Makrofágok aktiválása a Cistanche Deserticola kis molekulatömegű szacharidjaival

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

［ Abszttörvény!

A kis molekulatömegű szacharidok immunaktiváló hatásának és mechanizmusának vizsgálataCistanche deserticola(LMSC) egér peritoneális makrofágokon, RAW264. 7 sejt. A RAW264. 7 sejtet normál kontrollcsoportra, LPS pozitív kontrollcsoportra és LMSC kezelési csoportra osztottunk. A RAW264. 7 sejtet kezeltünk különböző koncentrációjú LMSC-vel 3,91 és 62,5 g·L között – 1. A makrofágok fagocita aktivitásának kimutatására a neutrális vörös tesztet alkalmaztuk. A NO felszabadulást NO kit és a makrofágaktivációhoz kapcsolódó fehérje expressziós szintek (TNF-, IL-6, IKK, p-IKK, IκB, p-IκB, NF-κB és p-NF-κB) segítségével detektáltuk. Western blottal mutatták ki. Az eredmények azt mutatták, hogy az LMSC aktiváló hatással volt a makrofágokra; jelentősen növelheti a NO felszabadulását a RAW264-ben. 7 sejteket, és elősegíti a TNF- és IL-6 citokinek expresszióját. Ezenkívül az LMSC szignifikánsan növelte az IKK, IκB és NF-κB p65 foszforilációját. Ezenkívül az LMSC egyik fő összetevője a mannit jelentősen fokozta a makrofágok fagocita aktivitását. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az LMSC aktiválhatja a makrofágokat az NF-κB jelátviteli útvonal fokozásával, és a mannit lehet az LMSC egyik fő aktív komponense.

［Kulcsszavak］ Kis molekulatömegű szacharidok; Cistanche deserticola; immunaktiválás; makrofág; gyulladásos faktor; NF-κB

Cistanche deserticola YC Manemzetségébe tartozó növényCistanche deserticolaYC Ma. Húsos szárát gyógyszerként használhatjuk. Feladata a vese yang táplálása, az esszencia és a vér táplálása, valamint a belek hidratálása. „Sivatagi ginzeng” néven ismert. A Cistanche kémiai összetevői közé tartoznak a fenil-etanol-glikozidok, iridoid-glikozidok, cukrok, lignánok és sok más típus. A modern farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a Cistanche számos biológiai aktivitással rendelkezik, például neuroprotektív, daganatellenes, immunszabályozási, gyulladásgátló és antioxidáns hatású [1]. Tanulmányok kimutatták, hogy a Cistanche és a poliszacharidok főzete jelentősen javíthatja a makrofágok fagocitáló képességét és szekréciós funkcióját [2-3]. Alacsony molekulatömegű szénhidrátjainak aktivitáskutatásáról azonban nincs jelentés. Ezért ez a tanulmány a RAW264 in vitro tenyésztési rendszerét használta. 7 egér peritoneális makrofág a Cistanche kis molekulatömegű szénhidrátok immunmoduláló aktivitásának és kapcsolódó mechanizmusainak feltárására. Ez a kutatás több kísérleti bizonyítékkal szolgálhat az átfogó megértéshezA Cistanche immunmoduláló hatásaa jövőben, hogy tovább irányítsák klinikai alkalmazását.

A Cistanche deserticolának számos hatása van, kattintson ide, ha többet szeretne megtudni

1. Anyagok

RAW264. 7 sejtet a Kínai Orvostudományi Akadémia Sejtközpontjától vásároltunk; a magzati szarvasmarha szérumot (FBS) a PAN Biotech-től (Németország) vásároltuk; Az antibiotikumokat és a DMEM tápközeget a Zhongke Machen Technology Co., Ltd.-től vásároltuk. Az Escherichia coli O55:B5-ből (LPS) származó lipopoliszacharidot a Sigma Company, USA-tól vásároltuk. A nitrogén-monoxid (NO) készletet a Nanjing Jiancheng Institute of Bioengineeringtől vásárolták. Az ECL kemilumineszcens készletet a Thermo Fishertől (USA) vásároltuk; az antitestet a Cell Signaling Technology-tól (USA); A Cistanche cistanche összglikozidokat, a kis molekulatömegű cukrokat és a cisztanche poliszacharidokat kutatócsoportunk saját maga állította elő. A cisztanche összglikozidok tömeghányada 78,76 százalék volt. A kis molekulatömegű cukrok tömeghányadaCistanche deserticola58. 00 százalék és a tömeghányadCistanche deserticolapoliszacharidok 65. 24 százalék . Tanon-5200A többgéles képalkotó rendszert a Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd.-től vásároltuk; A Sunrise-Basic mikrolemez olvasót a TECAN cégtől vásároltuk.

2. Módszer

2. 1 Semleges vörös módszer a makrofágok fagocita aktivitásának mérésére

Vegyük az egér hashártya makrofágjait a logaritmikus növekedési fázisban, tripszinezés után számoljuk meg a sejteket, állítsuk be a sejtek számát 5 × 104 sejt/ml-re, és oltsuk be őket egy 96-lyukú sejttenyésztő lemezre, 100 μL/lyuk. , 37 fokon, 5 százalékos CO2-körülmények között tenyésztve, miután a sejtek a falhoz tapadtak, dobja ki a tenyészet felülúszóját, adjon hozzá DMEM tápközeget (10% FBS plusz 1% P/S), LPS-t (1 mg·L–1) és Cistanche-t. cistanche, illetve összes glikozid,Cistancheösszes poliszacharidot és Cistanche cistanche kis molekulatömegű cukrokat (3,91 ~ 62,5 g·L -1, beadás előtt szűrőmembránnal szűrve) tenyésztettük. 48 órás tenyésztés után adjon 100 μL 0,075 százalékos semleges vörös fiziológiás sóoldatot minden lyukba, folytassa a tenyésztést 4 órán keresztül, szívja le a felülúszót, öblítse le háromszor PBS-sel, adjon hozzá sejtlizátumot (jégecet) -etanol 1:1) 100 μL, helyezzük 4 fokra 2 órára, és mérjük meg az abszorbanciát (A540 nm) a sejtek lizálása után.

2. 2 NO-kibocsátás mennyiségének kimutatása a sejtfelülúszóban

Oltsd be a RAW264-et. 7 sejtet egy 48-lyukú lemezre (1 × 105 sejt/ml, 500 μL/lyuk), szívja le a sejttenyésztő táptalajt egy éjszakán át tartó inkubálás után, adjon hozzá DMEM táptalajt (10% FBS plusz 1% P/S), 500 μL LPS (1 mg·L -1) és Cistanche cistanche összglikozid, összes poliszacharid és kis molekulatömegű cukor (3,91–62,5 g·L -1). 24 órás indukciós tenyésztés után a felülúszót összegyűjtöttük. Határozza meg az NO koncentrációját az egyes csoportok sejtfelülúszójában az NO kit segítségével, kövesse az utasításokat, végül detektálja az abszorbanciát (A570 nm) mikrolemez-leolvasóval.

2. 3. Western blot

Oltsd be a RAW264-et. 7 sejtet egy 6-lyukú lemezre, szívja le a sejttenyésztő táptalajt egy éjszakán át tartó inkubáció után, adjon hozzá DMEM táptalajt (10% FBS plusz 1% P/S), LPS-t (1 mg·L–1), ésCistancheAz összes poliszacharid és kis molekulatömegű cukor (3,91-62,5 g·L -1) egyenként 2 ml volt, és a felülúszót 24 órás indukciós tenyésztés után elöntöttük. A sejteket kétszer mostuk PBS-sel, és eldobtuk. A tripszinezés után a sejteket pipettázzuk. Centrifugálja, távolítsa el a felülúszót, adjon hozzá 100 μL NP40 lízispuffert, és lizálja jégen 40 percig. Centrifugálás után a felülúszót vettük, és a fehérjekoncentrációt BCA módszerrel határoztuk meg, és minden hiszton fehérjekoncentrációját egyenletesen beállítottuk. Vegyünk ugyanannyi fehérjemintát, és válasszuk szét őket 12%-os SDS-PAGE-val állandó nyomáson. Ezután a Bio-Rad transzfer elektroforézis tartály segítségével 350 mA állandó árammal 1 órán keresztül vigye át a membránt, majd vigye át a fehérjét a PVDF membránra (a PVDF membrán előkezelése: áztassa be metanolban és egyensúlyozza ki a transzfer pufferrel). 5% fölözött tejjel (0,1% Tween-t tartalmazó TBST-vel konfigurálva) szobahőmérsékleten 1 órán át blokkolva a membránt háromszor mostuk TBST-vel, és a membránt a fehérje primer antitest hígítóban 4 °C-on inkubáltuk. fok egyik napról a másikra. A membránt háromszor mostuk TBST-vel minden második napon, és a megfelelő hígítót adtuk hozzá, hogy 1 órán át inkubáljuk. A membránt háromszor mostuk TBST-vel, és a csíkokat ECL kemilumineszcenciás előhívóval előhívtuk.

2. 4 adatelemzés

Az adatokat x ± s-ban fejezzük ki, és a különbség szignifikanciáját a GraphPad Prism 6 statisztikai szoftverrel teszteljük az egyirányú varianciaanalízishez. Vegyük P<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. Eredmények

3. 1. A Cistanche cistanche kis molekulatömegű cukrok, összes glikozid és összes poliszacharid hatása a RAW264 fagocitáló aktivitására. 7 sejt

A Cistanche kémiai összetevőivel kapcsolatos kutatások azt mutatjákCistanchefőleg tartalmazfeniletanoid glikozidok, iridoid glikozidok és szénhidrátok. Ebben a kísérletben a cisztanche összes glikozidját (beleértve a fenetil-alkohol glikozidokat és az iridoid glikozidokat), az alacsony molekulatömegű cukrokat és a cukrokat választják ki. Az összes poliszacharid három aktív helyét megvizsgáltuk a RAW264 aktiválására gyakorolt ​​hatásuk szempontjából. 7 sejt. Mind a Cistanche cistanche poliszacharid, mind a kis molekulatömegű cistanche cukor jelentősen növelheti a RAW264 fagocita aktivitását. 7 sejteket, de a teljes glikozidot szedő csoport fagocitikus aktivitása nem változik szignifikánsan. Ezenkívül a pozitív kontroll gyógyszer, az LPS szintén jelentősen javította a RAW264 fagocita aktivitását. A fenti eredmények arra utalnak, hogy a Cistanche kis molekulatömegű cukrai és poliszacharidjai aktiválhatják a RAW264-et. 7 sejt.

3. 2. Cistanche összglikozidok, kis molekulatömegű cukrok és összes poliszacharidok hatása a sejtfelülúszó nitrogén-monoxid (NO) tartalmára

A Cistanche három aktív helyének aktiváló hatásának további vizsgálata érdekében a RAW264-en. 7 sejtekben meghatároztuk a különböző gyógyszerekkel stimulált sejtfelülúszó NO tartalmát. Az eredmények azt mutatták, hogy az NO felszabadulása az LPS-csoportban szignifikánsan magasabb volt, mint a vak kontrollcsoportban (P<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">Cistanchenem volt jelentős hatása. A fenti eredmények azt mutatják, hogy a Cistanche poliszacharidjai és kis molekulatömegű cukrai egyaránt elősegíthetik a NO felszabadulását a RAW264-ből. 7 sejt. Közülük a Cistanche kis molekulatömegű cukrainak hatása különösen jelentős, amint azt a 2. ábra mutatja.

3. 3. A Cistanche cistanche kis molekulatömegű cukor hatása a TNF- és IL-6 fehérje expressziójára RAW264-ben. 7 sejt

A TNF- egy fontos gyulladásos mediátor, amely a RAW264 aktiválási folyamatában jelenik meg. 7 sejteket, amelyek elősegíthetik más citokinek (például IL-6) szintézisét és felszabadulását. Az eredmények azt mutatták, hogy a TNF- és IL-6 expressziója szignifikánsan megnőtt, miután a Cistanche cistanche kis molekulatömegű cukrát stimulálták, ami arra utal, hogy a Cistanche kis molekulatömegű cukra elősegítheti a TNF expresszióját. - és IL{11}} RAW264-ben. 7 sejteket, ezáltal aktiválja a celluláris immunitást. Fagocitózis, lásd a 3. ábrát.

3. 4. A Cistanche cistanche kis molekulatömegű cukor szabályozó hatása az IKK /IκB /NF-κB jelátviteli útvonalra

A Cistanche cistanche kis molekulatömegű cukrok lehetséges mechanizmusának feltárása érdekében a RAW264 aktiválásában. 7 sejtekben, a szerzők vizsgálták annak szabályozó hatásait az IKK /IκB /NF-κB klasszikus jelátviteli útvonalra. A Cistanche cistanche kis molekulatömegű cukor jelentősen megnövelheti az NF-κB foszforilációját és az upstream kulcsfontosságú szignálfehérjék IKK és IκB foszforilációját, valamint csökkentheti az összes IκB fehérje expresszióját, jelezve, hogy aktiváló hatással van az IKK-ra / IκB /NF-κB jelátviteli útvonal. Az LPS pozitív kontroll gyógyszer is hasonló szabályozó hatással bír. Összefoglalva, a Cistanche kis molekulatömegű cukrai aktiválhatják az IKK /IκB /NF-κB jelátviteli útvonalat, ezáltal előidézve a citokinek, például a TNF- és az IL{13}} szintézisét és felszabadulását, és végül az immunrendszert RAW264 aktiválása. 7 cella, lásd a 4. ábrát.

3. 5. Makrofág aktiváló hatású hatóanyagok szűrése Cistanche kis molekulatömegű cukrokban

Laboratóriumunk elemezte a benne lévő kis molekulatömegű cukrokatCistanchea korai szakaszban, és megállapította, hogy főleg mannitot (16,53 százalék), szacharózt (8,34 százalék), fruktózt (25,38 százalék), glükózt (7,75 százalék) és egyéb összetevőket tartalmaz. A szerző tehát a semleges vörös módszert alkalmazta a fenti komponensek makrofágokra gyakorolt ​​aktivációs hatásának szűrésére. A mannit dózisfüggő módon szignifikánsan növelheti a makrofágok fagocita aktivitását, míg a többi komponens hatása nem jelentős. Ez arra utal, hogy a mannit a Cistanche cistanche kis molekulatömegű cukrainak egyik kulcsfontosságú aktív komponense lehet a makrofágok aktiválásához, amint azt az 5. ábra mutatja.

4. Megbeszélés

A Cistanche cistanche, a Lydanaceae családba tartozó parazita növényről számoltak be, immunmoduláló hatású, ezért immunmoduláló anyagokat kell tartalmaznia. Ebben a kísérletben a szerző az egér peritoneális makrofágjainak fagocita aktivitását vizsgálta meg különböző tisztított részein.Cistancheés megállapították, hogy a Cistanche kis molekulatömegű cukrai és poliszacharidjai makrofágaktiváló hatást fejtenek ki, de a Cistanche összes glikozidja nem nyilvánvaló. Ugyanakkor a szerző megállapította, hogy a kis molekulatömegű cukrok alacsonyabb koncentrációban is képesek aktiválni a makrofágokat, ezért a szerzők aCistanchea kis molekulatömegű cukrok a későbbi kutatások középpontjában.

Az alacsony molekulatömegű cisztanche cukor TNF- és IL-6 citokinek expressziójára gyakorolt ​​hatásának vizsgálatával a szerzők azt találták, hogy a kis molekulatömegű cisztanche cukor jelentősen megnövelte a TNF- és IL-6 expresszióját, ami továbbá bebizonyította, hogy az alacsony molekulatömegű citanche cukor hatással van az egerekre. A peritoneális makrofágok aktiváló hatásúak. A szerző tehát tovább vizsgálta lehetséges hatásmechanizmusát. Végezzen kutatást

Kimutatták, hogy a bakteriális lipopoliszacharid (LPS) képes egér makrofágok és egér gliasejtek aktiválását indukálni olyan jelutak révén, mint a JAK2/STAT3, NF-κB, p38/ERK és MAPK [4-8]. Az NF-κB útvonalat klasszikus útvonalként ismerik fel, ezért az ezen az úton lévő szignálfehérjéket teszteltük ebben a kísérletben. Az eredmények azt mutatták, hogy a Cistanche kis molekulatömegű cukrai szignifikánsan növelhetik az NF-κB foszforilációját és a kulcsfontosságú upstream jelátviteli fehérjék IKK és IκB foszforilációját, ami arra utal, hogy a kis molekulatömegű cukrokCistancheaktiválhatja az egér peritoneális óriásait az IKK /IκB /NF-κB jelátviteli útvonalon keresztül. A fágsejtek gyulladásos citokineket szabadítanak fel, majd szerepet játszanak a celluláris immunitás aktiválásában.

A laboratórium korai szakaszában a kis molekulatömegű cukorkivonat kémiai összetételeCistanche deserticolaszisztematikusan elemezték. Azt találták, hogy a kis molekulatömegű cukrok főként monomereket tartalmaznak, például mannitot, szacharózt, fruktózt és glükózt. További kutatások kimutatták, hogy a mannit jelentősen javíthatja a makrofágok fagocita aktivitását. Ezért azt feltételezik, hogy a mannit az alacsony molekulatömegű cukrok kulcsfontosságú összetevője lehet, amely aktiválja a sejtes immunfunkciót.

Összefoglalva, ez a tanulmány a makrofágokat használta a Vitro tenyésztési rendszerben, és megállapította, hogy a kis molekulatömegű cukrokCistanchejelentős aktiváló hatást fejtenek ki a makrofágokra, és aktiválhatják az egér peritoneális makrofágokat az NF-κB jelátviteli útvonalon keresztül, majd szerepet játszhatnak. A kis molekulatömegű cukrokban lévő mannit fontos szerepet játszhat a makrofágok fagocita aktivitásának aktiválásában.

Hivatkozások

[1] Tu Pengfei, Guo Yuhai. A sivatagi Cistanche és gazdája Tamarix termesztési technikái [M]. Peking: Science Press, 2015:31.

[2] Gao Xiaoxia, Chen Jun, Peng Yanli. Kutatási áttekintés a farmakológiai hatásokrólCistanche deserticolapoliszacharid [J]. Food and Drugs, 2015, 17(2):136.

[3] Wang Xiangyan, Qi Yun, Cai Ruslan és mások. A Cistanche Poliszacharid makrofágok aktiválása [J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2009, 25(6):787.

[4] Liu Zhongyuan, Li Yanping. A bakteriális lipopoliszacharid biológiai aktivitása és mechanizmusa [J]. Medical Science Review, 2010, 16(2):166.

[5] Fu Zhihui, Xu Ling, Huang Jiao és mások. Az LPS a p38 /MAPK útvonalon és az NF-κB aktiválásán keresztül a HIF-1 expresszióját indukálja a RAW264-ben. 7 cella [J]. Chongqing Medical University Journal, 2016, 41(10): 1033.

[6] Hao Yutong, Chen Chunhai, Yang Xuesen és mások. A JAK2/STAT3 jelátviteli út részt vesz a lipo poli cukorral kiváltott mikroglia［J］ aktiválásában. Journal of the Third Military Medical University, 2009, 31(12):1119.

[7] Song Xiaomin, Liao Lixi, Dong Xin és mások. A mulbascum glikozidok gátolják a BV-2 mikroglia lipopoliszacharidok által kiváltott gyulladását és annak mechanizmusát [J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2016, 41(13): 2506.