A lizoszómális lipid-peroxidáció szabályozza a tumor immunitását
Sep 19, 2023
A palmitoil-protein tioészteráz 1 (PPT1) inhibitorok, például a DC661 által kiváltott lizoszómális gátlás sejthalált okozhat, de ennek mechanizmusa nem teljesen ismert. A DC661 citotoxikus hatásának eléréséhez nem volt szükség programozott sejthalál utakra (autofágia, apoptózis, nekroptózis, ferroptózis és piroptózis). A katepsinek gátlása, illetve a vas- vagy kalciumkelátképzés nem menti meg a DC661-indukált citotoxicitást. A PPT1 gátlása lizoszómális lipid-peroxidációt (LLP) indukált, ami lizoszómális membránpermeabilizációhoz és sejthalálhoz vezetett, amit az antioxidáns N-acetilcisztein (NAC) megfordíthatott, de más lipid-peroxidációs antioxidánsok nem. Az MFSD12 lizoszómális cisztein transzporterre volt szükség a NAC intralizoszómális transzportjához és az LLP megmentéséhez. A PPT1 gátlás sejten belüli immunogenitást eredményezett a kalretikulin felszíni expressziójával, amelyet csak NAC-val lehetett megfordítani. A DC661-kezelt sejtek beindították a naiv T-sejteket és fokozták a T-sejtek által közvetített toxicitást. A DC{12}}kezelt sejtekkel vakcinázott egerek adaptív immunitást és tumorkilökődést váltottak ki „immun meleg” daganatokban, de nem „immun hideg” daganatokban. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az LLP elősegíti a lizoszómális sejthalált, a sejthalál egyedülálló immunogén formáját, utat mutatva az immunterápia és a lizoszómális gátlás racionális kombinációihoz, amelyek klinikai vizsgálatok során tesztelhetők.
A cistanche tubulosa-Antitumor előnyei
Bevezetés
A lizoszómális inhibitor hidroxiklorokin (HCQ) (1), a palmitoil-protein-tioészteráz 1 (PPT1) azonosítása a klorokin-származékok molekuláris célpontjaként (2) és az új PPT1-inhibitorok klinikai forgalomba hozatala. vizsgálatokban (3, 4), meg kell érteni azt a mechanizmust, amellyel a lizoszómális inhibitorok sejthalált indukálnak, és a lizoszómális gátlás hatását a tumorimmunitásra. A HCQ esetében leírt lizoszómális sejthalál kanonikus mechanizmusa magában foglalja a lizoszómális membránpermeabilizációt (LMP), a katepsinek szivárgását és a kaszpáz által közvetített apoptózis aktiválását (5, 6). Korábban kimutattuk, hogy a DC661 lizoszómális inhibitor behatol a sejtekbe a savas tumor mikrokörnyezetben, és hatékonyabban lokalizálódik a lizoszómában, mint a HCQ (2, 7). A DC661 hatásos sejthalált okoz számos rákos sejtvonalban (2). A DC661 megköti és gátolja a PPT1-et, savtalanítja a lizoszómát és gátolja az autofágiát. A DC661 emellett LMP-t is indukál, és növeli a hasított kaszpáz 3 szintjét (2, 7). Az elmúlt években a sejthalál új, immunogén következményekkel járó mechanizmusait határozták meg, köztük a nekroptózist, a ferroptózist és a piroptózist (8). Kimutatták, hogy a lizoszómafüggő autofágia lebontja az I. osztályú MHC-t (9), valamint az immunproteaszóma összetevőit (10), ami arra utal, hogy az autofágia gátlása fokozhatja az antigénfeldolgozást. A lizoszómális gátlás és az azt követő sejthalál immunogén hatásait azonban nem jellemezték teljesen. Ennek a tudáshiánynak a megoldása érdekében megvizsgáltuk a DC661 hatásait a kanonikus sejthalál mechanizmusaira, hogy meghatározzuk, hogy a lizoszómális sejthalál a sejthalál formája, vagy egyszerűen valamelyik másik kialakult mechanizmus előfutára. Megállapítottuk, hogy a HCQ és a DC661 csak kis számú fehérjében indukált szignifikáns növekedést a melanoma proteomában, és ezek többsége autofágiával és apoptózissal kapcsolatos fehérje volt. A programozott sejthalál gátlói (apoptózis, nekroptózis, ferroptózis és piroptózis) nem csökkentették a citotoxikus hatásokat a DC661 által okozott lizoszómális károsodás után. A lizoszómális lipidperoxidáció (LLP) az LMP által kiváltott sejthalál fő hajtóereje, amely a calreticulin (CALR) sejtfelszíni expressziójához kapcsolódik. A sejthalál ezen formája csak az N-acetilcisztein (NAC) antioxidáns használatával állítható vissza. A NAC aktivitást az MFSD12 lizoszómális ciszteinimporter gátlása rontotta. Az LLP immunogén fenotípusokat váltott ki, elősegítve a T-sejtek által közvetített pusztulást. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a lizoszómális sejthalál az immunogén sejthalál potenciálisan egyedülálló formája.
cistanche növény-növelő immunrendszer
Eredmények
A lizoszómális gátlás jelentős változásokat indukál az autofágiával és apoptózissal kapcsolatos proteomokban. A lizoszómális inhibitorok citotoxikus hatásának megállapításához megvizsgáltuk a vakuoláris H+-ATPáz inhibitor bafilomycin-A1-gyel kezelt A375P melanoma, RKO vastagbél karcinóma és MIA PaCa-2 hasnyálmirigyrák sejtvonalak életképességét (1 00 nM); PPT1 inhibitorok DC661 (3 μM) vagy HCQ (10 μM vagy 30 μM); palmitát mimetikus hexadecil-szulfonil-fluorid (HDSF; 60 μM); katepszin inhibitorok pepsztatin A (PepA; 10 ug/ml), E64 (PepA; 10 ug/ml) vagy PepA+E64; és lizoszóma membránbontó Leu-Leu metilészter-hidrobromid (20 μM) 48 órán át. Csak a bafilomycin-A1 és a DC661 okozta a sejtek életképességének szignifikáns csökkenését a rákos sejtvonalakban (1A ábra és 1A kiegészítő ábra; kiegészítő anyag online elérhető ehhez a cikkhez; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), a DC661 termelésével. a sejtek életképességének mélyebb csökkenése, mint a bafilomicin-A1. Ezen adatok és a klorokin-származékok farmakológiai gyógyszerszerű tulajdonságai alapján vizsgálatunkat a klorokin-származékokra, mint a lizoszómás sejthalál megértésének eszközeire összpontosítottuk. A DC661-gyel (3 μM) vagy a kevésbé erős HCQ-val (10 μM vagy 30 μM) 24 órán keresztül kezelt A375P melanomasejteken elfogulatlan globális proteomanalízist alkalmaztak. A 4264 nagy megbízhatóságú mennyiségileg meghatározott fehérje közül csak 87 és 55 fehérje nőtt szignifikánsan a DC661 (3 μM) és a HCQ (30 μM) hatására; emellett 14 és 15 fehérje szignifikánsan csökkent a DC661 (3 μM) és a HCQ (30 μM) hatására (az abszolút változás 2-nél nagyobb; q < 0,05) a DC661 (3 μM), illetve a HCQ (30 μM) hatására. , összehasonlítva a jármű kontrolljával. A HCQ alacsonyabb dózisa (10 μM) nem mutatott szignifikáns fehérje változást a hordozó kontrollhoz képest. A DC661-kezelést követően szignifikánsan megnövekedett 50 fehérje főként autofágiával és apoptózissal volt összefüggésben, és hasonló változásokat figyeltek meg a HCQ magasabb dózisa esetén (1B. ábra). Ezen okok miatt úgy döntöttünk, hogy a további tanulmányokat az erősebb DC661-re összpontosítjuk. Az autofágiával és apoptózissal összefüggő legnagyobb fehérjeváltozások közül néhányra példa a tax1-kötő fehérje 1 (TAX1BP1; 15--szeresére nőtt); BCL2-kölcsönhatásba lépő fehérje 3 (BNIP3; 6-szeresére nőtt); a BRCA1 gén 1 fehérje szomszédja (NBR1; 12--szeresére nőtt); sequestosome-1 (SQSTM1/p62; 5-szeresére nőtt); nukleáris receptor koaktivátor 4 (NCOA4; 3--szeresére növelve); és LC3B (MAP1LC3B; 3--szeresére nőtt). Az apolipoprotein B-100 (APOB; 66--szeresére nőtt) a borjúmagzati szérumból származik, és nem vizsgálták tovább. Az immunoblot vizsgálat megerősítette, hogy a DC661 vagy magasabb koncentrációjú HCQ kezelés jelentős növekedést okozott az autofágia cargo receptorok NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 és NCOA4 expressziójában dózis- és időfüggő módon (1. kiegészítő ábra, B és C). A PPT1 CRISPR/Cas9 KO-ja az A375P sejtekben fenomásolja a DC661 hatásait ezekre a fehérjékre, összehasonlítva WT társaikkal (1D. kiegészítő ábra). Az autofágia rakományreceptorok expressziója és a DC661-kezelés által kiváltott relatív növekedés azonban változó volt a vastagbélrák, a hasnyálmirigyrák és más melanoma sejtvonalak között, amelyekben a DC661 citotoxicitást mutat (1E. kiegészítő ábra). Ez arra utalt, hogy maguk az autofágia rakományreceptorok, bár fehérjeszinten megnövekedtek, valószínűleg nem felelősek a DC661 kezelést követő sejthalálért. Ennek megerősítésére a TAX1BP1 és BNIP3 autofágia cargo receptorokra összpontosítottunk, mivel ismert proapoptotikus hatásuk van rákos sejtekben (1C. ábra). A TAX1BP1 egy autofágia rakományadapter (11), és szabályozza a fehérjeszintézis-gátlók vagy DNS-károsító szerek által kiváltott apoptózist is a rákos sejtekben (12). A TAX1BP1 siRNS általi leütése (1D. ábra) nem befolyásolta a DC{119}}indukált citotoxicitást a rövid távú (1E. ábra) és a hosszú távú életképességi vizsgálatokban (1F. ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a TAX1BP1 nem játszik alapvető szerepet a DC{126}}közvetített citotoxicitásban. A BNIP3 egy proapoptotikus fehérje, amely károsítja a mitokondriális bioenergetikát és szabályozza a mitofagiát (13). A BNIP3 hatékony leütése (1G. ábra) nem befolyásolta a DC{131}}indukált citotoxicitást (1., H. és I. ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a DC661 citotoxikus hatásai függetlenek a BNIP3 expressziójától. Ezt követően tanulmányoztuk az autofagoszóma termeléséhez szükséges kanonikus autofágia gének kimerülő sejtjeit a DC661 hatékonyságára az unc{136}}, például az autofágiát aktiváló kináz 1 (ULK1) és az autofágiával kapcsolatos 7 (ATG7) gén leállításával. Az ULK1 vagy ATG7 hatékony leütése (2. kiegészítő ábra, A és B) gátolta az autofág fluxust (2C. kiegészítő ábra), de nem befolyásolta a DC{146}} által kiváltott citotoxicitást (1. ábra, J–M). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az alapvető autofágia gépezet hiánya nem szünteti meg a DC661 citotoxikus hatásait. A DC661 által okozott lizoszómális gátlás több programozott sejthalál útvonalat indukál. A kanonikus álláspont szerint a lizoszómális sejthalál az apoptózis következménye (5). Az immunoblot vizsgálat kimutatta, hogy a DC661 kezelés a kaszpáz-3, -7 és -9 aktiválódását, valamint a PARP-1 hasítását eredményezte, ami megerősítette, hogy a DC661 aktiválta az apoptózist (2A. ábra). A pán-kaszpáz inhibitor Z-VAD-FMK megakadályozta a DC661 kaszpáz aktiválását, de nem gátolta az LC3B és a p62 felhalmozódását, bizonyítva, hogy az apoptózis aktiválása és az autofágia blokád elválasztható a lizoszómális gátlást követően (2B. ábra). Az apoptózis blokkolása ZVAD-FMK-val nem fokozta vagy korlátozta a DC661 citotoxicitását, ami arra utal, hogy az apoptózis nélkülözhetetlen a lizoszómális sejthalálhoz (2. ábra, C és D). A DC661 citotoxikus hatásai hasonlóak voltak az apoptózisra képtelen Bax/Bak kettős-KO primer csontvelősejtekben és a WT-sejtekben (2E. ábra). Az apoptózis blokkolása nem befolyásolta a DC{171}}indukált citotoxicitást vastagbélrákban és hasnyálmirigyráksejtekben sem (2. kiegészítő ábra, D–F). Mivel úgy találtuk, hogy az apoptózis nélkülözhetetlen a DC661-indukált sejthalálhoz, megvizsgáltuk, hogy a DC661 indukál-e nekroptózist, a programozott sejthalál egy másik formáját, amelyet a receptor-interacting protein kinase (RIPK) és a kevert vonalú kináz doménszerű fehérje szabályoz. MLKL). A RIPK és az MLKL foszforilált és aktivált formáinak szintje 0,1-1 μM-ról DC661-kezelést követően emelkedett (2F ábra). 3 μM DC661-nél hiányzik a foszforilált RIPK1, de a perzisztens foszforilált MLKL, ami arra utal, hogy ennél a magasabb koncentrációnál a sejthalál további formái is bekapcsolódhatnak. A RIPK1 gátló necrostatin{186}} vagy necrostatin-1s vagy az MLKL gátló nekroszulfonamiddal végzett előkezelés megakadályozta a RIPK1 foszforilációját a DC661 (1 μM) kezelés után melanomasejtekben (2G ábra), de nem sikerült megmenteni a DC{{192-t }}indukált citotoxicitás melanomasejtekben (2H. ábra) vagy vastagbélrákban vagy hasnyálmirigyrák sejtekben (2G. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a nekroptózis aktiválódik, de nélkülözhetetlen a DC{195}}közvetített sejthalálhoz.
1. ábra: A lizoszómális autofágia gátlása jelentős változásokat indukál az apoptózisban és az autofágia fehérjékben. (A)
A lizoszómák a vas egyik fő raktárhelyei. A szabályozatlan intracelluláris vasanyagcsere és a csökkent reduktív kapacitás párosulva kiválthatja a ferroptózis néven ismert nem apoptózisos sejthalált. A ferroptózis egyik jellemzője a prosztaglandin-endoperoxid szintáz 2 (PTGS2), a kationtranszport szabályozó homológ 1 (CHAC1) és a ciszteinil-tRNS szintetáz (CARS) fokozódása (14). A DC661-kezelés mindhárom ferroptózis markert transzkripciósan felerősítette (3A ábra), ami arra utal, hogy a lizoszómális gátlás ferroptózist indukál. A DC661 fluoreszcencia eltolódást indukált a C11-BODIPY-vel kezelt A375P sejtekben, ami a ferroptózisra jellemző lipidperoxidációt jelez. Ez a DC661-indukált eltolódás szignifikánsan megfordult ferroptózis-gátló ferrosztatin-1 vagy ajak-roxstatin-1 jelenlétében hatékony koncentrációban (3B. ábra és 3A. kiegészítő ábra), ami tovább jelzi, hogy a DC661 indukált ferroptózis. A ferroptózis gátlása azonban nem mentette meg a DC661-hez kapcsolódó citotoxicitást (3. ábra, C és D). A rákos sejtek vaskelátképző deferoxaminnal (DFO) és DC661-gyel történő együttes kezelése nem menti meg a DC661 citotoxicitását (3E. ábra). A ferrosztatin-1, ajakroxsztatin-1 vagy DFO-val végzett kezelés nem mentette meg a DC661 által a rövid távú életképesség vagy a hosszú távú klonogén növekedés gátlását melanoma-, vastagbél- és hasnyálmirigyráksejtekben (3. kiegészítő ábra, B –E, és 4. kiegészítő ábra, A–D). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a ferroptózis aktiválódik, de nélkülözhetetlen a DC661-közvetített sejthalálhoz. A piroptózis a programozott sejthalál egy olyan gyulladásos válaszhoz társuló formája, amely magában foglalja a gasztrint (GSDM) feldolgozó kaszpázok aktiválódását, lehetővé téve a pórusok kialakulását a plazmamembránon és a károsodáshoz kapcsolódó molekuláris minták, például a nagy mobilitású felszabadulását. csoportdoboz 1 (HMGB1). A DC661 kezelés többszörös melanoma sejtvonalakban (A375P, A375, WM35 és WM793) a piroptózisra jellemző iniciátor kaszpáz-8 és -9, valamint a hóhér kaszpáz-7 aktiválását eredményezte, és létrejött. a teljes hosszúságú GSDME hasítása, hasonló mértékben az ismert PLX4720 és PD0325901 piroptózis-indukálókhoz (5A. kiegészítő ábra). A DC661 erősebb extracelluláris HMGB1-felszabadulást produkált, mint az ismert piroptózis-indukáló, a BRAF és a MEK-gátlás 1%-os FBS-ben (15), ami az aktivált piroptózis funkcionális következményeit tükrözi. Ezután megvizsgáltuk, hogy a piroptózis GSDME KO általi gátlása javítja-e a DC661 citotoxikus hatásait. A DC661 kezelés LC3II és SQSTM1/p62 akkumulációt és kaszpázaktivációt indukált, de a HMGB1 felszabadulása szinte teljesen megszűnt a GSDME-KO WM35 humán sejtekben, bizonyítva, hogy a piroptózis gátlásának funkcionális következménye megvalósult (3F ábra). Azonban a DC661 kezelés azonos citotoxicitást produkált YUMM1.7 WT, üres vektor (EV) és Gsdme KO1 és KO2 sejtekben 10% és 1% FBS körülmények között (3G ábra és 5B kiegészítő ábra). A sejthalál többféle formájának egyik gyakori eredménye az LDH felszabadulása. A DC661 szignifikánsan megnövelte az LDH felszabadulását, és ezt nem lehetett visszafordítani apoptózissal, nekroptózissal vagy ferroptózis gátlással (5C. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a DC661 többféle sejthalált indukál, beleértve az apoptózist és a piroptózist, valamint a nekroptózist és a ferroptózist, de a sejthalál egyik módja sem szükséges a DC{73}}indukált sejthalálhoz. A katepszin-gátlás vagy a kalcium-kelátképzés nem akadályozza meg a lizoszómális membrán permeabilizációjából adódó sejthalált. Miután kimutattuk, hogy a kaszpáz aktiválása (amely szükséges az apoptózishoz és piroptózishoz) nélkülözhetetlen a DC661-indukált sejthalálhoz, feltételeztük, hogy a lizoszómákból történő katepszin felszabadulása kaszpázfüggő sejthalált okozhat. A PPT1 kémiai (DC661) vagy genetikai (PPT1 siRNS [siPPT1]) gátlása lizoszómális membránpermeabilizációt (LMP) eredményezett, míg a HDSF, a PPT1 kevésbé erős irreverzibilis inhibitora, amely gyorsan kimerül a sejttenyészetben, a mérések szerint nem tudta indukálni az LMP-t. galectin-3–pozitív puncta (4A. ábra). Az LMP katepsinek és más lizoszómális tartalmak felszabadulását eredményezi a citoplazmában, és a lizoszóma-alapú sejthalál kulcsfontosságú proximális jellemzője. A DC661 által indukált LMP a citoplazmatikus katepszin-L aktivitás szignifikáns növekedésével járt együtt, amelyet az E64 cisztein-proteáz inhibitor szignifikánsan blokkolt (4B. ábra). Korábbi jelentések azt sugallták, hogy a katepszin felszabadulása a törött lizoszómákból elősegíti a kaszpáz aktivációt, ami apoptotikus sejthalálhoz vezet (16–18). A teljes katepszin-gátlás nem akadályozta meg a kaszpáz hasítását (4C. ábra), és nem menti meg a DC661-indukálta citotoxicitást a rövid és hosszú távú életképességi vizsgálatokban melanómában (4. ábra, D és E), vastagbélrákban és hasnyálmirigyben. rákos sejteket (6. kiegészítő ábra, A–C). Ezek az eredmények ellentmondanak a lizoszómális sejthalál kanonikus nézetének, amelyet a katepszin által közvetített sejthalál okoz. A szivárgó lizoszómákból történő katepszin felszabadulás mellett a lizoszómákból történő kalcium felszabadulás is szerepet játszik a sejtműködési zavarban, ha a PPT1 károsodott (19). A DC661-kezelés kiterjedt kalciumfelszabadulást eredményezett, amelyet a sejtben állandó kalcium (Ca{101}}) kelátképző, a BAPTA-AM előkezelése megszüntetett. (4F. ábra). Nevezetesen, a BAPTA-AM nem akadályozta meg a DC{105}}indukált LMP-t (4G. ábra) vagy a kaszpáz hasítást (6., D és E. kiegészítő ábra), és ami a legfontosabb, nem menti meg a DC{108}}indukálta citotoxicitást ( 4H ábra). Ezeket az eredményeket mind az RKO, mind a MIA PaCa{110}} sejtvonalakban megfigyelték, amelyekben nem figyeltek meg szignifikáns különbséget az IC50 értékekben a BAPTA-AM és a DC661 esetében (6F. kiegészítő ábra), ami arra utal, hogy az LMP-vel összefüggő sejthalál nem függ a kalciumtól vagy a katepszintől.
2. ábra: DC661-indukált apoptózis és nekroptózis. (A)
3. ábra: DC661-indukált ferroptózis és piroptózis. (A)
Az LLP meghajtja az LMP-t. Miután megállapítottuk, hogy a fő sejthalál utak (apoptózis, nekroptózis, ferroptózis és piroptózis), katepsinek (PepA és E64) és ionkelátorok (BAPTA-AM [Ca2+] és DFO [Fe{{3}) gátlói. }]) nem akadályozta meg a DC661 által okozott sejthalált, és a C-11-BODIPY lipidperoxidációra utaló jeleket találva globális lipidomaanalízist végeztünk a DC661 kezelés után 2 és 4 órával. A DC661 korai és tartós 3--10-szeres növekedést indukált a lizofoszfolipid minden osztályában (5A. ábra). Ezzel szemben minimális vagy semmilyen változást nem észleltek a foszfolipid osztályokban, beleértve a foszfatidil-kolint, foszfatidil-etanol-amint, foszfatidil-szerint, foszfatidil-inozitot, foszfatidil-glicerint és foszfatidsavat (7A. kiegészítő ábra). Lizofoszfolipid fajokat hozhat létre a ROS, amely oxidálja a telített zsírsavláncot, amelyet azután a foszfolipázok hasítanak le (20). Annak megállapítására, hogy az antioxidánsok képesek-e megakadályozni a ROS által közvetített lipidkárosodást, megvizsgáltuk a DC{16}}indukált citotoxicitást a pán-ROS megkötő N-acetilcisztein (NAC) (21, 22) és a feltételezett lipid-peroxidációt gátló Trolox (23) jelenlétében. ) és C-vitamin (aszkorbinsav) (24, 25). Az eddig tesztelt többi szertől eltérően a NAC-val történő együttes kezelés több sejtvonalon megmentette a DC{24}}citotoxicitást (5B. ábra és 7B. kiegészítő ábra). A hosszú távú CFU-tesztek azt mutatták, hogy a NAC az összes itt vizsgált sejthalál-gátlóval, ionkelátképzővel és katepszin-gátlóval ellentétben megakadályozta a DC661 citotoxikus hatásait A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 és MC38 sejtekben. 5C. ábra és 7C. kiegészítő ábra). Érdekes módon a Trolox és a C-vitamin nem mentette meg a DC661 citotoxicitást humán melanomában, vastagbélrákban, hasnyálmirigyrák sejtekben, valamint egér melanóma és vastagbélrák sejtekben (5D ábra és 7. kiegészítő ábra, D-H). Ez az eltérés arra késztetett bennünket, hogy megvizsgáljuk, hogy a NAC, a Trolox és a C-vitamin befolyásolja-e az LMP-t. Eredményeink azt mutatták, hogy a NAC volt az egyetlen antioxidáns, amely jelentősen csökkentette a DC661-indukált LMP-t (5E. ábra). Feltételeztük, hogy az LLP a DC661 által irányítja az LMP-termelést, amit a NAC visszaállíthat, de a Trolox és a C-vitamin nem. Az LLP folyamatának tanulmányozásához a FOAM-LPO (26) fluoreszcens szondát használtuk, amely specifikusan a lizoszómára lokalizálódik és termel. spektrális eltolódás 586 nm-ről 512 nm-re (pirosról zöldre), ha lipid-peroxidoknak van kitéve. Azt találtuk, hogy a DC661 LLP-t indukált a kontrollhoz képest (5F. ábra). A NAC csökkentette a lipid-peroxidációt a DC661-kezelt melanomasejtek lizoszómáiban, míg a Trolox és a C-vitamin nem csökkentette az LLP-t (5F. ábra). A NAC, a Trolox és a C-vitamin önmagában nem volt jelentős hatással a lipidperoxidációra. A PPT1 leütése (8A. kiegészítő ábra) vagy a magas koncentrációjú HCQ-val végzett kezelés (8B. kiegészítő ábra) szintén LMP-t indukált, amelyet a NAC megfordíthatott, míg az ULK1 kémiai gátlása nem indukált LMP-t (8C. kiegészítő ábra). Fontos, hogy az siPPT1 leütése magában foglalta az LLP-t is, amely NAC-val megfordítható (8D. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a PPT1 gátlása olyan LLP-t indukál, amelyet a NAC meg tud menteni, és valószínűleg ez az oka a PPT1- gátlás által kiváltott LMP-nek. Továbbá ezek az eredmények arra utalnak, hogy az LLP kritikus a lizoszómális sejthalál szempontjából.
Kínai gyógynövény-cisztanche növény-Antitumor
A ciszteinnek a lizoszómákba történő behozatala az MFSD12-vel gyengíti a lizoszómális sejthalált. A 3 lipidperoxidáció-gátló közül csak a NAC akadályozta meg az LLP-t. Egy nemrégiben készült jelentés kimutatta, hogy a 12-t tartalmazó fő facilitátor szupercsaládi domén (MFSD12) a lizoszómák és melanoszómák ciszteinimportőre alapvető összetevője (27). Megállapítottuk, hogy a NAC vagy metabolitja, a cisztein az MFSD12-n keresztül a lizoszómába kerül, ahol a cisztein diszulfidjává, ciszteinné oxidálódik. Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez összehasonlítottuk a NAC azon képességét, hogy megmentse a DC661 citotoxicitást siNT és siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP sejtekben. Eredményeink azt mutatták, hogy a NAC megmentette a DC{11}}indukált LMP-t a siNT sejtekben, de nem mentette meg az LMP-t siMFSD12 sejtekben (6A. ábra). A NAC csökkentette a DC{14}}kezelt siNT-A375P sejtek LLP-jét, de nem csökkentette az siMFSD12 sejteket. a DMSO-val vagy NAC-val kezelt siMFSD12 sejtekben megnövekedett a bazális LLP (6B. ábra) a siNT sejtekhez képest. Míg a NAC megmentette a DC661 citotoxicitást a siNT sejtekben, a NAC azon képessége, hogy megmentse a DC661 citotoxicitást, teljesen megszűnt az siMSFD12 sejtekben (6C. ábra). Ez azt mutatta, hogy az MFSD12 knockdown blokkolja a NAC citoprotektív hatásait a DC661 ellen. A NAC-t a citoszolban lévő aciláz dezacetilezi (28). Annak meghatározására, hogy a NAC-kezelés cisztein vagy cisztin felhalmozódását okozza-e a lizoszómákban, a lizoszómális immunprecipitációs (Lyso-IP) technikát (29) alkalmaztuk a lizoszómák DMSO-val és NAC-kezelt A375P sejtekből való tisztítására (6D ábra és 9A kiegészítés). célzott metabolomika a NAC és a kapcsolódó metabolitok számszerűsítésére. Ahogy az várható volt, NAC-t detektáltunk a NAC-kezelt teljes sejt lizátumban és a kapcsolódó kötetlen frakciókban. Az L-cisztein szintje jelentősen megemelkedett a NAC-kezelt lizoszómákban. Az L-cisztin csak a NAC-val kezelt lizoszómákban volt kimutatható. Meglepő módon nem találtunk szignifikáns növekedést a glutation (csökkentett) mennyiségében a NAC-kezelt csoportokban (6E. ábra); ez meglepő volt, mert az általános vélekedés szerint a NAC-kezelés fokozza a glutation termelését, korrigálja a redox egyensúlyt. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az MFSD12 importőrön keresztül a lizoszómákba importált cisztein kritikus fontosságú az LLP, az LMP és a lizoszómás sejthalál megmentésében. Az LLP immunogén. A DC661 által kiváltott szabályozott sejthalál egyes formáit (piroptózis, nekroptózis, ferroptózis) immunogénként azonosították. Korábban már leírták az immunogén sejthalált a kemoterápiás gyógyszerekre jellemző jellemzők alapján, amelyek magukban foglalják a károsodással összefüggő molekuláris minták megjelenítését, beleértve a CALR sejtfelszíni expresszióját, valamint a HMGB1 fehérje és az adenozin-trifoszfát (ATP) felszabadulását (30). A CALR „egyél meg” jelként működik, amikor a sejtfelszínnek vannak kitéve sejtstressz során. A HMGB1 és az ATP extracelluláris felszabadulása a fagocita sejtek által felismert „keress meg” jelként működik. Két modellt hasonlítottunk össze: a B16F10 sejteket, amelyek a szingenikus tumormodellekben szinte teljesen mentesek a tumorba infiltráló limfocitáktól, és az MC38 sejteket, amelyekben a szingén tumormodellekben valóban vannak tumorba infiltráló limfociták. Először is kimutattuk, hogy a DC661 vagy siPpt1 kezelés szignifikánsan indukálja a felületi CALR expressziót, amely NAC-kezeléssel teljesen megszüntethető MC38 sejtekben (7., A. és B. ábra). Hasonló eredményeket figyeltek meg a B16F10 sejtekben (7C. ábra). A fő sejthalál utak (apoptózis, nekroptózis, ferroptózis és piroptózis) gátlói nem tudták megakadályozni a CALR felszíni expresszióját (7D. ábra). Annak meghatározására, hogy a DC661 által indukált immunogén sejthalál az MHC I. osztályú upregulációnak köszönhető-e, a B16F10 és MC38 sejteket DC661-gyel (3 μM) vagy DMSO-val kezeltük 24 órán át. Azt találtuk, hogy a DC661-kezelés nem növelte az MHC I. osztályú expresszióját és az immunproteaszóma-upregulációt (7E. ábra és 9. kiegészítő ábra, B és C).
4. ábra. A katepszin-gátlás vagy a kalciumkeláció nem akadályozza meg a DC661-indukált sejthalált. (A)
Annak érdekében, hogy megértsük az autofágia gátlásának a T-sejtek beindítására gyakorolt hatását, egy in vitro priming és coculture kísérletet végeztünk C57BL6/J lépsejtek felhasználásával a korábban leírtak szerint (31). Az alapozáshoz a lépsejteket DC661- vagy DMSO-val kezelt B16F10 vagy MC38 sejtekkel exponáltuk. Ezután ezeket a beindított lépsejteket élő B16F10 vagy MC38 sejtekkel tenyésztettük, és mértük a citotoxicitást (8A. ábra). A DC661-kezelt B16F10 sejtekkel előállított lépsejtek szignifikáns növekedést mutattak az IFN-ben a DMSO-val kezelt B16F10 sejteknek kitett lépsejtekhez képest. A proliferáló B16F10 sejtek aktivált T-sejt által közvetített elpusztítása szignifikánsan megnövekedett a DC661-primed lépsejtekben, összehasonlítva a DMSO-val aktivált lépsejtekkel (8. ábra, B és C). A DC661-gyel kezelt MC38 sejtek még több IFN- és aktivált T-sejt citotoxicitást produkáltak a B16F10 sejtekhez képest (8. ábra, D és E). A DC661-gyel végzett NAC-kezelés képes volt teljesen megszüntetni az IFN-felszabadulást a lépsejtekből, és tompította a T-sejtek citotoxicitását (8. ábra, F és G). A kalretikulin siCalr általi leállítása MC38 sejtekben (9D. kiegészítő ábra) megszüntette a DC661 kezelés beindítási hatékonyságát, és jelentősen csökkentette a beindított T-sejtek citotoxicitását (8. ábra, H és I). Összességében ezek az adatok alátámasztják az LLP-vel összefüggő CALR-upreguláció mechanikus szerepét a tumorellenes sejt T-sejt-immunitás elősegítésében. Ezután ezeket az in vitro eredményeket kiterjesztettük egy in vivo tumorellenes vakcinációs vizsgálatra immunkompetens és immunhiányos egereken. Ehhez a vizsgálathoz in vitro fagyasztva-olvasztott vagy DC{40}}kezelt B16F10 vagy MC38 sejteket injektáltunk szubkután a bal szárnyba, hogy megvédjük az immunkompetens C57BL/6 vagy NOD/SCID egereket az újbóli fertőzéstől azonos típusú injektált élő tumorsejtekkel. 7 nappal később a jobb szárnyba (9A. ábra). A DC661-kezelt B16F10 sejtek az in vitro vizsgálatok ellenére sem tudták megakadályozni a tumorkilökődést, ami arra utal, hogy a DC661 immunogén sejthalált indukált (9B. ábra és 9E. kiegészítő ábra). Ezzel szemben az egyik oldal DC661-kezelt MC38 sejtekkel történő beoltása elősegítette a másik oldalra beültetett élő MC38 sejtek teljes kilökődését (9C. ábra és 9F. kiegészítő ábra). Annak megállapítására, hogy az adaptív immunitás kritikus volt-e a DC661 vakcina hatásában, amelyet az MC38 daganatok esetében kifejtett, megismételtük a kísérletet NOD/SCID egereken. Meglepő módon azt találtuk, hogy a DC{61}}kezelt MC38 sejtek nem indukálták az újrafertőzött daganatok kilökődését immunhiányos NOD/SCID egerekben (9D. ábra és 9G. kiegészítő ábra), ami azt jelzi, hogy a megfigyelt vakcinahatáshoz adaptív immunitásra volt szükség. Ennek a megállapításnak a szilárdságának tesztelésére kiválasztottunk egy másik jól ismert immunogén egérrák sejtvonalat, a CT26-ot, és elvégeztük a fenti vakcinázási kísérletet. Ahogy az várható volt, a DC661-kezelt CT26 sejtek beültetése az egér egyik oldalába vakcinaszerű hatást váltott ki, és megakadályozta a másik oldalra beültetett élő CT26 sejtek kiszaporodását (9E. ábra és 9H. kiegészítő ábra). Eredményeink arra utalnak, hogy a DC661-indukált LLP kritikus fontosságú az LMP által közvetített immunogén sejthalál szempontjából, amelyet megfordít azáltal, hogy az MFSD12 lizoszómális transzporter ciszteint importál a lizoszómába (9F. ábra).
Vita
A lizoszómális gátlás ígéretes terápiás megközelítésnek tűnik a preklinikai vizsgálatokban, és a HCQ klinikai vizsgálatok biztató, de vegyes eredményeket hoztak (1, 32). A PPT1 a HCQ molekuláris célpontja, és az erősebb PPT1 inhibitorok, mint például a DC661 (2) és a GNS561 (3), LMP által közvetített sejthalált indukálnak in vitro. A lizoszómás sejthalál pontos mechanizmusa és a tumor immunogenitásában betöltött szerepe nem teljesen tisztázott. A daganatellenes immunitás fokozódik, ha az autofágia gátlását immunterápiával kombinálják (9, 10, 31). Az autofágia gátlását követő sejtben rejlő immunogenitás javasolt mechanizmusai közé tartozik az I. osztályú MHC és az immunproteaszóma upreguláció, amelyek egyaránt támogatják a jobb antigénfeldolgozást és -prezentációt. Ezenkívül az autofágia fehérjék elvesztése vagy az autofágia klorokin általi gátlása fokozta a CD8+ T-sejtek válaszát azáltal, hogy megnövelte az I. osztályú MHC felszíni szintjét dendrites sejtekben (33). Korábban kimutattuk, hogy a szisztémás PPT1 gátlás repolarizálhatja a makrofágokat M2 fenotípusból M1 fenotípusba. A PPT1-inhibitorok fokozhatják az STING-szintet, ami IFN-felszabaduláshoz és a T-sejtek által közvetített pusztulás fokozásához vezethet melanoma modellekben (31). Itt bemutattuk, hogy az LLP maga is a sejthalál tumorsejt-intrinsic immunogén formáját hozza létre. Megállapítottuk, hogy a lizoszómális gátlás nagyon kevés fehérje változást indukált a rákos sejtekben, és a legjelentősebben emelkedett fehérjék közé tartoztak az autofágia cargo receptorok és az apoptózis szabályozók. Megközelítésünk, amely e gének némelyikét a különböző funkciók között célozta meg, azt mutatta, hogy a gyógyszer-indukált fehérjék valószínűleg nem a sejthalál fő szabályozói. Az ULK1 vagy ATG7 genetikai gátlása szintén nem menti meg a DC661 citotoxicitást. Kimutattuk, hogy a lizoszómális gátlás a programozott sejthalál számos formáját aktiválja, beleértve az apoptózist, a nekroptózist, a ferroptózist és a piroptózist, de ezek mindegyike nélkülözhetetlen a gyógyszer által kiváltott citotoxicitáshoz. Megjegyzendő, hogy a programozott sejthalál mechanizmusai átfedhetik egymást, és több sejthalál mechanizmusának együttes célzása citovédelmet biztosíthat a sejthalál ellen a lizoszómális membrán permeabilizációját követően. Munkánk kizárta a lizoszómális sejthalál katepszin- és kalciumfüggő mechanizmusait, és rávilágított az LLP, mint a sejthalál kritikus meghatározója fontosságára. Bizonyítékot találtunk az LLP-re, amely reverzibilis volt egy, a lizoszómába szállított antioxidáns (NAC) hatására, és kritikus volt a lizoszómális membránpermeabilizáció és a citotoxicitás szempontjából. A NAC volt az egyetlen szer, amely képes volt enyhíteni vagy visszafordítani a DC661-indukált sejthalált, és ez a kapacitás az MFSD12 lizoszómális cisztein transzporter jelenlététől függött. Valószínűleg a lizoszómális penetráció hiánya az oka annak, hogy más feltételezett lipid-peroxidáció-gátlók, a Trolox és a C-vitamin nem tudták megakadályozni a DC661 citotoxicitását. A NAC ciszteinné alakul, amely a lizoszómákba importálódik, és diszulfid formává, cisztinné oxidálódik. A cisztint egy másik lizoszómális transzporter, a cisztinózis exportálja a citoszolba, ahol ciszteinné redukálódik, amely remobilizálja a belső tápanyagforrásokat, újraaktiválja a rapamicin 1-es komplex célpontját, és elősegíti az autofágiát (34). A ciszteinnek ez az oxidáció-redukciós körfolyamata cisztinné (lizoszómák) és vissza ciszteinné (citoszol) a NAC lehetséges mentőmechanizmusa lehet a DC661 citotoxicitása vagy általánosabb lizoszómakárosodás ellen más betegségekben, ahol a NAC terápiás szempontból hasznosnak bizonyult (35). . A NAC nemcsak a DC{35}}indukálta LLP-t és LMP-t fordította meg, hanem az immunogén sejthalál markerének, a kalretikulinnak a felszíni expresszióját is. A CALR-fehérje sejtfelszíni expressziója szükséges volt a DC661-primerált lépsejtek által kiváltott fokozott T-sejt-mediált citotoxicitáshoz, ami azt bizonyítja, hogy a lizoszómális gátlás a sejten belüli immunogenitás specifikus formáját hozza létre.
Míg korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a lizoszómális gátlás fokozhatja az immunellenőrzési pont gátlás daganatellenes hatását kialakult oldaldaganatokban (9, 31), a mi tanulmányunk az első, amely tudomásunk szerint vakcinaszerű hatást mutatott ki az MC38 daganatokra, de nem a B16 daganatokra. a beültetés előtt DC661-gyel előkezelt tumorsejtek. Ez azt mutatja, hogy a lizoszómális sejthalál indukálhatja a sejten belüli immunogenitást, de ezek a változások önmagukban nem elég valószínűek ahhoz, hogy az "immunhideg" tumor mikrokörnyezetet "immun meleg" tumor mikrokörnyezetté alakítsák. Korábbi, "immunhideg" tumor mikrokörnyezeti modellekkel (B16) és a BRafCA PtenloxP Tyr: CreERT2 genetikailag módosított egérmodellekkel végzett vizsgálataink (31) kimutatták, hogy a szisztémás lizoszómális gátlás olyan hatást fejt ki a tumorhoz kapcsolódó makrofágokra és mieloid sejtekből származó szupresszor sejtekre, amelyek elegendőek voltak a fokozáshoz. az immunterápia hatékonysága. Előfordulhat, hogy a sejten belüli immunogenitás is szerepet játszik ezekben az immunhideg daganatokban, amelyek a lizoszómális gátlást követően jobban reagálnak az ICD-re. A lizoszómális gátlás ellenőrzött laboratóriumi környezetben megfigyelt vakcinaszerű hatása átterjedhet a klinikára, de megmagyarázhatja, hogy a korábban kezelt BRAF mutáns melanomában miért volt néhány dabrafenibbel, trametinibbel és HCQ-val kezelt beteg ilyen mély és tartós. választ erre a kezelési rendre (32). További vizsgálatokra van szükség annak megértéséhez, hogy a PPT1 gátlása hogyan idéz elő lizoszómális ROS-t és lipidperoxidációt. A V-ATPáz és a lizoszómális savasodás PPT1-függő szabályozása nem elegendő magyarázat, mivel a bafilomicin gátolja a lizoszómális savasodást, de nem termel LMP-t (az adatokat nem mutatjuk be). Ezen eredmények következményei arra utalnak, hogy a tumorsejtek belső immunogenitását fokozó lizoszómális inhibitorok racionálisan kombinálhatók olyan terápiákkal, amelyek fokozzák a T-sejt aktivációt vagy a tumor mikrokörnyezetébe való beszűrődést, potenciálisan szinergikus hatásokat eredményezve.
5. ábra. Az N-acetil-cisztein megakadályozza a DC661-indukált sejthalált. (A)
Mód
Sejttenyésztés. Human A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420) ), az A549 (CRM-CCL-185) és az egér B16F10 (CRL-6475) sejtvonalakat az ATCC-től vásároltuk. A humán A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 és egér YUMM1.7 (WT, Gsdme EV, valamint Gsdme KO1 és KO2) vonalakat házon belül szereztük be. Az egér MC38 és CT26 sejteket Andy Minn, Pennsylvania Egyetem biztosította. Az FL5.12 és IL-3-függő Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) primer csontvelősejteket Kathryn E. Wellentől (Pennsylvania Egyetem) szereztük be. A humán Panc-1 (CRL-1469, ATCC) sejtvonalat Ben Z. Stanger, Pennsylvania Egyetem biztosította. Az egér YUMMER 1.7 sejtvonalat a Xiaowei (George) Xu, Pennsylvania Egyetemtől szereztük be. Minden sejtvonalat kétévente teszteltek Mycoplasma-ra a Pennsylvania Egyetem Core létesítményei, és a Wistar Institute Genomics core rövid tandem ismétlődő ujjlenyomattal hitelesítették. Az A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 és Bax/Bak DKO sejtvonalakat RPMI 1640-ben (Invitrogen, 11875) tenyésztettük; Az A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10 és MC38 sejtvonalakat DMEM-ben tenyésztettük (Invitrogen, 11995); és YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV és Gsdme KO1 és KO2) sejteket (15) tenyésztettünk DMEM/F12 50/50-ben (Corning, 10-092-CV). A táptalajt 10%-os magzati szarvasmarha-szérummal (12306C, MilliporeSigma) és 1× antibiotikum gombaellenes oldattal (Gibco, 15140-122) egészítettük ki. Az FL5.12 és Bax/Bak DKO sejtvonalakat komplett RPMI táptalajban tartottuk fenn, kiegészítve 50 μM -merkaptoetanollal (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES-sel (H3537, MilliporeSigma), valamint 0,35 ng/ml és 3 ng-mal. /mL IL-3. A YUMMER1.7 és YUMM1.7 (WT, Gsdme EV és Gsdme KO) sejtvonalakat 1× MEM NEAA-val (Gibco, 11140-050) kiegészített komplett tápközegben tartottuk fenn. A WM35 és WM793 sejteket 153-as MCDB tápközegben (MilliporeSigma, M7403) tenyésztettük, amely 10% FBS-t tartalmazott 1 × Leibovitz L-15 tápközegben (Corning, 10-045-CV), 7,5 tömeg/térfogat% nátrium-hidrogén-karbonátot ( Corning, 25-035-CI), 1× antibiotikum gombaellenes oldat (Gibco, 15140-122) és 5 ug/ml inzulin (MilliporeSigma, I0516). A sejteket 37 °C-on tenyésztettük 5% CO2 jelenlétében. Vegyszerek és reagensek. A vásárolt vegyszerek között szerepelt a HCQ-szulfát (Spectrum Chemicals, 747-36-4) és a DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) a sejtek kalcium-festését használtuk a gyártó utasításai szerint. Az antitestek és inhibitorok listája az 1. kiegészítő táblázatban és a 2. kiegészítő táblázatban található.
6. ábra: A NAC megfordítja az LLP-t az MFSD12-függő módon. (A-C)
Fehérje extrakció és emésztés folyadékkromatográfiához – tandem tömegspektrometriás analízis a proteomikai célokra. {{0}},7 × 106 A375P melanoma sejtet tenyésztettünk 60 mm-es tenyésztőedényekben. A sejteket DMSO-val (kontroll), DC661-gyel (3 μM), HCQ-val (10 μM) vagy HCQ-val (3{{70}} μM) kezeltük 24 órán keresztül körülbelül 5{{ 112}}% összefolyás. A fagyasztott sejtpelleteket 50 mM Tris pH 7,4, 1% SDS, 15{152}} mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,15 mM PMSF, 1 ug/ml pepsztatin, és 1 ug/ml leupeptin. A tisztított lizátumokat (egyenként 10 ug) elektroforézissel 0,5 cm-re bisz-trisz gélbe helyeztük, majd fixáltuk és kolloid Coomassie-val festettük. Mindegyik 0,5 cm-es gélsávot kimetszettük, megfestettük, trisz(2-karboxietil)-foszfinnal redukáltuk, jód-acetamiddal alkileztük, és tripszinnel emésztettük a korábban leírtak szerint (36). Az emésztéseket (1 ug) folyadékkromatográfiás-tandem tömegspektrometriával (LC-MS/MS) elemeztük Q-Exactive Plus tömegspektrométeren (Thermo Fisher Scientific) nanoAQUITY UPLC-vel (Waters) összhangban. Az analitikai elválasztást 1,7 μm × 250 mm-es Peptide BEH C18 oszlopon (Waters, 186003546) végeztük 245-perces gradiens alkalmazásával 0,1% hangyasav vízben (A mozgófázis) és acetonitril (B mozgófázis) az alábbiak szerint. : 5%–30% B 225 perc alatt, 30%–80% B 5 perc alatt, 15-perc tartás 80% B-n, és visszatérés a kezdeti feltételekhez. A teljes MS-spektrumokat 70,000 felbontáson vettük fel, 400–2,000 m/z pásztázási tartományban, 3 × 106 ionos automatikus erősítésszabályozási céllal és maximális befecskendezési idővel. 50 ezredmásodperc. Az adatfüggő MS2 spektrumokat a 20 leggyakrabban előforduló ionra vonatkozóan vettük fel 17 500-as felbontással, 1,5 m/z szigetelési szélességgel, 5 × 104 ion automatikus erősítésszabályozási céljával és 50 ezredmásodperces maximális befecskendezési idővel. A peptid egyezést preferáltuk, és a hozzá nem rendelt és egyszeresen töltött ionokat elutasítottuk (37). A nyers MS-adatokat MaxQuant 1.6.5.0 (https:// maxquant.net/perseus/) segítségével elemeztük Uniprot humán szekvencia-adatbázissal (2019. október 10-én) és egy gyakori szennyezőanyag-adatbázissal, beleértve a tripszint, keratint, marhafehérjéket, és mikoplazma (38). A keresés során a triptikus peptid-specifitást maximum 2 kihagyott hasítással, a cisztein fix módosítását (karbamidometiláció) és a változó metionin oxidációt vagy N-terminális acetilációt használtuk (39). A peptidek és fehérjék esetében 1%-os FDR határértéket alkalmaztunk. A futások közötti egyezés engedélyezve volt; A fehérjék mennyiségét jelölés nélküli kvantifikációval határoztuk meg (40). A statisztikai elemzést a Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) segítségével végeztük (41, 42). A fehérjéket legalább 3 egyedi peptiddel kellett azonosítani, és egy mintacsoporton belül 3 érvényes értékkel (nem nulla mennyiségi meghatározás) kellett rendelkezniük, a szennyeződéseket és a fordított fehérjéket pedig kiszűrtük az adatkészletből. A hiányzó értékeket normál eloszlásból imputáltuk. A feltételek páronkénti összehasonlítását fehérje szinten végeztük egy 2-farkú Student-féle t-teszttel, permutáció alapú FDR-rel, s0=0.1 és 250 randomizációval. A szignifikáns változásokat 5%-nál kisebb FDR-ként és 1,5-nél vagy 2,0-nál nagyobb abszolút szorzós változásként határoztuk meg. Lyso-IP. Az A375P sejteket pLJC5-Tmem{192-3xHA lentivírussal fertőztük meg, és 1 mg/ml puromicinnel (MilliporeSigma, P4512) szelektáltuk. Körülbelül 3 × 106 HA-címkével ellátott A375P sejtet kezeltünk 10 mM NAC-val vagy vizes hordozóval 24 órán keresztül a korábban leírt tenyésztési körülmények között. A kezelés után a sejteket PBS-ben mostuk, 0,5 ml hideg KPBS-ben összegyűjtöttük, és 20 ütéssel óvatosan homogenizáltuk 2 ml-es Dounce homogenizátorban. A homogenizátum körülbelül 2,5%-át a teljes sejt-lizátum analízisére tartottuk fenn, a maradékot 3,{120}}g-vel centrifugáltuk 2 percig 4 fokon, hogy eltávolítsuk a sejtmembrántörmeléket. A homogenizált felülúszót ezután egy tiszta 1,5 ml-es csőbe vittük át, és 50 μl anti-HA gyöngyökkel (Pierce, 88836) vagy anti-DDK/Flag gyöngyökkel (OriGene, TA150042) inkubáltuk 15 percig 4 fokon. A mintákat ezután kicsaptuk oly módon, hogy csöveket DynaMag-ra helyeztünk (Thermo Fisher Scientific, 12321D), és óvatosan rázogattuk 2 percig szobahőmérsékleten. A felülúszót a kötetlen frakció elemzésére tartottuk fenn. Az IP-t háromszor mostuk 8 mM CaCl2-t tartalmazó KPBS-sel. A Lyso-IP-t 80%-os MeOH-ban extraháltuk metabolomikai analízishez. Lipid extrakció és elemzés LC-MS/MS segítségével globális lipidomhoz. A melanoma A375P sejteket 60 mm-es edényekbe oltottuk edényenként 0,7 × 106 sejtben. Amikor a sejtek megközelítőleg 50%-os összefolyásban voltak, DMSO-val (kontroll), DC661-gyel (3 μM) vagy HCQ-val (30 μM) kezeltük őket 24 órán keresztül. A sejteket kétszer mostuk HBSS-sel, jéghideg metanolba kapartuk, és üvegcsövekbe vittük át lipidextrakcióhoz kloroform/metanol/0,88% NaCl (2:1:1) elegyével, amely EquiSPLASH belső lipidstandardot (Avanti Polar Lipids) tartalmazott. A mintákat vortexeltük, majd vízfürdőben ultrahanggal kezeltük 5 percig jégen. 500 g-vel 15 percig 40 °C-on centrifugáltuk, majd az alsó fázist egy másik üvegcsőbe vittük át. A felső fázist szintetikus alsó fázis alkalmazásával újra extraháltuk. Szonikáció és centrifugálás után az alsó fázist egyesítettük az első alsó fázis gyűjteményével. A mintákat nitrogén alatt szárítottuk, 10% kloroform/90% metanol elegyben újraszuszpendáltuk, és üveg LTQ fiolákba vittük át. A lipidmintákat Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X tömegspektrométerrel és Vanquish Horizon UHPLC rendszerrel elemeztük. Az analitikai elválasztáshoz Accucore C30 oszlopot (2,1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) használtunk 50:50 acetonitril/víz és 88:10:2 izopropanol/acetonitril/víz eleggyel, amelyek mindegyike 5 mM ammónium-formiátot és 0,1% hangyasavat tartalmazott. Az LC-MS/MS adatokat külön-külön gyűjtöttük pozitív és negatív polaritásban a következő műszerparaméterekkel: MS1 scan 120, 000 felbontás; adatfüggő MS2 a 20 leggyakrabban előforduló ionon 15,{184}} felbontással; 0,4 m/z szigetelési szélesség; és a lépcsőzetes normalizált ütközési energia 20:30:40 (43).
7. ábra. Az N-acetil-cisztein megakadályozza a DC661-indukált kalretikulin felszíni expresszióját. (HIRDETÉS)
A lipideket LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific) segítségével azonosítottuk és mennyiségileg meghatároztuk. Az azonosított lipidfajtákat a várt adduktok és az osztályon alapuló azonosítási fokozat alapján szűrtük. A csúcsterületeket a támogatott osztályok EquiSPLASH szabványai szerint normalizálták, majd az egyes minták teljes területe alapján tovább normalizálták a sejtszám eltérésének korrigálása érdekében. A statisztikai elemzést a log-transzformált adatokon végeztük a Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) segítségével (41, 42). Metabolit extrakció és elemzés LC-MS/MS segítségével a metabalonhoz. A poláris metabolitokat a teljes sejtekből, a Lyso-IP-hez nem kötött frakciókból és a Lyso-IP-hez kötött mintákból 80%-os metanollal extraháltuk, és –8{{30}} fokon tároltuk a folyadékkromatográfia előtt. – tömegspektrometriás (LC-MS) elemzés. A kivonatokat LC-MS-sel elemeztük Thermo Scientific Q-Exactive HF-X tömegspektrométerrel, HESI II szondával, összhangban a Thermo Vanquish Horizon UHPLC rendszerrel. Az LC elválasztást ZIC-HILIC oszlopon (2,1 mm × 150 mm, 5 μm részecskeméret, EMD Millipore) végeztük, ZIC-HILIC védőoszloppal (2,1 mm × 20 mm, EMD Millipore) 45 fokos áramlási sebességgel. 0,2 ml/perc. A kromatográfiát savas körülmények között végeztük a tiolcsoportok reaktivitásának csökkentése érdekében. Az A mozgófázis víz, a B pedig acetonitril volt, mindkettő 0,1% hangyasavat tartalmazott. Az LC gradiens 85% B volt 2 percig, 85% B - 20% B 15 perc alatt, 20% B - 85% B 0,1 perc alatt és 85% B 8,9 percig. Az automatikus mintavevőt 4 fokon tartottuk, és minden mintából 4 µl-t fecskendeztünk be elemzésenként. A következő MS-paramétereket használtuk: burkolati gáz áramlási sebessége, 40 AU; segédgáz áramlási sebessége, 10 AU; seprőgáz áramlási sebessége, 2 AU; kiegészítő gázfűtő hőmérséklet, 350 fok ; permetezési feszültség, 3,75 kV pozitív üzemmódhoz és 3,5 kV negatív üzemmódhoz; kapilláris hőmérséklet, 375 fok; és tölcsér RF szintje, 40%. Minden mintát teljes MS-sel elemeztünk polaritásváltással. A teljes MS-vizsgálatokat 65 és 975 m/z között 120,{59}} felbontás mellett 1 × 106 ionos automatikus erősítésszabályozási céllal és 100 ezredmásodperces maximális befecskendezési idővel végeztük. A nyers adatokat TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific) segítségével elemeztük. A megcélzott metabolitokat pontos tömeg és retenciós idő alapján azonosították a preferált polaritásukban az analitikai standardok alapján. A csúcsdetektálás az ICIS algoritmust 1-es simítással végezte. A relatív kvantifikációt integrált csúcsterülettel végeztük, és ezeket az értékeket a mintánkénti teljes mennyiségre (a teljes csúcsterületként definiált) korrigáltuk. PPT1-CRISPR/Cas9 szerkesztés. Az A375P PPT1-nem célsejteket és a KO sejteket a korábban leírtak szerint készítettük elő (44). A pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) Feng Zhang (Addgene plazmid, 48139) ajándéka volt. Az irányító RNS oligókat (IDT) összeforraltuk, foszforileztük, majd BbsI-gyel emésztett és defoszforilált pX459 plazmidba ligáltuk a Zhang labor protokollja szerint, amely az Addgene-en keresztül érhető el. A ligált plazmidokat Stbl3 sejtekbe (Invitrogen) transzformáltuk. A plazmid preparátumok szekvenálása megerősítette a kívánt vezető RNS szekvenciák jelenlétét. Az A375P sejteket Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015) alkalmazásával transzfektáltuk, majd puromicinszelekciót végeztünk. A felmérő vizsgálatok megerősítették a PPT1 gén CRISPR/Cas9 általi szerkesztését, és a PPT1 leütését a PPT1 antitesttel (Origene) végzett Western-blot igazolta. A vezető RNS-oligók szekvenciái a következők: nem célirányító RNS előre (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), non-target irányító RNS fordított (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), humán PPT1 irányító RNS 1 előre (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), humán PPT1 irányító RNS előre (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), humán PPTCAG1 irányító RNSGAACGATCCAG1 (AAACACGAGGAG1). 3 előre (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC), és a humán PPT1 irányító RNS 3 fordított (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Az ebben a cikkben használt egyedi sejtekből növesztett klónok a következők: a C8 klón az 1. humán útmutató, a B5 klón pedig a 3. humán útmutató. Immunblot. Egymillió sejtet szélesztettünk egy 10 cm-es edénybe, és a kezelést másnap végeztük; a sejteket kaparással gyűjtöttük össze. A teljes sejt lizátumokat SDS lízispufferrel állítottuk elő. A fehérjekoncentrációt Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, 23225) segítségével mértük. 30-50 ug fehérjét használtunk az SDS-PAGE-hoz, és PVDF membránra vittük át (Bio-Rad, 1620177). A membránt 5% BSA-val vagy 5% fölözött tejjel blokkoltuk az optimalizált körülményeknek megfelelően, és egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk elsődleges antitesttel. A PVDF membránokat 1× TBS-T-vel (Cell Signaling Technology Inc., CS{111}}) mostuk, és 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk fajspecifikus HRP-konjugált másodlagos antitesttel. A membránokat ezt követően mostuk és előhívtuk Pierce ECL Western Blotting szubsztrátum (Thermo Fisher Scientific, 32106) és autoradiográfiás filmek (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318) alkalmazásával. A piroptózisos vizsgálatokhoz a fehérjelizátumokat SDS-PAGE-val választottuk el, és PVDF membránokra vittük át. 5%-os BSA-ban történő blokkolást követően a PVDF membránokat a jelzett elsődleges antitestekkel egy éjszakán át 4°C-on inkubáltuk, PBS/Tween oldatban mostuk, és peroxidázhoz kapcsolt másodlagos antitestekkel inkubáltuk. Az immunreaktivitást HRP-konjugált másodlagos antitestekkel (CalBioTech), kemilumineszcens szubsztráttal (Thermo Fisher Scientific) és ChemicDoc MP képalkotó rendszerrel (Bio-Rad) detektáltuk. A felülúszót tartalmazó kísérletekhez a sejteket FBS-mentes tápközegben tenyésztettük, hogy elkerüljük az SDS-PAGE torzulását. A sejtfelülúszókat összegyűjtöttük, és 10 percig centrifugáltuk 500 g-vel 4 fokon, hogy eltávolítsuk a sejttörmeléket. A kapott felülúszót Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) alkalmazásával 10-szeresre koncentráltuk centrifugálással 30 percig 4500 g-vel 4 fokon. A koncentrátumokat összekevertük a mintapufferrel, és Western-blot módszerrel analizáltuk a fent leírtak szerint. A fehérje gélfestést Ponceau vörös festéssel végeztük. LMP és katepszin L aktivitási vizsgálat. A humán pEGFP-hGal3 plazmidot Tamotsu Yoshimori (Addgene plazmid, 73080) ajándékozta, és az A375P-Galectin{139}} vonal létrehozására használták. A pEGFP-C1 kontroll plazmid vektor gerincét megvásároltuk (novo prolabs, V012024). A plazmidokat (1 ug/ml) A375P sejtekbe transzfektáltuk Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) alkalmazásával a gyártó protokollja szerint; A transzfektált sejteket G418 (Gibco, 10131035) alkalmazásával stabilan szelektáltuk. Az LMP esetében összesen 25 A375P-galektin{152}} pont-pozitív sejtet számoltak meg több képmezőben. A pont-pozitív sejtek százalékos arányát minden mezőben külön-külön számítottuk ki, és minden csoportra átlagos százalékot számoltunk. A Magic Red Cathepsin L vizsgálati készletet (Abcam, ab270774) a gyártó protokollja szerint használtuk. A sejteket Zeiss Axio Observer 7 fordított mikroszkóp alatt készítettük el. A Magic Red nyers integrált intenzitást a Fiji - ImageJ szoftver (NIH) segítségével számítottuk ki. MTT (3-[4, 5-dimetiltiazol-2-il]-2, 5-difenil-tetrazólium-bromid) sejtéletképességi vizsgálat. 2000 sejtet helyeztünk el három párhuzamosban egy 96-üregű lemez minden egyes lyukába, és 3-napos MTT vizsgálatokat végeztünk a Cell viability Kit (Roche, 11465007001) segítségével a gyártó protokollja szerint. Inhibitor előkezelést adtunk 1 órán át, majd a sejteket DC661-et tartalmazó vagy anélküli inhibitorokkal együtt kezeltük. Az IC50 kiszámításához nemlineáris regressziós (görbeillesztés) módszert alkalmaztunk.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez
【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Kolóniaképződési vizsgálat. Lyukanként 2,000 sejtet oltottunk be egy 6-lyukú lemezre, és másnap kezeltük; sejteket összesen 8 napig kezeltük. Az egyes üregekben képződött telepeket PBS-sel mostuk, hideg metanollal –20 fokon 20 percig fixáltuk, majd kristályibolya 0,5%-os vizes oldattal (V5265; MilliporeSigma) megfestettük.
Tripánkék festék kizárási vizsgálat. A tripánkék vizsgálathoz szükséges reakcióelegyet 1 rész 0,4% tripánkék (25- 900-CI, Corning) és 1 rész hígított sejtminta összekeverésével készítettük. A keveréket 1 percig inkubáltuk, és a sejteket Cellometer Vision készüléken (Nexcelom, Vision{6}}) megszámoltuk.
8. ábra: A DC661-indukált kalretikulin felszíni expressziója beindítja a T-sejteket a tumorsejtek ellen. (A)
9. ábra: A DC661-kezelt sejtek beoltása bizonyos körülmények között tumorkilökődést okoz. (A)
HAB-LPO. Az LLP-t fluoreszcens szondával, a FOAMLPO-val tanulmányozták. A FOAM-LPO-t a korábban leírtak szerint (26) szintetizáltuk. A sejteket 8 lyukú μSlide-en (uo. 80807) tenyésztettük, és inhibitorokkal, DC661-gyel vagy anélkül kezeltük. A sejteket FOAM-LPO-t (1 M) tartalmazó tápközeggel inkubáltuk 5% CO2 és 95% levegő atmoszférájában 5 percig 37 °C-on. A sejteket kétszer mostuk tápközeggel, majd mikroszkóp alatt (Zeiss Axio Observer 7 fordított mikroszkóppal) megfigyeltük a sejteket, hogy észleljük az LLP hatására 586 nm-ről 512 nm-re eltolódó fluoreszcenciát. qRT-PCR és primerek. Az A375P (3 × 105 ) sejteket 60 mm-es edényekben tenyésztettük, és DMSO-val vagy DC661-gyel (3 μM) kezeltük 24 órán keresztül. A teljes RNS-t RNS-izolációs kittel (QIAGEN, 74134) izoláltuk a gyártó protokollja szerint. A cDNS-t iScript Reverse Transcriptase kittel állítottuk elő 500 ng tisztított RNS-sel a gyártó protokollja szerint (Thermo Scientific, K1642). A qPCR reakciót 1 μL cDNS-t tartalmazó SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) segítségével állítottuk be. Minden mérést három párhuzamosban végeztünk, és a BACTIN-t belső standardként használtuk a ΔCT számításokhoz. A génexpressziós elemzést a következő primerekkel végeztük: PTGS2/COX-2 előre (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 fordított (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS előre (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS forward (CHCAGTAGGATGTC) (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 hátrafelé (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN előre (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) és BACTIN hátrafelé (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).
siRNS transzfekció. A humán ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 és MFSD12 genetikai knockdown vizsgálatait A375P sejtvonalakban végezték. Az egér Ppt1 és Calreticulin genetikai gátlási vizsgálatait MC38 sejtekben végeztük. Nem célzott siRNS (sc{{10}}), emberi ULK1 (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), egér Ppt1/Cln1 (sc-142398) és Calreticulin A /Calregulin (sc-29895) siRNS-eket a Santa Cruz Biotechnology cégtől vásároltuk. Ezek az siRNS-ek 3-5 célspecifikus siRNS-ből állnak. Áramlási citometria. A ferroptózis-indukciót a C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861) segítségével mértük. Az A375P sejteket egy 6-lyuklemezbe oltottuk, és DMSO-val, ferrosztatinnal{{40}} (10 μM), ajakroxsztatinnal-1 (2 μM), elasztinnal (5 μM) kezeltük. ), DC661 (3 μM), vagy kombinációja 24 órán keresztül. A sejteket 300 g-vel 5 percig végzett centrifugálással gyűjtöttük össze. A sejteket 500 μl 1X HBSS-ben (Corning, 21-023-CV) reszuszpendáltuk, amely 1 µM C11-BODIPY-t tartalmazott, és 37 fokon 15 percig inkubáltuk. A sejteket ülepítettük és újraszuszpendáltuk 500 µl 1X HBSS-ben, és a fluoreszcencia intenzitását BD LSRII citométeren mértük 530/30 Blue (University of Pennsylvania Flow Core Facility) segítségével. A kalretikulin sejtfelszíni expressziójának mennyiségi meghatározását immunogén sejthalálra a korábban leírtak szerint (45) áramlási citometriával végeztük. B16F10 vagy MC38 sejteket tenyésztettünk, és NAC-val (10 mM) vagy DC661-gyel (3 µM) kezeltük 24 órán keresztül. Az MC38 sejteket siPpt1-gyel vagy siNT-vel kezeltük 48 órán keresztül 10 mM NAC jelenlétében vagy hiányában 24 órán át. A sejteket CALR antitesttel (Cell Signaling Technology, 12238), Alexa Fluor 647 kecske nyúl elleni második antitesttel (Invitrogen) és propidium-jodiddal (PI) (Biolegend, 421301) festettük. A megfestett mintákat BD LSRII áramlási citométerrel vettük 710/50 Blue és 670/30 Red használatával a PI és CALR fluoreszcencia rögzítésére (University of Pennsylvania Flow Core létesítmény), és az elemzés a CALR-pozitív és PI-negatív sejtekre korlátozódott. hogy elkerüljük a hamis pozitív eseményeket. T-sejt-indító és százalékos citotoxicitás. B16 vagy MC38 tumorsejteket (5 × 104) tenyésztettünk, és NAC-val (10 mM) vagy DC661-gyel (1 µM vagy 3 µM) kezeltük 24 órán keresztül. A Calr genetikai gátlása érdekében az MC38 sejteket Calr siRNS-sel vagy nontarget siRNS-sel (siNT) kezeltük 48 órán át, majd DMSO-val vagy 3 μM DC661-gyel 24 órán át. A lépsejteket ezután DC661-gyel tenyésztettük B16- vagy MC38-sejtekkel vagy anélkül, IL{102}} (5 NE/ml) jelenlétében, és 72 órán keresztül együtt tenyésztettük. Az alapozást a felülúszó IFN-ELISA-val (Biolegend, 430815) igazoltuk. Az alapozott lépsejteket ezután frissen tenyésztett B16 vagy MC38 sejtekkel együtt tenyésztettük, a cél-effektor (B16 vagy MC38: lépsejtek) aránya 1:20, illetve 1:50 volt a B16 és MC38 sejtek esetében. A B16 vagy MC38 sejthalálhoz kapcsolódó LDH felszabadulást, majd a százalékos citotoxicitást a gyártó protokollja szerint (MilliporeSigma, 4744926001) mérték (31). Daganatellenes vakcinázási vizsgálatok és kemoterápiás vizsgálatok megalapozott rákmodellekkel. A hat-nyolc hetes nőstény WT C57BL/6 egereket, NOD/SCID és BALB/c egereket a The Jackson Laboratorytól szereztük be. A daganatellenes vakcinázási kísérletekhez a WT B16F10, MC38 és CT26 sejteket DC661-gyel (3 μM) kezeltük 36 órán át 175 cm2-es lombikokban. Ezután a felülúszókat és a leválasztott sejteket egy 50 ml-es sólyomcsőbe gyűjtöttük. A sejteket centrifugáltuk, és jéghideg PBS-sel mostuk. A vakcinázáshoz 150 μL sejtszuszpenziót fecskendeztünk szubkután immunkompetens C57BL/6 egerek, immunhiányos NOD/SCID egerek (1,8 × 104 B16F10 sejt, 1,5 × 106 MC38 sejt egérenként) vagy syngene BALB0c egerek bal oldalába. × 106 CT26 sejt egérenként). Negatív kontrollként PBS-ben újraszuszpendált, fagyasztva felolvasztott sejteket injektáltunk. Egy héttel később azonos típusú élő rákos sejteket (3 × 104 B16F10 sejt, 2 × 105 MC38 sejt vagy 5 × 105 CT26 sejt egérenként) azonos térfogatú Matrigel-lel (Corning, 354248) injektáltunk a jobb szárnyba. vakcinázott egerek esetében. A daganatokat elektronikus tolómérőkkel mértük, és a térfogatot L × W2 × 0,5 értékkel számítottuk ki. A daganat növekedését a következő napokban rendszeresen ellenőrizték, és a daganatok hiányát a hatékony daganatellenes vakcinázás jelzésének tekintették. A DC661-MC38 vakcinázási vizsgálatokat megismételték NOD/SCID egereken. Statisztika. A statisztikai szignifikanciát a Student-féle páratlan, 2-farkú t-próbával határoztuk meg 2 csoport összehasonlításakor. Az ANOVA-teszt 1-módszerét használták több mint 2 csoport összehasonlításakor. A nullhipotézist szignifikánsan elvetettük, ha a P érték kisebb volt, mint 0,05. Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be. Tanulmányi jóváhagyás. Minden állatkísérletet a Pennsylvaniai Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága által jóváhagyott protokollok szerint végeztek.
Kínai gyógynövény-cisztanche növény-Antitumor
Hivatkozások
1. Zeh HJ et al. Randomizált II. fázisú preoperatív vizsgálat az autofágia gátlására nagy dózisú hidroxiklorokinnal és gemcitabin/Nab-paclitaxellel hasnyálmirigyrákos betegekben. Clin Cancer Res. 2020;26(13):3126–3134.
2. Rebecca VW, et al. A PPT1 elősegíti a tumornövekedést, és a klorokin-származékok molekuláris célpontja a rákban. Cancer Discov. 2019;9(2):220–229.
3. Brun S és mtsai. A GNS561, egy új autofágia-gátló, amely a rákos őssejtek ellen aktív hepatocelluláris karcinómában és vastagbélrákból származó májmetasztázisban. J Rák. 2021;12(18):5432–5438.
4. Brun S és mtsai. A GNS561, egy klinikai stádiumú PPT1 inhibitor, hatékony a hepatocelluláris karcinóma ellen a lizoszómális funkciók modulálása révén. Autofágia. 2022;18(3):678–694.
5. Oberle C, et al. A lizoszómális membránpermeabilizáció és a katepszin felszabadulás a fibroblasztokban és monocitákban bekövetkező apoptózis Bax/Bak-függő, amplifikáló eseménye. Sejthalál különbség. 2010;17(7):1167–1178.
6. Boya P, Kroemer G. Lisoszomális membrán permeabilizáció sejthalálban. Onkogén. 2008;27(50):6434–6451.
7. Rebecca VW, et al. Egységes megközelítés a lizoszóma lebontó és növekedést jelző szerepének megcélzására. Cancer Discov. 2017;7(11):1266–1283.
8. Tang R, et al. Ferroptosis, nekroptosis és piroptózis a rákellenes immunitásban. J Hematol Oncol. 2020;13(1):110.
9. Yamamoto K, et al. Az autofágia elősegíti a hasnyálmirigyrák immunelkerülését az MHCI lebontásával. Természet. 2020;581(7806):100–105.
10. Deng J és mtsai. Az ULK1 gátlás legyőzi a veszélyeztetett antigénprezentációt, és helyreállítja a daganatellenes immunitást LKB1 mutáns tüdőrákban. Nat Rák. 2021;2(5):503–514.
11. Lazarou M, et al. Az ubiquitin kináz PINK1 autofágia receptorokat toboroz a mitofagiát indukálja. Természet. 2015;524(7565):309–314.
12. Choi YB, et al. A TAX1BP1 visszafogja a vírus által kiváltott apoptózist azáltal, hogy elősegíti a mitokondriális adapter MAVS viszketés által közvetített lebomlását. Mol Cell Biol. 2017;37(1):e00422-16.
13. Rikka S, et al. A Bnip3 rontja a mitokondriális bioenergetikát és serkenti a mitokondriális cserét. Sejthalál különbség. 2011;18(4):721–731.
14. Leu JI és mtsai. A károsodott ferroptózis mechanikai alapja a p53 afrikai központú S47 variánsát expresszáló sejtekben. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.
15. Erkes DA, et al. A mutáns BRAF és MEK inhibitorok piroptózison keresztül szabályozzák a tumor immun mikrokörnyezetét. Cancer Discov. 2020;10(2):254–269.
16. Serrano-Puebla A, Boya P. Lizoszóma membránpermeabilizáció sejthalálban: új bizonyítékok és következmények az egészségre és a betegségekre. Ann NY Acad Sci. 2016; 1371(1):30–44.
17. Thirusangu P, et al. A quinakrin által kiváltott autofágia petefészekrákban katepszin-L által közvetített lizoszómális / mitokondriális membrán permeabilizációt és sejthalált vált ki. Rák (Bázel). 2021;13(9):2004.
18. Michallet MC, et al. A T-limfociták szupraoptimális aktivációja által kiváltott katepszin-függő apoptózis: a nagy dózisú tolerancia lehetséges mechanizmusa. J Immunol. 2004;172(9):5405–5414.
19. Mondal A et al. A Ppt1-hiány szabályozza a lizoszómális Ca++ homeosztázist, hozzájárulva a patogenezishez a CLN1-betegség egérmodelljében. J Inherit Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM, et al. A foszfolipázok és a reaktív oxigénfajták lipid biomarkereket hoztak létre egészséges és beteg emberekben és állatokban – a hangsúly a lizofoszfatidilkolinon áll. Front Physiol. 2021;12:732319.
21. Fu R, et al. Az N-acetilcisztein hatékonysága a C1 típusú Niemann-Pick-kór egérmodelljeinek fenotípusos szuppressziójában. Hum Mol Genet. 2013;22(17):3508–3523.
22. Boz Z és mtsai. Az N-acetilcisztein megakadályozza az olanzapin által kiváltott oxidatív stresszt az mHypoA-59 hipotalamusz neuronjaiban. Sci Rep. 2020;10(1):19185.
23. Khare S, et al. Az ASS1 és az ASL elnyomja a növekedést tiszta sejtes vesesejtes karcinómában a megváltozott nitrogén-metabolizmus révén. Cancer Metab. 2021;9(1):40.
24. Gęgotek A, et al. Az aszkorbinsav redox és endokannabinoid rendszerek kölcsönhatásaira gyakorolt védő hatásának összehasonlítása in vitro tenyésztett humán bőrfibroblasztokon, UV sugárzásnak és hidrogén-peroxidnak kitéve. Arch Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.
25. De Raedt T, et al. A rákos sejtek sebezhetőségeinek kihasználása a ras-vezérelt daganatok kombinált terápiájának kifejlesztésére. Rákos sejt. 2011;20(3):400–413.
26. Zhang X és mtsai. Lipid-peroxidáció monitorozása a habsejteken belül lizoszóma-célozható és ratiometriás szondával. Anal Chem. 2015;87(16):8292–8300.
27. Wei CY és mtsai. A bioinformatikai alapú elemzés az MFSD12 emelkedett szintjét tárja fel, mint a sejtproliferáció kulcsfontosságú promóterét és potenciális terápiás célpontot a melanomában. Onkogén. 2019;38(11):1876–1891.
28. Aldini G, et al. Az N-acetilcisztein, mint antioxidáns és diszulfidbontó szer: ennek okai. Free Radic Res. 2018;52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M, et al. A lizoszómális metabolomika feltárja a lizoszómákból származó aminosav-kiáramlás V-ATPáz- és mTOR-függő szabályozását. Tudomány. 2017;358(6364):807–813.
30. Zhou J és mtsai. Immunogén sejthalál a rákterápiában: jelenlegi és feltörekvő induktorok. J Cell Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G, et al. A PPT1 gátlása fokozza az anti-PD-1 antitest daganatellenes aktivitását melanomában. JCI Insight. 2020;5(17):e133225.
32. Mehnert JM, et al. BAMM (BRAF autofágia és MEK gátlás melanomában): dabrafenib, trametinib és hidroxiklorokin I/II fázisú vizsgálata előrehaladott BRAFV600-mutáns melanomában. Clin Cancer Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M, et al. A makroautofágia fehérjék szabályozzák az MHC I. osztályú szintet a dendritikus sejteken, és vírusellenes CD8(+) T-sejt-válaszokat alakítanak ki. Cell Rep. 2016;15(5):1076–1087.
34. Jouandin P, et al. A lizoszomális cisztein mobilizáció alakítja a TORC1 válaszát és a szövetnövekedést az éhezésre. Tudomány. 2022;375(6582):eabc4203.
35. Schwalfenberg GK. N-acetilcisztein: a klinikai hasznosság áttekintése (régi gyógyszer új trükkökkel). J Nutr Metab. 2021;2021:9949453.
36. Beer LA, et al. A méhen kívüli terhesség szérum biomarkereinek szisztematikus felfedezése 3-D fehérje profilozással, címkézés nélküli kvantifikációval párosítva. J Proteome Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR, et al. Az ARID1A-mutált petefészek tiszta sejtes karcinóma proteomjára gyakorolt elsődleges hatás a mevalonát útvonal leszabályozása a transzkripció utáni szinten. Mol Cell Proteomics. 2016;15(11):3348–3360.
38. Cox J, Mann M. A MaxQuant magas peptid-azonosítási sebességet, egyénre szabott ppb-tartomány tömegpontosságot és a fehérjeszintű fehérje mennyiségi meghatározását teszi lehetővé. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367–1372.
39. Cox J és mtsai. Andromeda: a MaxQuant környezetbe integrált peptid keresőmotor. J Proteome Res. 2011;10(4):1794–1805.
40. Cox J és mtsai. Pontos, az egész proteomra kiterjedő címkementes kvantifikáció késleltetett normalizálással és maximális peptidarány extrakcióval, amelyet MaxLFQ-nak neveznek. Mol Cell Proteomics. 2014;13(9):2513–2526.
41. Tyanova S, et al. A Perseus számítási platform a (prote)omikai adatok átfogó elemzéséhez. Nat Methods. 2016;13(9):731–740.
42. Tyanova S, Cox J. Perseus: bioinformatikai platform proteomikai adatok integratív elemzéséhez a rákkutatásban. Módszerek Mol Biol. 2018;1711:133–148.
43. Alicea GM, et al. Az elöregedett fibroblaszt lipid metabolizmus változásai a FATP2 zsírsavtranszporteren keresztül korfüggő melanomasejtek rezisztenciát indukálnak a célzott terápiával szemben. Cancer Discov. 2020;10(9):1282–1295.
44. Ran FA, et al. Genommérnökség a CRISPR-Cas9 rendszer segítségével. Nat Protoc. 2013;8(11):2281–2308.
45. Liu P, et al. Az immunogén sejthalálhoz kapcsolódó kalretikulin expozíció mennyiségi meghatározása. Módszerek Enzymol. 2020;632:1–13.
