének jelentős csökkenését figyelték meg, és a sejtek életképességének csökkenése fokozatosan nőtt a H2O2 dózisának 150 μM-ra emelkedésével. A H2O2 dózis további növelése 200-ról 500 μM-ra azonban nem eredményezett szignifikánsan nagyobb sejtéletképesség-veszteséget. KiterjedőMES23.5 cellákA H2O2-nak való kitettség 12 óráról 24 órára és 48 órára növelte a sejtek életképességének elvesztését alacsonyabb H2O2 koncentrációknál. A MES23.5 sejtek életképességének jelentős csökkenését figyelték meg 24 órás 25 μM H2O2 és 48 órás 12,5 μM H2O2 expozíció után. A sejtek életképességének időfüggő elvesztését figyelték meg minden vizsgált H2O2 koncentrációban.
1. ábra A H2O2 káros hatásai aMES23.5 cellákvalamint a KTF védő hatásai ellenoxidatívA stresszt MTT assay segítségével értékeltük. (a) Különböző koncentrációjú H2O2-kezelés hatásai a sejtkárosodásra. A MES23.5 sejteket 12,5, 25, 50, 100, 150, 200, 300, 400 és 500 μMol/L H2O2-val kezeltük 12, 24 és 48 órán keresztül. (b) Különböző koncentrációjú KTF-kezelések védő hatásai a H2O2-indukált sejtkárosodásra. A KTF kezelése a MES23.5 sejtek életképességének növekedését eredményezte H2O2 hozzáadása után.MES23.5 cellákGE-vel (12,5 ug/ml) vagy KTF-fel (3,125, 6,25, 12,5 ug/ml) inkubáltuk 24 órán keresztül a H2O2 hozzáadása után. A sejtek életképességét MTT-vel mértük. Az adatokat átlag ± SD (standard deviáció) formában fejeztük ki három független kísérletben. #P < 0.05="" a="" kontrollcsoporthoz="" képest.="" ∗p="">< 0,05="" a="" h2o2-kezelt="" csoporthoz="">
LeleplezőMES23.5 cellákA KTF-re önmagában még akkor sem volt szignifikáns citotoxikus hatása, ha a KTF-koncentráció elérte a 100 ug/ml-t. A 150 μM H2O2-vel 12 órán át együtt tenyésztett MES23.5 sejtek 46,76 százalékos életképesség-csökkenést okoztak. A H2O2 citotoxikus hatása a MES23.5 sejtekre szignifikánsan gyengült a 24 órás KTF kezelés hatására (1(b) ábra). A kezelt H2O2 fokozott életképességeMES23.5 cellák95.{1}} százalék ± 7,18 százalék, 96,49 százalék ± 15,07 százalék és 99,04 százalék ± 10,57 százalék 3,125, 6,25 és 12,5 ug/ml koncentrációjú KTF-kezeléssel.
A TEM kimutatta, hogy a kontrollcsoport normál sejtjei ovális alakúak, sértetlen sejtmembránnal, amely számos hullámossággal és mikrobolyhokhoz hasonló szerkezettel rendelkezik. A sejtmag elliptikus volt a közepén, egyetlen maggal, normál euchromatinnal és szórt heterokromatinnal. A mitokondriumok rúdszerű vagy ellipszis alakúak voltak, szétszórtan és normál mitokondriális cristae-kkal. A durva endoplazmatikus retikulum jól fejlett volt, és nem volt nyilvánvaló degranulációja (2(a) ábra). A H2O2-val kezelt sejtek azonban tipikusak voltakoxidatív károsodáskisebb, szabálytalan magokkal és duzzadt mitokondriumokkal. Nyilvánvaló degranulációt találtunk a durva endoplazmatikus retikulumban (2(b) ábra). A KTF-fel kezelt sejtekben javult a H2O2-indukálásoxidatív károsodás, a mitokondriumok rúdszerű vagy ellipszis alakúak voltak, szétszórtan, és több cristae mitokondriális. A durva endoplazmatikus retikulumban nem volt nyilvánvaló degranuláció (2(d), 2(e) és 2(f) ábra).
2. ábra A KTF hatása a sejt ultrastruktúrájára H2O2-indukált állapotbanMES23.5 cellák. A sejt ultrastruktúráját TEM alatt figyelték meg. A citoplazma normál morfológiája, sejtszervecskék a kontrollcsoportban ((a), ×15,000), jellegzetes ultrastrukturális morfológiájaoxidatív károsodásH2O2-kezelt csoportban ((b), ×15, 000), kezelés KTF csoporttal (3,125, 6,25 és 12,5 ug/ml) ((d), (e), (f), × 15, 000) vagy Ginkgo kivonat (12,5 ug/ml) ((c), × 15, 000).
3.2. A TH fokozott expressziója MES23.5 sejtekben KTF kezelés után
A TH egy kritikus katalizáló enzim az L-tirozin aminosav L-3,4-dihidroxifenilalaninná (L-DOPA) történő átalakulásában, amely a dopamin neurotranszmitterek előfutára. A TH normál expressziója az aktív neuronok jele. Ezért összehasonlítottuk a TH expressziót az inkubált H2O{5}}benMES23.5 cellákimmunhisztokémiai KTF-kezeléssel vagy anélkül. Az eredmény azt mutatta, hogy a H2O2 csökkentette a TH expressziót a MES23.5 sejtekben, és a KTF kezelést követően szignifikánsan javíthatja a TH expressziót (3. ábra). Ez azt jelzi, hogy a KTF-kezelés képes volt helyreállítani a H2O2-kezelt MES23.5 sejtek működését.
3. ábra A KTF javította a H2O2-indukált TH-csökkenéstMES23.5 cellák. A sejteket 4 százalékos paraformaldehiddel fixáltuk, és a TH expresszióját immuncitokémiával detektáltuk. (a) A Tan a TH pozitív kifejezést képviseli (×400). (b) Negatív kontroll. (c) Az eredményeket átlagos szürkeségi fokban fejezzük ki. Az adatok átlag ± SD három független kísérletben. #P < 0,05="" a="" kontrollcsoporthoz="" képest.="" ∗p="">< 0,05="" a="" h2o2-kezelt="" csoporthoz="">
3.3. KTF elnyomott H2O2-indukált kaszpáz 3 aktiváció a MES23.5 sejtekben
A MES23.5 sejtkárosodás mechanizmusának további vizsgálatához a proapoptosis faktor kaszpáz 3 expresszióját immunblot módszerrel értékeltük. Az eredmények azt mutatták, hogy a H2O2 kezelés jelentősen csökkentette a prokaspáz 3 expresszióját és felfelé szabályozta a kaszpáz 3 expresszióját. Ezzel szemben a KTF kezelés a prokaszpáz 3 és a kaszpáz 3 egyensúlyát helyreállította a prokaszpáz 3 expressziójának növelésével és a kaszpáz 3 expressziójának csökkentésével (4. ábra). ). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a KTF-kezelés hatékonyan gátolta a kaszpáz 3 aktiválódását.
4. ábra A KTF hatása a kaszpáz 3 fehérje expressziójára H2O2-indukált vízbenMES23.5 cellák. (a) A kaszpáz 3 fehérje expresszióját Western blot-tal határoztuk meg, és mennyiségileg meghatároztuk a (b) pontban. Az adatokat átlag ± SD-ben fejeztük ki három független kísérletben. #P < 0.05="" a="" kontrollcsoporthoz="" képest.="" ∗p="">< 0,05="" a="" h2o2="" -kezelt="" csoporthoz="">
3.4. Az antioxidáns enzimek fokozott expressziója MES23.5 sejtekben KTF kezelés hatására
Az ELISA vizsgálat kimutatta, hogy az intracelluláris CAT, GPx-1 és GSH csökkent 150 μM H2O2 kezelés után a MES23.5 sejtekben. Megjegyzendő, hogy a KTF-kezelést követően helyreállt az intracelluláris CAT, GPx-1 és GSH expresszió. Az RT-PCR elemzés azt mutatta, hogy a H2O2 kezelés csökkentette a CAT és GPx{10}} mRNS expresszióját; a KTF-kezelés azonban helyreállította a CAT és a GPx{11}} mRNS expressziójátMES23.5 cellák. A specifikus antitestekkel végzett immunblot azt is megerősítette, hogy a CAT és a GPx-1 fehérje expressziójaMES23.5 cellákA H2O2-kezelés csökkentette a szabályozást, és a KTF-kezelés képes volt helyreállítani a CAT és GPx-1 fehérje expresszióját. Sőt, mRNS expressziójaoxidatívA stresszre reagáló HO-1 fehérje szintén gátolt volt a H2O2 kezelés után, majd a KTF kezelés után helyreállt. Az immunblot vizsgálat azt is igazolta, hogy a H2O2 jelentősen csökkentette a HO-1 fehérje expresszióját, de a KTF kezelés képes volt helyreállítani a HO-1 fehérje expressziót. Ahogy az várható volt, a vizsgálatunkban használt legmagasabb KTF-koncentrációnak van a legjobb hatása a CAT, GPx-1, GSH és HO-1 expresszió helyreállítására (55. és 6. ábra).6. Összességében a kapott eredmények azt mutatják, hogy a KTF-kezelés jelentősen megnövelte az antioxidáns szubsztrátok szabályozását a H2O2-kezelt MES23.3 sejtekben.
5. ábra A KTF hatása az intracelluláris CAT, GPx-1 és GSH szintjére H2O2-indukált vízbenMES23.5 cellák. Az intracelluláris CAT, GPx{{0}} és GSH aktivitási szintjét ELISA kit segítségével mérték. Az adatokat átlag ± SD-ben fejeztük ki három független kísérletben. #P < 0,05="" a="" kontrollcsoporthoz="" képest.="" ∗p="">< 0,05="" a="" h2o2-kezelt="" csoporthoz="">
6. ábra A KTF megnövelte az antioxidáns enzimek fehérje- és mRNS-expresszióját H2O2-indukált állapotbanMES23.5 cellák. (a) A HO{0}}, a CAT és a GPx-1 fehérje expresszióját Western blot segítségével határoztuk meg, és mennyiségileg határoztuk meg a (c) pontban. (b) A HO-1, CAT és GPx-1 mRNS-expresszióját RT-PCR-rel határoztuk meg, és mennyiségileg határoztuk meg a (d) pontban. Az adatokat átlag ± SD-ben fejeztük ki három független kísérletben. #P < 0,05="" a="" kontrollcsoporthoz="" képest.="" ∗p="">< 0,05="" a="" h2o{10}}kezelt="" csoporthoz="">
4. Megbeszélés
A redox rendszer fontos összetevőjeként a ROS fontos szerepet játszik a sejtműködés szabályozásában. A ROS mérsékelt szintje jelként funkcionálhat a sejtproliferáció és a túlélés elősegítésére. Fiziológiás körülmények között a ROS képződése és eliminációja közötti egyensúly fenntartja a redox-érzékeny jelzőrendszer megfelelő működését. A redox homeosztázist megzavarhatja a ROS-termelés növekedése vagy a ROS-elnyelő kapacitás csökkenése, ami általános növekedéshez vezet.oxidatívstressz [17, 18], ezt követően visszafordíthatatlan károsodást okozva az intracelluláris szerkezetben és sejthalált indukálva.
Az agyban az O2 magas fogyasztása a ROS felhalmozódásához vezet; így a neuronok különösen érzékenyek a támadással szembenoxidatívfeszültség. A posztmortem vizsgálatok lipidperoxidációt ésoxidatív károsodásPD betegek agysejtjeire [19]. A növekvő tanulmányok ezt igazoljákoxidatív károsodáskritikus szerepet játszik a neuron-degeneratív betegségek, mint például az AD, PD, HD és ALS patogenezisében [18, 20]. Jelen vizsgálatban a MES23.5 dopaminerg neuronsejtekben a sejtéletképesség jelentős csökkenését figyelték meg 50 μM H2O2 12 órás, 25 μM H2O2 24 órás vagy 12,5 μM H2O2 48 órás expozíció után. A morfológiai megfigyelések szerint a 12 órán át 150 μM H2O2 hatásának kitett sejtek tipikus oxidatív károsodást mutattak, beleértve a citoplazmában lévő többszörös membrán vakuolákat, az endoplazmatikus retikulum és a mitokondrium megsértését, valamint az euchromatin kondenzálódását a sejtmagban.
A kínai orvoslás elmélete szerint a hiány avesea PD fő patológiás mechanizmusa. Élénkítő avesefontos stratégia a PD kezelésében. Jelen tanulmányban azt tapasztaltuk, hogy a hagyományosvese-tonizálóA KTF formula, amely Cistanche, Epimedii és Polygonatum sibiricumból áll, jelentősen megnövelte a sejtek életképességét és a kezelt H2O2-TH expressziójátMES23.5 cellák.
A sejtapoptózis a programozott sejthalál különböző ingerekre, amelyek akár külső, akár belső utakat aktiválnak. A ciszteinil-aszpartát-specifikus proteázok (kaszpázok) erősen konzerváltak a többsejtű szervezetekben, és az apoptózis központi szabályozójaként működnek. A kaszpázok aktiválása az összes apoptózis esemény fő tengelye. Ezen kaszpázok közül a kaszpáz 3-at a sejtapoptózis kulcsfontosságú közvetítőjeként és indikátoraként azonosították. Más kaszpázokhoz hasonlóan a kaszpáz 3 általában inaktív proenzimként létezik (prokaszpáz 3). A proteolitikus feldolgozás után két alegységet hoz létre, amelyek dimerizálódhatnak és aktív kaszpáz 3-at alkotnak, és ezt követően számos biokémiai és biofizikai változást idéznek elő, amelyek sejtapoptózist indukálnak [21]. Jelen tanulmányunk feltárta, hogy a H2O2-kezelés jelentősen felszabályozta a kaszpáz 3-at, de ez a tendencia a KTF-kezelés hatására megfordult.MES23.5 cellák, ami azt jelzi, hogy a KTF csökkentette a H2O2-kezelt MES23.5 sejtek apoptózisát.
Az antioxidáns enzimek, mint például a szuperoxid-diszmutáz (SOD), a CAT, a GPx-1, a GSH és a HO-1, a sejtek fontos védekező mechanizmusai.oxidatívfeszültség. Antioxidáns enzimként a SOD szuperoxid gyököket hidrogén-peroxiddá alakíthat át, amelyet a CAT és a GPx ezután H2O-vá alakított [22]. A GSH szintén fontos antioxidáns. A redukált glutation (GSH) katalitikus átalakítása oxidált glutationná (GSSG) a GPx segítségével segít a H2O2 O2-dá alakításában. Beszámoltak arról, hogy az antioxidáns aktivitása csökkent PD modell egerekben [23–25]. Ezért az enzimatikus antioxidánsok expresszióját szabályozó gyógyszerek potenciális jelöltek lehetnek a PD kezelésében. Adataink azt mutatták, hogy a H2O2 kezelés elnyomta a CAT, GPx, GSH és HO-1MES23.5 cellák, míg a KTF kezelés különböző koncentrációkban hatékonyan helyreállította a CAT, GPx, GSH és HO expresszióját-1.
Összefoglalva, eredményeink azt mutatják, hogy a hagyományos kínai gyógynövényvese-tonizálókészítmény, amely Cistanche, Epimedii és Polygonatum sibiricumból áll, erős antioxidáns képességgel és jelentős neuroprotektív hatással rendelkezik. Ez a tanulmány támpontot ad a fejlesztéshezvese-tonizálókészítmény, mint potenciális terápiás szer a Parkinson-kór megelőzésére és kezelésére.
A vese-tonizáló formula megvédi a MES23.5 sejtek oxidatív károsodását
Köszönetnyilvánítás
Ezt a munkát a Kínai Népköztársaság Nemzeti Egészségügyi és Családtervezési Bizottságának Tudományos Alapja (WKJ-FJ-38), Chen Keji Integratív Orvostudományi Fejlesztési Alap (CKJ2014012) és Kulcsfegyelmi Alap (Fund of Key Disciplinary) támogatta. X2014010-rengés). A szerzők őszinte köszönetüket fejezik ki Xin Pan kisasszonynak segítőkész segítségéért.
Versengő érdekek
A szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális összeférhetetlenségnek tekinthetők.
A szerzők közreműködései
Yihui Xu és Wei Lin ugyanazt a hozzájárulást adja a cikkhez. Chuanshan Xu a megfelelő szerző.
Hivatkozások
1. Fahn S., Cohen G. Az oxidáns stressz hipotézise Parkinson-kórban: bizonyítékok, amelyek alátámasztják. Annals of Neurology. 1992;32(6):804–812. doi: 10.1002/ana.410320616. [PubMed] [CrossRef] [Google Tudós]
2. Jenner P., Olanow CWOxidatívstressz és a Parkinson-kór patogenezise. Ideggyógyászat. 1996;47 (3. kiegészítés): S161–S170. doi: 10.1212/wnl.47.6_suppl_3.161s. [PubMed] [CrossRef] [Google Tudós]
3. Akaneya Y., Takahashi M., Hatanaka H. A szabad gyökök részvétele az MPP-ben plusz neurotoxicitás patkány dopaminerg neuronok ellen tenyészetben. Neuroscience Letters. 1995;193(1):53–56. doi: 10.1016/0304-3940(95)11668-M. [PubMed] [CrossRef] [Google Tudós]
4. Emerit J., Ideas M., Bricaire F. Neurodegeneratív betegségek ésoxidatívfeszültség. Biomedicina és farmakoterápia. 2004;58(1):39–46. doi: 10.1016/j.biopha.2003.11.004. [PubMed] [CrossRef] [Google Tudós]
5. Kínai Gyógyszerkönyvi Bizottság. A Kínai Népköztársaság gyógyszerkönyve. Vol. 1. Peking, Kína: People's Medical Publishing House; 2010. [Google Tudós]
6. Cai J., Tian Y., Lin R., Chen X., Liu Z., Xie J. Protective effects ofvese-tonizálóKínai gyógynövénykészítmény a substantia nigra neuronokon a Parkinson-kór egérmodelljében. Neurális regeneráció kutatása. 2012;7(6):413–420. [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Google Scholar]
7. Li WW, Yang R., Cai DF A Cistanche összglikozidok védő hatásai dopaminerg neuronokra Parkinson-kóros modellegerek substantia nigrájában. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2008;28(3):248–251. [PubMed] [Google Tudós]
8. Wei W., Jing C. A Parkinson-kór TCM mintázatának és képletének elemzése. Journal of Traditional Chinese Medicine. 2013;54(20):1778–1782. [Google ösztöndíjas]
9. Tian Y., Cai J., Chen X. Protection ofvese-tonizálóKínai gyógynövény a nigra striatális idegsejteken, Parkinson-kórban szenvedő egereken. Kínai Gerontológiai Lap. 2011;31(3):440–443. [Google ösztöndíjas]
10. Lin SG, Ye SF, Huang JM és társai. Hogyan hatnak a kínai gyógyszerek, amelyek tonizálják avesegátolja a dopaminerg neuron apoptózist? Neurális regeneráció kutatása. 2013;8(30):2820–2826. doi: 10.3969/j.issn.{7}}.2013.30.004. [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
11. Wang H., Li W.-W., Cai D.-F., Yang R. A Cistanche kivonatok védő hatása az MPP plusz által kiváltott Parkinson-kór sejtmodelljének sérülésére. Journal of Chinese Integrative Medicine. 2007;5(4):407–411. doi: 10.3736/jcim20070409. [PubMed] [CrossRef] [Google Tudós]
12. Geng X., Tian X., Tu P., Pu X. Az echinacoside neuroprotektív hatásai a Parkinson-kór egér MPTP modelljében. European Journal of Pharmacology. 2007;564(1–3):66–74. doi: 10.1016/j.ejphar.2007.01.084. [PubMed] [CrossRef] [Google Tudós]
13. Tian X.-F., Pu X.-P. A Cistanches salsából származó feniletanoid glikozidok gátolják a 1-metil-4-fenilpiridinium-ion által kiváltott apoptózist a neuronokban. Journal of Ethnopharmacology. 2005;97(1):59–63. doi: 10.1016/j.jep.2004.10.014. [PubMed] [CrossRef] [Google Tudós]
14. Geng X., Song L., Pu X., Tu P. A Cistanches salsából származó feniletanoid-glikozidok neuroprotektív hatásai a 1-metil-4-fenil-1,2,3,{{ 6}}tetrahidropiridin (MPTP) által kiváltott dopaminerg toxicitás C57 egerekben. Biológiai és Gyógyszerészeti Értesítő. 2004;27(6):797–801. doi: 10.1248/bpb.27.797. [PubMed] [CrossRef] [Google Tudós]
15. Wong HS, Ko KM Herba Cistanches a H9c2 kardiomiociták mitokondriális légzéséből származó reaktív oxigénfajták által stimulálja a sejt glutation redox ciklusát. Gyógyszerbiológia. 2013;51(1):64–73. doi: 10.3109/13880209.2012.710242. [PubMed] [CrossRef] [Google Tudós]
16. Wing Sze SC, Tong Y., Ng TB, Yin Cheng CL, Cheung HP Herba Epimedii: anti-oxidatívtulajdonságai és orvosi vonatkozásai. Molekulák. 2010;15(11):7861–7870. doi: 10,3390/molecules15117861. [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
17. Trachootham D., Lu W., Ogasawara MA, Valle NR-D., Huang P. A sejttúlélés redox szabályozása. Antioxidánsok és redox jelzés. 2008;10(8):1343–1374. doi: 10.1089/ars.2007.1957. [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
18. Moore DJ, West AB, Dawson VL, Dawson TM A Parkinson-kór molekuláris patofiziológiája. Az idegtudomány éves áttekintése. 2005;28:57–87. doi: 10.1146/annurev.neuro.28.061604.135718. [PubMed] [CrossRef] [Google Tudós]
19. Sian J., Dexter DT, Lees AJ és munkatársai. A glutationszint változása Parkinson-kórban és más, a bazális ganglionokat érintő neurodegeneratív rendellenességekben. Annals of Neurology. 1994;36(3):348–355. doi: 10.1002/ana.410360305. [PubMed] [CrossRef] [Google Tudós]
20. Halliwell B., Gutteridge JMC A szabad gyökök szerepe az emberi betegségekben: áttekintés. Enzimológiai módszerek. 1990;186:1–85. [PubMed] [Google Tudós]
21. Venderova K., Park DS Programozott sejthalál Parkinson-kórban. Cold Spring Harbor perspektívák az orvostudományban. 2012;2(8) doi: 10.1101/cshperspect.a009365.a009365 [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
22. Fridovich I. A reaktív oxigénfajták alapvető vonatkozásai, avagy mi a baj az oxigénnel? A New York-i Tudományos Akadémia évkönyvei. 1999;893:13–18. doi: 10.1111/j.{7}}.1999.tb07814.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Tudós]
23. Xiong Q., Kadota S., Tani T., Namba T. A Cistanche deserticola feniletanoidjainak antioxidáns hatásai. Biológiai és Gyógyszerészeti Értesítő. 1996;19(12):1580–1585. doi: 10.1248/bpb.19.1580. [PubMed] [CrossRef] [Google Tudós]
24. Koppula S., Kumar H., More SV, Lim H.-W., Hong S.-M., Choi D.-K. Legutóbbi frissítések a redox szabályozásban és a növényi termékek szabad gyökfogó hatásaiban a Parkinson-kór kísérleti modelljeiben. Molekulák. 2012;17(10):11391–11420. doi: 10,3390/molecules171011391. [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
25. Fang Z., Wang Y. Az izatin hatása az antioxidáz aktivitására PD modell egerekben. Kínai gyógyszertár. 2008;19(22):1696–1697. [Google ösztöndíjas]
