Veseátültetés

Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

BEVEZETÉS

Veseátültetésa legjobb választás a krónikus vesebetegség végstádiumú kezelésére. Jelenleg az antitest-mediált kilökődés (AMR), amelyet a humán leukocita-antigén (HLA) elleni donor-specifikus antitest (DSA) jelenléte jellemez, a vesegraft krónikus károsodásának vezető okozója lett. nagymértékben korlátozza a graft hosszú távú túlélését. (1, 2). A meglévő rendszerek azonban nem hoztak ígéretes eredményeket a klinikai gyakorlatbanaz AMR kezelése (1, 3, 4). Ezért sürgősen azonosítani kell az AMR potenciális biomarkereit és kockázati tényezőit a veseátültetés után, ami kritikus a kezelés és a betegek kimenetelének szempontjából.

A felgyülemlett bizonyítékok arra utalnak, hogy gyulladásos körülmények között a B-sejtek antitest-kiválasztó plazmablasztokká és szabályozó B-sejtekké (Bregs) differenciálódhatnak, amelyek egy speciális B-sejt-alcsoport, amely immunszuppresszív citokineket, különösen interleukint (IL) -10 választ ki. (1, 5–7). Így a plazmablasztok alloantitesteket termelnek, ami AMR-t eredményez, míg a Bregs immunszabályozó funkciókat mutat, és elősegíti az immunhomeosztázis indukálását. Így a Bregsről beszámoltak arról, hogy szorosan összefügg a vesetranszplantációt követő AMR-rezisztenciával (1, 8, 9).

Bár a Breg-alcsoportok különböző felszíni markereit még nem azonosították emberekben (1), a korábbi tanulmányok a Breg-ek négy gyakori alpopulációjáról számoltak be: memória-bregek (mBregek), amelyeket a CD19 plusz CD24 plusz CD27 plusz határoz meg (10), átmeneti Breg-ek (10). tBregs) a CD19 plus CD24 plus CD38 plus (10, 11), IL-10-memória Bregs (IL-10 plus mBregs) definíciója a CD19 plus CD24 plus CD27 plus IL-10 plus (12) és IL{17}}gyártásátmeneti Bregs (IL-10 plusz tBreg) a CD19 plusz CD24 plusz CD38 plusz IL-10 plusz (13) definícióval. Laguna-Goya et al. beszámoltak arról, hogy a tBreg és IL-10 plusz tBregs csökkenése pozitívan összefügg a vesetranszplantáció utáni akut kilökődéssel (14). Azonban Zhou et al. beszámoltak arról, hogy a tBreg helyett az mBreg-értékek szignifikánsan csökkentek öt olyan betegnél, akiknél májtranszplantáció utáni akut kilökődés fordult elő (10). Továbbá Shabir et al. beszámoltak arról, hogy három AMR-betegnél a tBreg-ek nem jártak együtt a vese allograft kilökődésével (15). Ezen ellentmondásos eredmények fényében további tisztázásra van szükség, hogy mely Breg szubpopuláció játszik létfontosságú szerepet a veseátültetés utáni AMR-betegekben.

Jelen tanulmányban a keringő Breg-ek négy alpopulációjának arányát hasonlítottuk össze az egészséges, stabil (ST) és az AMR csoportok között. Ezután meghatározták a B-sejt, az IL-10 és a kemokinek biológiai eloszlását egészséges, ST és AMR betegek vesegraftjaiban. Továbbá megvizsgálták a keringő Bregs négy alpopulációjának dinamikáját ST-betegekben a műtét után 90 napig. Ezek a jelenlegi eredmények, valamint a korábbi tanulmányokban közölt eredmények (1) azt sugallják, hogy a keringő IL-10 plusz mBregs és IL-10 plusz tBregs a vezető Breg-alpopulációk, amelyek hozzájárulnak az AMR-rel szembeni rezisztenciához.

Cistanche tubulosa pormegakadályozzavesebetegségek, kattintson ide a minta megtekintéséhez

Kulcsszavak:Breg fenotipizálás, vesetranszplantáció, antitest-mediált kilökődés, homeosztázis, dinamikus

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Betegek és csoportok

A vizsgálat előtt minden beteg aláírt beleegyező nyilatkozatot adott. A jelen tanulmányt a Zhengzhou Egyetem Első Társult Kórházának (2018-KY-72) Etikai Bizottsága hagyta jóvá. A klinikai vizsgálat regisztrációs száma ChiCTR1900022501.

Ezeket a betegeket három csoportra osztották: (1) egészséges kontrollcsoport (egészséges, n=9): 18–55 év közötti (betegségtől mentes) egészséges vesedonorok, a recipiensek testvéreiből és házastársaiból; (2) stabil graftfunkciós csoporttal (ST, n=25) rendelkező recipiensek: azok a 18-55 év közötti betegek, akiknek a veseműködése stabil volt (fertőzéstől és kilökődéstől mentes a veseátültetés előtt és után) a követés során időszak (6 hónapnál nagyobb vagy egyenlő); (3) AMR-ben szenvedő betegek csoportja (AMR, n=18): 18–55 év közötti betegek, akiknél AMR-t diagnosztizáltak. Az ST-vel és AMR-rel rendelkező recipiensek vesegraftjait innen szereztük beegészséges vesedonors. Az ST és az AMR csoportok közötti differenciáldiagnózist két vesepatológus erősítette meg a Banff 2017 konszenzusa szerint (3, 16).

Perifériás vér, veseszövetek és sejtminták

Az egészséges csoportból a perifériás vérmintákat a műtét előtt, valamint a műtét után 1, 7 és 14 nappal vettük. Az ST csoportból vett mintákat a műtét előtt, valamint a műtét után 1, 7, 14, 30 és 90 nappal vettük. Az AMR-csoportból vett mintákat a kilökődés bekövetkeztekor gyűjtöttük (az AMR kilökődés elleni terápiája előtt). A perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC) izoláltuk

5 ml vért Ficoll-Paque gradiens centrifugálással és 10 százalékos dimetil-szulfoxiddal (Solarbio Inc., Peking, Kína) folyékony nitrogénben tartósítottunk.

Az egészséges csoportból nyert core tűs vesebiopsziás mintákat műtét előtt gyűjtöttük nulla időpontban donor vese biopsziához. Az ST csoportból vett magtűs vesebiopsziás mintákat 90 nappal a műtét után vettük, miután vesefunkciójuk a protokoll biopszia következtében stabilizálódott. A második punkciós veseműködési károsodás fényében minden AMR-beteg elutasította a tűs vesebiopsziát az AMR kilökődés elleni terápiája után. Így az AMR-csoportból származó tűvese-biopsziás magmintákat csak kilökődés esetén vették (az AMR kilökődés-ellenes terápiája előtt). Összesen három egészséges donor, kilenc ST-beteg és kilenc AMR-beteg adott aláírt beleegyező nyilatkozatot a tűs vesebiopszia előtt. A fennmaradó hat egészséges donor, 16 ST-beteg és kilenc AMR-beteg megtagadta a magtű-vesebiopsziát, mert félt a biopsziával kapcsolatos súlyos vérzéstől. Három egészséges donor, három ST-beteg és három AMR-beteg tűs vesebiopsziás magmintájából egyedi sejteket izoláltunk a mechanikai disszociáció és a szövetek szerkezeti integritását fenntartó extracelluláris mátrix enzimatikus lebomlásának kombinálásával (Multi Tissue Dissociation Kit 1; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Németország). A vesesejteket 10 százalékos dimetil-szulfoxiddal (Solarbio Inc., Peking, Kína) folyékony nitrogénben konzerváltuk, a fennmaradó tűs vesebiopsziás magmintákat pedig 4 fokos paraffinba ágyaztuk.

Áramlási citometria

A folyékony nitrogénben tárolt sejteket 37 fokos vízfürdőben 3 percig gyorsan felengedtük. Összesen 2–3 × 106 PBMC-t inkubáltak a Roswell Park Memorial Institute 1640 hígítósejt-stimulációs koktéljával (500×), amely PMA-t (Phorbol 12-Miristát 13- Acetát) tartalmazott. kalcium-ionofor (Ionomycin) és fehérjetranszport-gátló Brefeldin A és Monensin (eBioscience, San Diego, CA), 37 fokon 5 százalékos CO2-vel 5 órán keresztül. Az elhalt sejteket 7-Aminoactinomycin D-vel (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) való festéssel zártuk ki, és a Bregs felszíni markereit fluorokrómmal jelölt antitestekkel (Brilliant Violet CD 421™ anti-humancoery19™, anti-humancoerythrin) festettük. (PE)/Cy7 anti-humán CD24, Alexa FluorR647 anti-humán CD27, Alexa FluorR488

anti-humán CD38 és Brilliant Violet 510™ anti-humán CD45; a megfelelő izotípus kontrollok: Brilliant Violet 421™ egér

IgG1 k izotípus kontroll, PE/Cy7 egér IgG2a k izotípus kontroll, Alexa FluorR647 egér IgG1 k izotípus kontroll, Alexa FluorR488 egér IgG1 k izotípus kontroll és briliáns ibolya

510™ egér IgG1 k izotípus kontroll; Biolegend, San Diego, CA,

USA) 30 percig 4 fokon, fénytől védve. Az intracelluláris festéshez a sejteket Bregs intracelluláris citokinjeit célzó antitestekkel (PE anti-humán IL-10; a megfelelő izotípus kontrollok: PE Rat IgG1 k Isotype Control; Biolegend, San Diego, CA, USA) festettük. 30 percig szobahőmérsékleten, fénytől védve. A jelölt sejteket a BD Biosciences Canto II készülék (BD Biosciences, USA) segítségével elemeztük. Összesen 100, 000 esemény történt a limfocita kapuban. Az adatok elemzését FlowJo szoftverrel (Tree Star, San Carlos, CA, USA) végeztük.

Immunhisztokémia

Immunohistochemistry staining of CD19, IL-10, and C-X-C motif chemokine 13 (CXCL13) in kidney tissues was performed, respectively. Brieflfly, 4 mm sections obtained from formalin-fifixed, paraffifin-embedded kidney tissue samples were incubated with 1:500-diluted anti-CD19, 1:1000-diluted antiCXCL13 (rabbit anti-human; Abcam, Cambridge, UK), and 1:500-diluted anti-IL-10 (rabbit anti-human; Absin, Shanghai, China) primary antibodies overnight at 4°C, followed by Horseradish Peroxidase-conjugated 1:20,000-diluted goat antirabbit secondary antibody (Abcam, Cambridge, UK) for 1 h at room temperature and then 3,3′-diaminobenzidine for another 10 min. DAPI appears in blue. Immunohistochemistry images were acquired with an Aperio ScanScope AT Turbo (Aperio, Vista, CA). Numbers of CD19, IL-10, and CXCL13 positivities were scored as follows: 0 positivity, score = zero; 1–5 positivities, score = one; 6–10 positivities, score = two; 11–20 positivities, score = three; >20 pozitív,=pontszám négy

Statisztikai analízis

A beágyazott eset-kontroll vizsgálatban a vevő működési karakterisztikája (ROC) görbe elemzését a MedCalc v18.11.3 szoftverrel végeztük. A többi statisztikai elemzést az IBM SPSS 21.0 segítségével végeztük. A normál eloszlású, homogenitású variancia mérési adatokat átlag ± szórással (x ± s) fejeztük ki, és független mintás t-próbával (csoportos összehasonlítások) vagy egyirányú varianciaanalízissel (csoportos összehasonlítások) elemeztük. Azokat a mérési adatokat, amelyeknek nem volt normális eloszlása ​​vagy homogenitása a variancia, mediánban fejeztük ki az interkvartilis tartománnyal (IQR), és Mann–Whitney U teszttel (csoportos összehasonlítások) vagy Kruskal–Wallis teszttel (csoportos összehasonlítások) elemeztük. A számlálási adatokat szükség szerint c2-teszttel, korrigált c2-teszttel vagy Fisher-féle egzakt teszttel elemeztük. Egyirányú ismételt mérési varianciaanalízis

különböző időpontokban használták. P-értékek<0.05 were="" considered="" statistically="">

EREDMÉNYEK

A betegek alapjellemzői

Összesen kilenc egészséges donor, 25 ST-beteg és 18 AMR-beteg vett részt ebben a vizsgálatban. Amint az 1. táblázatban látható, a recipiensek neme, életkora, testtömeg-indexe (BMI), kezdeti nefropátia, HLA-mismatch, CNI-k, meleg-ischaemiás idő és hideg-ischaemiás idő nem különbözött a csoportok között vagy a csoportok között (P > 0.05, mindenkinek). Mindazonáltal mind az I. osztályú, mind a II. osztályú DSA-pozitivitás incidenciája szignifikánsan magasabb volt az AMR-csoportban, mint az ST-csoportban (P < 0.001="" az="" anti-csoportban).="" -i.="" osztályú="" dsa,="" p="">< 0,001;="" p="0,001" ii.="" osztályú="" dsa="" esetén).="" ezenkívül="" az="" st-betegekkel="" összehasonlítva="" az="" amr-betegek="" szignifikánsan="" magasabb="" pontszámot="" értek="" el="" tubulitisben="" (t),="" intersticiális="" gyulladásban="" (i)="" és="" peritubularis="" capillaritisben="" (ptc)="" (p="0,012" t;="" p="">< 0,001="" i="" és="" ptc="" esetén="" ),="" a="" banff-besorolás="" szerint="" (normál,="" pontszám="0;" enyhe,="" pontszám="1;" közepes,="" pontszám="2;" súlyos,="" pontszám="3)" (3,="" 16)="" (="" 1.="" és="" 2.="" kiegészítő="">

cistanche echinacosideszámára cukorbetegség