A lamivudin javítja a SAMP8 egerek kognitív hanyatlását: az in vivo farmakológiai értékelés és a hálózat farmakológia integrálása
May 30, 2023
Taxol Alternatív kínai gyógynövények Cistanche
Kulcsszavak:Aspergillus favus · Jojoba · Endofita gombák · Arany nanorészecskék · Taxol · -Besugárzás · Táplálkozás optimalizálás
Bevezetés
A taxol az egyik leginkább kereskedelmi forgalomba hozott széles spektrumúrákellenes gyógyszerek[1]. A Taxol aktivitása a celluláris tubulin alegységek heterodimerjéhez való kötődés egyedi specifitásából adódik, elősegítve a tubulin polimerizációt, ezáltal megzavarva a tumorsejtek mitotikus osztódását [2]. A taxol erős aktivitást mutatott az emlő-, tüdő-, fej- és nyakrák, méhrák, valamint a Kaposi-szarkóma előrehaladott formái ellen [3]. A taxolt először a Taxus brevifolia "family Taxaceae" tiszafa kérgéből állították elő [4, 5]; azonban a Taxol alacsonyabb hozama az<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as asztma,gyulladás, ésrák[32]. Így ennek a munkának a fő célja az volt, hogy feltárjunk egy új gomba izolátumot jojoba növényből, amely egyedülálló metabolikus stabilitást biztosít a Taxol előállításához, hogy értékelje a különböző megközelítéseket a taxol hozam maximalizálására, valamint az extrahált Taxol vegyületek antiproliferatív aktivitásának fokozására. arany nanorészecskékkel való konjugáción keresztül, gamma-sugárzással.
Anyag és módszerek
Az endofita gombák izolálása és tenyésztése
A jojoba (Simmondsia chinensis) különböző részeit, mint leveleket, kérgeket, gallyakat és rügyeket a Kairói Egyetem Mezőgazdasági Karáról gyűjtöttük össze, és endofita gombák forrásaként használták fel. A növényi részeket összegyűjtöttük és folyó csapvíz alatt mostuk, a felületet 70 százalékos etanollal sterilizáltuk 1 percig, majd steril vízzel leöblítettük [28]. A felületen sterilizált növényi részeket steril körülmények között kis darabokra vágtuk, és burgonya dextróz agar (PDA) táptalajra, Czapek's-Dox-ra és malátakivonat agar táptalajra [33–36] helyeztük, majd a lemezeket 30 fokon inkubáltuk. 10 nap. A növényi részek felületi sterilizálásának hatékonyságát az öblítővíz centrifugálásával értékeltük, majd a csapadékhoz 500 ul steril vizet adtunk, és PDA táptalajra szélesztettük [37]. A tisztított endofita gomba izolátumokat ferde PDA-ra oltottuk 7 napig, és 4 fokon tároltuk.
A taxol szűrése, extrakciója és mennyiségi meghatározása az endofita gombákból
A jojobában élő, visszanyert endofita gombákat Taxol-termelésre szűrték burgonya-dextróz-levesen (PDB) [38]. A 7 napos gombaölő izolátumok mindegyikéből egy-egy dugót oltottunk be 100 ml PDB/250 ml Erlenmeyer-feladatokba, 15 napig inkubáltuk 30±1 fokon, rázó körülmények között (120 fordulat). Inkubálás után a tenyészeteket szűrjük, és a szűrletet 0,2%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal kiegészítjük a zsírsavak kicsapása érdekében. A taxolt diklór-metánnal extraháltuk, a szerves fázist összegyűjtöttük és szárazra pároltuk, majd a maradékot metanolban újra feloldottuk [17, 39]. A taxolt TLC-vel választottuk el és azonosítottuk Merck 1 mm-es (20×20 cm) előre bevont szilikagél lemezeken (TLC Silica gel 60 F254, Darmstadt, Németország), 254 nm-es UV megvilágítással detektáltuk [39]. A Taxol feltételezett foltjait lekapartuk a vékonyréteg-kromatográfiás szilikagél lemezekről, és feloldottuk metanolban, 10 percig erőteljesen vortexeltük, és 1000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 5 percig. A kicsapódott szilícium-dioxid részecskéket eltávolítottuk, és a felülúszót a Taxol mennyiségi meghatározásához és a tisztaság ellenőrzéséhez vettük C18 fordított fázisú oszlopon (Eclipse Plus C18 4).6. × 150 mm, 3,5 μm, katalógusszám 959 963–902). A használt mozgófázis metanol/acetonitril/víz (25:35:40, v/v/v) volt 1,0 ml/perc áramlási sebességgel 20 percig [40], és a Taxol-frakciókat 227 nm-en mértük, és A kémiai azonosságot és koncentrációkat a retenciós idő és az abszorpciós csúcs területe alapján igazoltuk, összehasonlítva az autentikus mintával.
A helyreállított endofita gombák morfológiai és molekuláris azonosítása
Az endofita gomba-izolátumokat makro- és mikromorfológiai jellemzőik alapján PDA, Czapek's-Dox és malátakivonat táptalajon történő tenyésztéssel azonosítottuk a referenciakulcsok szerint [33–36]. A legerősebb taxoltermelő gomba izolátumok azonosságát a belső átírt spacer (ITS) szekvenciája alapján molekulárisan is megerősítették [41, 42]. A gomba genomiális DNS-ét (gDNS) a micélium (~0,2 g) folyékony nitrogénben történő porításával extraháltuk, majd 1 ml CTAB extrakciós pufferben (2% CTAB, 2% PVP40), { {21}},2% 2-merkaptoetanol, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl 100 mM Tris-HCl-ben, pH 8,0). A PCR primer készletek a következők voltak: ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ és ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. A PCR-reakció 10 ul 2×PCR mesterkeveréket (i-Taq™, katalógusszám: 25027), 2 ul gDNS-t, 1 ul minden primert (10 pmol/ul) tartalmaz, és steril desztillációval 20 ul-ra egészítik ki. víz. A PCR-t a kezdeti denaturációra 94 fokon 2 percig, a denaturációt 94 fokon 30 másodpercig, a hőkezelést 55 fokon 10 másodpercig, az extenziót 72 fokon 30 másodpercig 35 ciklusig, és a végső extenziót 72 fokon 2 percig programoztuk. min. A PCR-amplikonokat 1,5%-os agaróz géllel elemeztük 1×TBE pufferben (Ambion Cat# AM9864), 1 kb DNS-létra (Kat. # PG010-55DI) segítségével, és géldokumentációs rendszerrel tettük láthatóvá. Az amplikonokat az Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, Version 6.0 szoftverrel tisztítottuk és szekvenáltuk, ugyanazokkal a primerkészletekkel. A kapott szekvenciákat nem redundánsan BLAST kerestük az NCBI adatbázisban, importáltuk a MEGA 6.0 szoftverbe, és a Clustal W izom algoritmussal igazítottuk [43], és a filogenetikai fát a MEGA 6.0 szomszéd-joining módszerével állítottuk össze [44].
Az extrahált taxol kémiai szerkezete
A Taxol feltételezett foltjait a vékonyréteg-kromatográfiás szilikagél lemezekről lekapartuk és megtisztítottuk, a tisztaságot és a koncentrációt UV-Vis analízissel határoztuk meg λ 227 nm-en (RIGOL, Ultra-3000 Series) az autentikus Taxollal összehasonlítva. [39]. A spektrofotometriás analízishez negatív alapvonalként azonos körülmények között üres tápközeget használtunk. A tisztított Taxol minták FT-IR spektrumát JASCO FT-IR 3600 spektrofotométerrel analizáltuk. A Taxol mintát KBr-pellettel őröltük, vákuum alatt korongokká préseltük, és az abszorpciót az autentikushoz képest 400-4000 cm−1 tartományban mértük [3]. Az extrahált Taxol kémiai szerkezetét HNMR spektroszkópiával (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) igazoltuk, összehasonlítva az autentikus Taxollal. A mintákat CDCl3-ban oldottuk fel, a kémiai eltolódásokat ppm-ben (δ-skála), a csatolási állandókat hertzben (Hz) adtuk meg.
Különböző típusú közegek hatása a taxoltermelésre
Mindegyik gomba-izolátum 7 napos tenyészetéből két agardugót (9 mm) oltottunk be három párhuzamosban 100 ml táptalaj/250 ml Erlenmeyer-lombikba burgonya dextrózt (PDB), Czapek's-Doxot (CZD), M1D-t és malátakivonatot (ME) ) húsleves táptalaj. Negatív kontrollként minden táptalaj nem oltott kontrolljait, amelyek mentesek a gombaspóráktól, 30 °C-on inkubáltuk 15 napig azonos körülmények között. Inkubálás után a gombakultúrákat leszűrjük, a taxolt extraháljuk és meghatározzuk a fent említett módon.
A táplálkozási feltételek biofolyamat-optimalizálása a taxolhozam maximalizálása érdekében
A táptalaj összetételének optimalizálását a hatásos gomba-izolátum Taxol-hozamának maximalizálása érdekében válaszfelületi módszertannal végeztük, Placket-Burman tervezést, majd központi kompozit tervezést alkalmazva [17–20, 45]. Az RSM-tervek közül az erős gomba-izolátum Taxol-termelését befolyásoló pozitív és szignifikáns változókat a Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, USA) statisztikai szoftvercsomagjával értékeltük. Minden kísérletet három biológiai ismétlésben végeztünk, és az átlagértékeket vettük figyelembe. A kívánt körülmények között végzett inkubálás után a gomba biomasszáját szűrtük, a taxolt extraháltuk, és mennyiségileg meghatároztuk TLC-vel és HPLC-vel a fent leírtak szerint.
Placket-Burman Design
A placket-Burman-tervet gyakran alkalmazták a táptalaj komponensének optimalizálására a gombák növekedéséhez és a bioaktív másodlagos metabolitok termeléséhez, értékelve a Taxol termelést befolyásoló jelentős változókat [18, 2{6}}, 46]. A faktor kiválasztása a kvalitatív és kvantitatív szűrés során használt médián alapult. Tizenegy tényező került bele; A malátakivonat, a pepton, a szacharóz, a szójaton, a glutamin, a marhahús kivonat, valamint a hőmérséklet, a pH, az inkubációs idő és a rázási sebesség értékeket és tényezőket két szinten változtattuk, és kiválasztottuk a minimális és maximális szinttartományokat. A statisztikai Design-Expert 7.0-t használták egy 12 kísérletből álló sorozat létrehozásához. Minden kísérletnél három biológiai ismétlésben határoztuk meg a Taxol termelést, és a Taxol hozam átlagát vettük figyelembe.
Az adatok regressziós elemzését statisztikai szoftver segítségével végeztük. Az egyes változók hatását a következő egyenlet segítségével számítottuk ki (Biometrika, 2020):
ahol E egy tesztelési változó hatása, M plusz és M− azoknak a kísérleteknek a Taxol-koncentrációja, amelyeknél a paraméter magasabb, illetve alacsonyabb szinten volt, N pedig az elvégzett kísérletek száma. Az egyes változók termelésre gyakorolt hatását a hozzájuk tartozó E-értékek kiszámításával határoztuk meg.
Ahol a Tot high az összes válasz a magas szinten, a Tot low az összes válasz alacsony szinten, a No pedig a kísérletek száma.
Központi összetett tervezés és a taxoltermelést befolyásoló tényezők közötti kölcsönhatások
A kiválasztott gomba izolátum Taxol termelését befolyásoló legjelentősebb pozitív tényezőket válaszfelület típusú CCD modell kísérleti tervvel optimalizáltuk [47]. CCD alkalmazásával a táptalaj komponenseinek koncentrációját optimalizáltuk, és a vizsgált kölcsönhatásaik alapján összesen 20 kísérletet generáltunk a három változóra. A hatékony gomba-izolátumból származó Taxol-termelés változóinak optimális szintjének meghatározásához háromdimenziós (3D) válaszfelületi görbéket rajzoltunk a különböző tényezők közötti kölcsönhatás tanulmányozására és az egyes, a Taxol termelést befolyásoló tényezők változó állapotának meghatározására. A 3D-s grafikonokat úgy készítettük el, hogy három faktor állandóját ideális szinten tartottuk, és ábrázoltuk a Taxol-hozam kapott választ a másik két faktor változó szintjére.
Gamma-besugárzás hatása a taxolhozamra
A taxolt termelő erős endofita izolátumokat 60kobaltforrással (gamma sejt 4000-A-India) -besugárzásnak tették ki, különböző gamma-sugárzás dózisokkal (0,25-3,0 kGy) összehasonlítva. a nem besugárzott tenyészet ellenőrzésére; dózisteljesítmény 1,2 kGy/h a kísérletek idején. Az optimalizált tápközeget a besugárzott tenyészettel oltottuk be standard tenyésztési körülmények között, összehasonlítva a nem besugárzott spóra oltóanyagával, mint kontrollként. A tenyészeteket 30±2 fokon 15 napon át rotációs rázógépen (120 fordulat/perc) inkubáltuk. Inkubálás után a tenyészeteket szűrjük, és a taxolt extraháljuk, tisztítjuk, és mennyiségileg meghatározzuk TLC-vel és HPLC-vel a fent leírtak szerint.
Arany nanorészecskék (AuNP-k) szintézise és jellemzése; Konjugáció Taxollal
A taxol rákellenes hatása
A tisztított Taxol és Taxol-PVP-AuNP konjugátumok májkarcinóma (HPG2) és emlőkarcinóma (MCF7) elleni aktivitását a 3- (4,5-dimetil-tiazol- 2-il) határozta meg. -2,5-difenil-tetrazólium-bromid (MTT) vizsgálat [48]. A 96-üregű lemezre lyukanként 103 sejtet oltottunk be, és egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk, majd különböző koncentrációjú gyógyszert adtunk hozzá, és a lemezeket 48 órán keresztül újra inkubáltuk. Hozzáadtuk az MTT-reagenst (25 ul) és 2 órán át inkubáltuk, majd λ570 nm-en megmértük a kifejlesztett formazán komplex lila színét. Az IC50-értéket a pozitív kontrollra normalizálódó tumorsejtek kezdeti számának 50 százalékának növekedését csökkentő gyógyszermennyiséggel fejeztük ki.
A Taxol és a Taxol-AuNP konjugátumok antimikrobiális aktivitása
A Taxol és Taxol-AuNPs konjugátumok antimikrobiális aktivitását különböző baktériumizolátumokkal szemben értékeltük; Bacillus subtilis ATCC 6633 és Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli és Enterobacter agglomerans, a Candida albicans mellett. A tesztelt baktériumsejteket steril pepton vízben szuszpendáltuk, így standard oltóanyagot kaptunk ~0,5 McFarland (1-1,5) × 1{{10}}8 CFU/ml λ6{{18 mellett. }}0 nm. A mikrobiális kórokozók növekedésének növekedési gátlását (mm) agar korong diffúziós módszerrel határoztuk meg. Pozitív kontrollként 6,0 mm átmérőjű, steril standard antibiotikum korongokat használtunk. Steril antibiotikum korongokat (6,0 mm) 20 ul metanollal és amoxicillin-klavulánsavval (AMC) töltöttünk negatív és pozitív kontrollként. A lemezekre azonos koncentrációjú Taxol, Taxol-PVP-AuNP és AuNP (1,0 ug/ml) került. Három biológiai ismétlést készítettünk. A lemezeket 37 fokon 24 órán át inkubáltuk, és megmértük a gátlási zónákat. Amoxicillin-klavulánsavat (AMC) és nystatint használtak a Taxol antimikrobiális aktivitásának normalizálására. A növekedés gátlási zónáját nóniuszos tolómérővel határoztuk meg (mm).
Statisztikai elemzések
Fisher legkisebb szignifikáns különbsége a post hoc tesztben.
Gombás lerakódás
Eredmények
Endofita gombák izolálása jojobából; Szűrés a Taxol-gyártáshoz
Huszonnégy endofita gomba-izolátumot nyertünk ki a PDA, CZD és ME táptalajon töltött jojoba kérgéből, gallyakból, leveleiből és bimbóiból. Ezeket a gomba-izolátumokat kéregből (6 izolátum), gallyakból (7 izolátum), levelekből (4 izolátum) és bimbóból (7 izolátum) származtatták, az 1. táblázat szerint. Ezeket a gomba izolátumokat eredetileg fajszintjük szerint azonosították morfológiai tulajdonságaik alapján. jellemzők az univerzális kulcsok szerint, amelyek három nemzetségbe tartoznak, nevezetesen az Aspergillus, a Penicillium és a Fusarium nemzetségbe. Ezen izolátumok között az Aspergillus nemzetség prevalenciája (83,4 százalék), míg a Fusarium és a Penicillium 8,3 százaléka volt. Az Aspergillus nemzetséget öt faj képviselte, nevezetesen A. favus (3 izolátum), Aspergillus oryzae (5 izolátum), A. niger (5 izolátum), A. fumigatus (4 izolátum) és A. terreus (3 izolátum). A kinyert gomba izolátumok Taxol termelékenységét PDB-n történő tenyésztéssel, standard körülmények között végzett inkubálással, extrakcióval és a Taxol mennyiségi meghatározásával TLC-vel és HPLC-vel értékeltük (1. ábra). Az eredményekből a maximális Taxol termelékenységet az A. favus Bd1 (88,65 µg/l), majd a P. polonicum Br1 (54,42 µg/l), az A. niger Lv1 (43,95 µg/l), az A. oryzae Bd1 követte. (38,87 µg/l), F. oxysporum Tw1 (26,80 µg/l), A. niger Lv2 (23.01 µg/l) és A. fumigatus Bd2 (17,62 µg/l) l). A legmagasabb gombatermelőkből származó Taxol szerkezeti kémiai azonossága az UV-Vis spektrumból derült ki, összehasonlítva az autentikus Taxol kémiai spektrumával. Ezenkívül a négy legerősebb gomba-izolátumból kivont taxol kémiai szerkezetét FT-IR elemzésekkel igazolták (1. ábra). Figyelemre méltó, hogy a hatékony gomba izolátumokból extrahált Taxol ugyanazt a spektrális paradigmát mutatta, mint az autentikus taxol. A 3393,3 cm-1-es csúcsot a hidroxilcsoporthoz (OH) rendeltük. Míg a 2923,5-nél lévő csúcsok az alifás CH-szakaszhoz voltak rendelve, az 1661.0 cm-1 csúcsok a C=O nyújtási frekvenciának felelnek meg. Az 1452,0–1404,0 cm−1-nél megfigyelt csúcs az NH nyújtási gyakoriságának köszönhető. A karbonilcsoport-oxigén nyújtási frekvenciát 1109 cm-1-nél figyeltük meg. Az 1020-979,7 cm-1 tartományban megfigyelt csúcsok az aromás C és H hajlatok jelenlétének köszönhetőek. A kromatográfiás és spektrális analízisből arra a következtetésre jutottunk, hogy az extrahált Taxol azonos az autentikussal. Nyilvánvalóan ugyanazon gombafajok metabolikus aktivitása nagymértékben ingadozott a különböző növényeknél, biztosítva az egyedi biológiai kölcsönhatást és a növényi részből származó specifikus jelek felszabadulását, ami a Taxol bioszintézis géprendszerének expresszióját váltja ki. Érdekes módon az anyagcsere-rendszer ingadozása nem csak a növényi részektől függ, hanem az izolátum-izolátum kölcsönhatástól is, például a jojoba levelein élő A. niger izolátumok Taxol hozama 43,9 µg/l volt, míg a A taxol nulla volt a növény kérgéből kinyert A. niger izolátum esetében.
A hatékony taxoltermelők morfológiai és molekuláris azonosítása
A Taxolt termelő erős gomba-izolátum morfológiai jellemzőit a makroszkópos és mikroszkópos leíró kulcsok szerint vizsgáltuk, az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint, és feltártuk morfológiai közelségét az A. favusszal (2. ábra). A gomba izolátumot PDA-n tenyésztették 30 fokon 10 napig, és a makroszkopikus és mikroszkopikus jellemzők feltárták az azonosságát, mint például a konídiumfejek, az elágazás módja, a stigma azonossága és a konidiális ontológia, valamint a termőtestek kialakulása az univerzális elv szerint. morfológiai kulcsok [33], és azt találták, hogy azonosak az Aspergillus favusszal. Az erős Taxol-termelő A. favus izolátumot ITS-szekvenciáik alapján azonosították, templátként gDNS-t használva. Az A. favus PCR-amplikonjait (~550 bp) rezolváljuk, tisztítjuk és szekvenáltuk (2. ábra). Az A. favus ITS szekvenciáját nem redundáns blast kereséssel végezték az NCBI adatbázisban, 99 százalékos hasonlóságot mutatva az A. favusszal, nulla E. értékkel és 95 százalékos lefedettséggel. Így a mikroszkópos és molekuláris elemzések alapján a megcélzott izolátum A. favus-nak bizonyult, és MW485934.1 nyilvántartási számmal letétbe helyezték a GenBankban, valamint az Assiut Egyetem Mikológiai Központjában (AUMC), Egyiptomban. letéti szám: AUMC13892. A jelenlegi izolátum 99 százalékos hasonlóságot mutatott az A. favus MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551 jelű izolátumokkal,
1. ábra A jojoba növény morfológiai képe. B Erőteljes Taxol-termelő endofita gombák lemeztenyészetei; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23) és A. oryzae Bd (25) PDA-n 8 napos, 30 °C-on végzett inkubáció után. A gomba izolátumokat PDB-n tenyésztettük, és standard körülmények között inkubáltuk, majd a Taxolt extraháltuk és TLC-vel ellenőriztük (C). D A Taxol HPLC kromatogramja az erős gomba izolátumokból. E Taxol hozama HPLC-vel kvantifikálva. F, A gomba izolátumokból extrahált taxol UV-Vis spektrális analízise. A kivont Taxol G FT-IR analízise az autentikushoz képest
2. ábra: Az A. favus, a jojoba endofitjának makromorfológiai jellemzői 3, 5 és 8 napos PDA-n történő növekedés után. Mikromorfológiai jellemzők, az A. favus konidiális feje 400-szoros nagyítással. Az A. favus ITS-régiójának 500 bp-s PCR-amplikonja, 1 kb-os létra normalizálódása (katalógusszám SM0312). D Az ITS A. favus filogenetikai elemzése a maximum likelihood módszerrel [44]
