A lamivudin javítja a SAMP8 egerek kognitív hanyatlását: az in vivo farmakológiai értékelés és a hálózat farmakológia integrálása

Absztrakt

A reverz transzkriptáz inhibitorok, például a lamivudin (3TC) fontos szerepet játszanak aöregedésgátló, de hatásuk aöregedés okozta neurodegeneratív betegségeknem egyértelműek, különösen a funkcióit illetőenidegrendszer, mint például a megismerés. Ebben a vizsgálatban 3TC-t adtunk az öregedésre hajlamos egér 8 (SAMP8) egereknek gyomorperfúzióval (100 mg/kg) 4 héten keresztül. Eredményeink azt mutatták, hogy a 3TC jelentősen javította aSAMP8 egerek öregedési állapota, különösen a kognitív képességek hanyatlása a Morris vízi labirintus teszttel értékelve. A molekuláris mechanizmusok további vizsgálatáraöregedési állapot javításaA SAMP8 egerek 3TC-vel történő vizsgálatát, a qPCR-t és a szövetfestési módszereket alkalmaztuk az egerek agyszöveteinek (azaz hippokampusz és kéreg) tanulmányozására, míg a hálózati farmakológiai elemzést a 3TC potenciális célpontjainak vizsgálatára. Az eredmények azt mutatták, hogy a gének mRNS-szintjei a hosszan elszórt elemhez-1, az 1-es típusú interferonválaszhoz, az öregedéssel összefüggő szekréciós fenotípushoz, ill.Alzheimer kóra SAMP8 egerek hippocampusában és kéregében megnövekedett a miattöregedés, de ezt a tendenciát a 3TC részben megfordította. A szövettani vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy a 3TC csökkentette a hippocampalis neuronok pusztulását, míg a hálózati farmakológiai analízis eredményei azt mutatták, hogy a 3TC többféle úton fejtheti ki hatását, beleértve az ösztrogén jelátvitelt és a PI3K/Akt és a neuroaktív ligandum-receptor interakciós jelátviteli útvonalakat. amelyeket in vitro kísérletekkel igazoltunk. Ezek az eredmények bizonyítékot szolgáltatnak a 3TC terápiás potenciáljára a neurodegeneratív betegségek kezelésében.

KULCSSZAVAKöregedés, kognitív képesség, lamivudin, long közbeiktatott elem-1, neurodegeneratív betegségek

Kínai gyógynövények Cistanche hatásaReverz transzkriptáz inhibitorok Az öregedésgátlásról

1|BEVEZETÉS

A mai napig az öregedés és a neurodegeneratív betegségek, mint plAlzheimer-kór (AD) vagy Parkinson-kóraz öregedéssel összefüggő, a globális demográfiai változások miatt folyamatosan növekszik.1,2 A kognitív hanyatlás komoly akadályt jelent a hosszú és egészséges élet elérésében. Évtizedek óta jelentős erőfeszítéseket tettek olyan gyógyszerek felkutatására, amelyek felhasználhatók az öregedéssel járó kognitív degeneráció kezelésére.3 Az elmúlt években a hosszú ideig elszórt elem -1 (L1) egyre nagyobb figyelmet kapott, mint potenciális újdonság. az öregedés tanulmányozásának célpontja.4 Az L1 a nem hosszú terminális ismétlődő retrotranszpozonok leggyakrabban előforduló családjába tartozik, ~500,{10}} kópiával, és az emberi genom ~17 százalékát teszi ki. Az L1 gén egy operont tartalmaz két nyitott leolvasási kerettel (ORF1 és ORF2), amelyek mindegyike szükséges a retrotranszpozícióhoz.5–7 Az ORF1 egy reverz transzkriptáz aktivitással rendelkező fehérjét (ORF1p) kódol, amelyet nukleozid analógok, mint pl. lamivudin (2'-3'-dezoxi-3'-tiocitidin, 3TC).8

Az aktív L1 képes cDNS-t szintetizálni a kromatinon kívül, majd visszahelyezni az ORF1p által katalizált genomba, végső soron megváltoztatva más gének expresszióját, és genomi instabilitással összefüggő betegségeket eredményezve.9,10 A gazdaszervezet általában egy sorozaton keresztül gátolja az L1 transzponálható aktivitását. 11,12 Az L1 transzpozíciója általában csak csíra- vagy rákos sejtekben fordul elő, míg a legújabb vizsgálatok kimutatták, hogy az L1 a központi idegrendszerben vagy az öregedő sejtekben is nagyon aktív, bár az L1 mögöttes neurális mechanizmusai nem tisztázottak.13 Tanulmányok kimutatták, hogy az L1 monitorozási mechanizmusához kapcsolódó faktorok (pl. TREX1, RB1 és FOXA1) nem működnek a sejt öregedésében, ami az L1 aktiválódását eredményezi. A TREX1 egy 3' exonukleáris áz, amely lebontja az idegen behatoló DNS-eket, és elvesztését a citoplazmatikus L1 cDNS felhalmozódásával hozták összefüggésbe.14 Az RB1-ről kimutatták, hogy kötődik ismétlődő elemekhez, beleértve az L1 elemeket is, és elősegíti azok heterokromatinizációját.15 A FOXA1 pedig az öregedő sejtekben13 felfelé szabályozott, és az L1 5' UTR központi régiójához kötődik. Az aktivált L1 tovább aktiválja az I-es típusú interferon (IFN-I) választ, amely reverz transzkripciós cDNS-en keresztül gyulladást vált ki, és fenntartja az öregedéssel összefüggő szekréciós fenotípust (SASP). Ezért, mint az öregedés okozta aszeptikus gyulladás fontos tényezője, az L1-et fontos célpontnak tekintik az öregedéssel összefüggő betegségek kezelésében. A 3TC-vel kezelt idős egerekben a gyulladásos faktorok felhalmozódása javul az L1 extracelluláris transzkripciójának gátlásával az izomszövetekben és más szövetekben.16 A reverz transzkriptáz gátlók idegrendszeri funkcióira gyakorolt ​​hatásait vizsgáló tanulmányok mindmáig ritkák. A közelmúltban a genomi cDNS (gencDNS) több ezer változatát találták elhalálozott AD-ben szenvedő betegek agyában, amelyek a jellegzetes RNS-splicing variánsok genomba való visszahelyezéséből származnak.17 Ezt a jelenséget az AD egyik fontos okának tekintik. A gencDNS-ek képződését okozó tényezők közé tartozik a transzkripció, a DNS-pusztulás, a reverz transzkriptáz és az öregedés.

Tanulmányok kimutatták, hogy a nukleozid reverz transzkriptáz inhibitorok blokkolják a gencDNS képződését endogén reverz transzkriptáz aktivitású kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtvonalakban.19 Továbbá 65 év feletti AIDS-betegek, akik reverz transzkriptáz inhibitorokat szedtek. hosszú ideig ritkán alakult ki AD.20 Ezért feltételezzük, hogy a 3TC, mint reverz transzkriptáz inhibitor, potenciális gyógyszer lehet az öregedés okozta kognitív károsodások és neurodegeneratív betegségek kezelésére. Kimutatták, hogy az öregedésre hajlamos 8 (SAMP8) egerek, mint az emberi öregedés és az életkorral összefüggő betegségek tanulmányozásának modellje, számos olyan tulajdonságot mutatnak, amelyekről ismert, hogy a neurodegeneratív betegségek korai szakaszában előfordulnak, mint például a fokozott oxidatív stressz, az ideggyulladás és a kognitív képességek. csökkenése.21 Ebben a vizsgálatban ezért a SAMP8 egereket választották ideális állatmodellnek az öregedés okozta neurodegeneratív betegségek kezelésére. A 3TC korai öregedő egerekre gyakorolt ​​kognitív hatásaira és az öregedéssel kapcsolatos molekuláris útvonalakra összpontosítottunk, bizonyítékot szolgáltatva a reverz transzkriptáz inhibitorok szerepére az öregedésből adódó neurodegeneratív betegségek kezelésében. A továbbiakban a hálózatfarmakológiai módszert alkalmaztuk a 3TC célpontjainak előrejelzésére, hálózatok felépítésére, valamint a 3TC-vel kapcsolatos biológiai funkciók és útvonalak elemzésére.

2|KÍSÉRLETI RÉSZ 2.1 |

Állatok A Tianjin Hagyományos Kínai Orvostudományi Egyetem által biztosított 44-hetes hím SAMP8 és rokon normál öregedésgyorsított egér-R1 (SAMR1) egereket egy 1-hetes akklimatizációs időszak után használtuk. Az állatkísérleti protokollt a Shandong Tartományi Kórház Állat-etikai Bizottsága hagyta jóvá, és a National Institutes of Health (NIH) Laboratóriumi állatok gondozására és használatára vonatkozó útmutatója alapján végezték el. Az egereket autoklávozott ketrecekben tartottuk, és steril táplálékot és vizet kaptak. Az egerek testtömegét minden nap feljegyeztük. Az ebben a vizsgálatban végzett kísérletek folyamatábrája az 1A. ábrán látható. A kísérletek befejezése után az egereket dietil-éterrel végzett inhalációval elaltattuk.

2.2|A 3TC előkészítése és kezelése

A gyógyszereket minden kísérlet napján frissen készítették el. Az MCE-től (Sanghaj, Kína) vásárolt 3TC-t DMSO-ban oldottuk fel 2 mmol/l végkoncentrációig. A törzsoldatot ezután a munkakoncentrációra hígítottuk ivóvízzel, ahol a DMSO végső koncentrációja kevesebb, mint 0,1 százalék. Három egércsoportot hoztunk létre: egy kontrollcsoportot, amelyet vivőanyag-oldattal (ivóvízzel) kezeltek, egy tesztcsoportot 3TC-vel kezeltek, és a SAMR1-csoportot, amely vivőanyagot kapott, és egy másik kontrollcsoportként használtak öregedéshez. A tesztcsoport szájon át kapott 3TC-t 100 mg/kg/nap dózisban. Minden egeret intragasztrikus adagolással tápláltunk 4 hétig (1B. ábra).

1. ÁBRA Kísérleti terv és a 3TC hatása a relatív súlyvesztés javítására az öregedés és az öregedés osztályozási pontszámai miatt. (A) A 3TC SAMP8 egerek kognitív képességére gyakorolt ​​hatásának tanulmányozására szolgáló farmakológiai kísérletek folyamatábrája. (B) Az állatkísérleti ütemterv sematikus bemutatása. (C) A koncepcionális munkafolyamat a gyógyszer-cél kölcsönhatások előrejelzésére a Pharmmapper segítségével, amely balról jobbra mutatja a 3TC molekuláris szerkezetét, a 3TC 3D szerkezeti diagramját és a farmakofor modellt, amelyet a 3TC ösztrogénreceptorhoz való kötődésével jósolnak meg a legmagasabb normalizált értékkel. illeszkedési pontszámok. (D) A testtömeg növekedési mintája az egyes egércsoportokban. (E) Változások az osztályozási pontszámokban a 3TC kezelése előtt és után. SAMR1 plus Vehicle: 44-hetes SAMR1 egerek hordozóval kezelve 4 hétig. SAMP8 plus Vehicle: 44-hetes SAMP8 egerek 4 hétig vivőanyaggal kezelve. SAMP8 plusz 3TC: 44-hetes SAMP8 egerek 3TC-vel 4 hétig. Student-féle t-próba: *p < 0.05, **p < 0,01 és ***p < 0,001. ns: nincs statisztikai szignifikancia. A fekete csillagok a SAMR1 plus járműcsoporttal való összehasonlítást jelentik. A piros csillagok a SAMP8 plusz hordozócsoporttal való összehasonlítást jelzik. A kék vonal a SAMP8 plusz 3TC csoportot jelöli 44 és 48 hetes korban.

2,3|Osztályozási pontrendszer

Az egerek öregedésének mértékét a korábban leírt osztályozási pontrendszer segítségével értékelték ki.22 A pontszámok minden kategóriája öt szintet tartalmaz, amelyek 0-től 4-ig terjednek, és a fokozat legmagasabb pontszáma az állat öregedésének legmagasabb fokát jelzi. . Az egyes kategóriák pontszámait négy tapasztalt kísérletező külön értékelte, akik vakok voltak a kezelési körülményekre (S1 kiegészítő táblázat).

.2.4|Morris vízi labirintus teszt

A Morris-féle vízlabirintus-vizsgálatokat Morris protokollja szerint végezték, beleértve a tájékozódási navigációs kísérletet és a szondás kísérleteket.23 A vízlabirintus egy kör alakú medence volt (120 cm átmérőjű, 10 cm átmérőjű platformmal), és 25 °C-on vízzel töltötték meg. ± 1 fok. Az egereket arra tanították, hogy egy percen belül megtalálják a vízfelszín alatti platformot. Ha az egér nem találta meg a platformot 60 másodpercen belül, a platformra vezették, és 20 másodpercig ott hagyták. Mindegyik egeret naponta ötször idomítottuk úgy, hogy mindegyik 15 percnyi távolságra volt egymástól. Minden egyes próbában más volt a kiindulási helyzet, álvéletlen sorrendben. A teszt hatodik napján az emelvényt eltávolították, és az állat belépett a vízi labirintusba a labirintus azon kvadránsával ellentétes pontról, ahol az emelvény az edzés során korábban volt, és 60 másodpercig hagyták felfedezni a labirintust. Az úszási útvonalat és az időt, amit az egerek a labirintus keresésével töltöttek, a videokamera rögzítette, és az EthoVision XT (Noldus Software) segítségével elemezte. Minden csoport legalább nyolc állatból állt.

2,5|RNS extrakció és kvantitatív PCR

Az egerek hippocampális és kortikális szöveteiből a teljes RNS-t a TRIzol Reagent (Invitrogen) alkalmazásával végzett kezelések után vontuk ki a gyártó protokollja szerint. Minden RNS-mintát (1 ug) fordítottan átírtunk, hogy cDNS-t hozzunk létre cDNS Reverse Transcription Kit (Takara) segítségével, majd PCR-amplifikációt végeztünk a TaKaRa Taq Kit (Takara) segítségével. A primer készleteket az S2 kiegészítő táblázat írja le.

2,6|A szövetek előkészítése

Az állatokat dietil-éterrel érzéstelenítettük, és agyukat összegyűjtöttük foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) és 4%-os paraformaldehid oldattal végzett transzkardiális perfúziót követően. Az agyszöveteket eltávolítottuk és paraformaldehidben fixáltuk 2 napon keresztül. A rögzített agyakat paraffinba ágyaztuk, a hippocampális szövetet 5 μm vastagságban metszettük.

2,7|Hematoxilin és eozin (H & E) festés

Az agy morfológiáját hematoxilin és eozin (H&E) festési módszerekkel elemeztük. A hippocampális szövetek paraffin metszeteit viaszmentesítettük és egy sor koncentrációjú alkohol gradiensével dehidratáltuk. A HE festést H & E festőkészlettel (Solarbio) végeztük a gyártó utasításai szerint. Etanolba és xilolba merítés után a metszeteket gyantával felvittük, és fénymikroszkóp alatt (Olympus) megfigyeltük.

2,8|Nissl festés

A Nissl festés (Biyuntian) módszert alkalmaztuk a hippocampális szövetek metszeteinek neuronális sérülésének kimutatására. A metszeteket Nissl festéssel 30 percig inkubáltuk, és 95%-os etanollal mostuk. A megfestett sejteket megszámoltuk és fénymikroszkóppal (Olympus) fényképeztük. A sejteket három véletlenszerűen kiválasztott, nem átfedő mezőn számoltuk meg a hippocampális szövet mindegyik tárgylemezén, a túlélési indexet a túlélő neuronok száma/az idegsejtek teljes számaként határoztuk meg.

2,9|TUNEL festés

A hippocampális szövetek metszeteit proteináz K oldattal inkubáltuk 15 percig, majd TUNEL reakciókeverékkel (Beyotime) inkubáltuk. Háromszori PBS-es mosás után a metszeteket DAPI nukleáris festéket tartalmazó szerelőoldattal szereltük fel, és hagyományos fluoreszcens mikroszkóppal vagy konfokális lézerfluoreszcens mikroszkóppal figyeltük meg.

2.10|A 3TC céladatbázisának felépítése

A 3TC céladatbázisa két adatbázis alapján készült. Először a 3TC lehetséges célpontjait azonosították a Pharmmapper adatbázison alapuló fordított farmakodinámiás géntérkép segítségével (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/results/20081 6062539.html). Az összes kémiai komponenst a Chembiodraw ".mol2" formátumba konvertálta, és feltöltötte a Pharmmapper adatbázisba (1C. ábra). A 4-nél nagyobb normalizált illeszkedési pontszámú molekulákat.{7}} a 3TC potenciális célpontjaiként azonosították. Másodszor, a ChEMBL adatbázist (https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_re port_card/CHEMBL141/) használták a célpontok vagy vegyületek biológiai aktivitásának lekérdezésére. A 3TC potenciális célpontjaiként a Homo sapiensből származó fehérjéket azonosították.

2,11|Célfehérje kölcsönhatás elemzése és hálózatépítés

The target proteins screened were integrated for the protein-protein interaction (PPI) analysis using String 9.1 (http://string-db.org/) with the protein network interaction diagrams generated. Protein interactions with a confidence score >0.4 lett kiválasztva a tervezett beállításban az ismétlődések eltávolítása után.

A 3TC molekuláris mechanizmusainak átfogó vizsgálata érdekében a PPI-hálózatokat a Cytoscape szoftver 3.6-os verziójával hoztuk létre.0.(http://www.cytoscape.org/). A csomópontok fokelemzését a Centiscape 2.2-vel (http://apps.cytoscape.org/apps/centiscape) végeztük el, hogy a hálózatokban lévő hub géneket a közelségi centralitás értékével, a közötti központossági értékkel és a fokos centralitás értékével {{6 }}.2, 450 és 50.

2,12|Jelzési útvonalak gazdagítása és szűrése a 3TC számára

A DAVID bioinformatikai adatbázis (https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp) alapján a biológiai funkciók annotációjához génontológiai (GO) dúsítási elemzést végeztünk a biológiai folyamatokkal, sejtkomponensekkel és a potenciális célpontok molekuláris funkcióival. A KEGG metabolikus útvonalait a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) adatbázisai alapján annotáltuk az online KEGG Automatic Annotation Server (http://www.genome.jp/kegg/) segítségével.

2,13|A 3TC kötődése az előre jelzett célpontokhoz

A 3TC vegyület SDF szerkezeti fájljait a Pubchem webhelye szerezte be (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Az SDF fájlt az OpenBabel2.3.2 szoftver PDB fájllá alakította, az ADRB2 (PDBID:3KJ6), AKT1 (PDBID:4EKL) és EGFR (PDBID:6S9C) receptorfehérjéket pedig a Protein Data Bank adatbázisból (www.wwpdb) szereztük be. .org). A PYMOL2.3.4 szoftvert használtuk a víz és a ligandumok eltávolítására a receptorfehérjékből. A dokkolási vizsgálatot az AutoDock Vina (1.1.2) segítségével végezték, amely a Scripps által kifejlesztett nyílt forráskódú molekuláris dokkoló szoftver. A Tools szoftverrel módosították a négy receptorfehérjét, a Grid Box paranccsal pedig a Grid programban megnyitották a Grid Option eszközt az egyes receptorfehérjék elemzéséhez. A rácstávolságot 1-re állítottuk, és a zseb közepét a kötési hely középpontjaként.

2,14|Sejttenyésztés és kezelés

A HT22 egér hippocampális neuronális sejtvonalakat a Shanghai Cell Biotechnology Company-tól vásároltuk. A HT22 sejteket DMEM-ben tenyésztettük, amelyet 10% magzati borjúszérummal (FBS) egészítettünk ki. A sejteket a kísérleti kezelések előtt 1 nappal 6-lyuklemezekre oltottuk. A sejtek öregedését a Sigma-Aldrich cégtől vásárolt formaldehid (FA) indukálta, a korábban leírtak szerint. A 24 HT22 sejteket három csoportra osztották, beleértve a 24 órán keresztül 30 µmol/L FA-val kezelt FA-csoportot, az FA/3TC-t. 30 µmol/L FA-val és 50 µmol/L 3TC-vel is kezelt csoport, a kontrollcsoport pedig FA vagy 3TC nélkül tenyésztett.

2,15|Immunfluoreszcencia és mikroszkópia

A táptalajt eltávolítottuk, és a sejteket 2%-os paraformaldehid oldattal fixáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten. Az immunfluoreszcenciás kísérletet a korábban leírtak szerint végeztük.25 A vizsgálatban használt antitestek közé tartozott az anti LINE-1 ORF1p antitest (1:1000; Sigma-Aldrich) Alexa Fluor 594 másodlagos antitesttel (1:1000; Invitrogen). . A sejteket DAPI-val (1:500 hígítás; Thermo Fisher Scientific) 1 percig inkubáltuk, hogy megjelöljük a sejtmagokat. Az antifluoreszcenciás kioltó rögzítőszer hozzáadása után a sejteket konfokális mikroszkóppal (Nikon) figyeltük meg. 2,16|Western blot analízis

Az EGFR, a p-AKT1 (Active Akt1: S473-nál foszforilálva) és az ADRB2 expresszióját Western blot analízissel mértük. Különböző kezelések után az összes fehérjét összegyűjtöttük a sejtekből. A Western-blotot a korábban leírtak szerint végeztük.26 A vizsgálatban használt antitestek közé tartozott egy anti-EGFR antitest (1:500; Sigma-Aldrich), egy anti-pAKT1 antitest (1:1000; Sigma-Aldrich). és egy anti-ADRB2 antitest (1:200; Sigma-Aldrich) anti-nyúl másodlagos antitesttel (1:1000; Invitrogen). Mosás után a blotokat az ECL Western blotting detektáló rendszerrel (Amersham, Aylesbury, Egyesült Királyság) fejlesztettük ki.

2,17|Adatelemzés és statisztika

Mindegyik kísérletet legalább háromszor megismételték, és érvényesnek tekintették a hasonló eredményeket mutató kísérleteket. Az eredményeket átlag ± standard deviáció (SD) formájában adtuk meg. A szignifikáns különbséget vagy Student-féle t-próbával határoztuk meg p < 0,05 értékkel.

Kérdezz többet:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plusz 86 15292862950