A metformin downmodulációval javítja az emberi zsírból származó őssejtek eredetét

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Absztrakt:A zsírszövet fontos szerepet játszik a metabolikus homeosztázis szabályozásában azáltal, hogy elraktározza a felesleges zsírt és megvédi más szerveket a lipotoxicitástól. Az öregedés központi zsír-újraeloszlással jár, ami az inzulinérzékeny szubkután csökkenésben és az inzulinrezisztens zsigeri zsírraktárak növekedésében csúcsosodik ki. A zsírból származó őssejtek (ASC) fontos szerepet játszanak a zsírszövet regenerációjában. Az elöregedett ASC-k csökkent szárat és regenerációs potenciált mutatnak az oxidatív stressz felhalmozódása és a mitokondriális diszfunkcióval kapcsolatos sejtkárosodás miatt. A metformin egy jól bevált cukorbetegség elleni gyógyszer, amely különböző organizmusokban és állatmodellekben mutatott öregedésgátló hatást. Ebben a tanulmányban elemeztük a metformin kezelés hatását a humán ASC-k törzsére sejttenyészetben és teljes zsírszövettenyésztési modellekben. Eredményeink azt mutatják, hogy a metformin javítja az ASC-k szárát, csökkenti proliferációjuk és zsírsejt-differenciálódásuk sebességét. A lehetséges mögöttes mechanizmust vizsgálva az mTOR és ERK aktivitás csökkenését figyeltük meg a metforminnal kezelt ASC-kben. Ezenkívül megfigyeltük az autofágia aktivitásának növekedését a metformin kezelés során. Arra a következtetésre jutottunk, hogy a metformin kezelés javítja az ASC-származékot az mTOR és az ERK jelátvitel csökkentésével és az autofágia fokozásával. Az állatmodelleken és embereken végzett jövőbeni in vivo kiértékelések megnyitják az utat ennek a jól bevált gyógyszernek az elöregedett őssejtek újraélesztésére szolgáló klinikai adaptációja előtt.

További információért kattintson ide

Kulcsszavak:zsíros őssejtek; zsírszövet; szárasság; különbségtétel; proliferáció; metformin;mTOR; ERK; autofágia

1. Bemutatkozás

A zsírszövet egy dinamikus szerv, amely fontos homeosztatikus szerepet játszik a tápanyag-egyensúly, az inzulinérzékenység és az immunmoduláció szabályozásában. A zsírszövet ezt a szerepet a felesleges zsírsavak raktározásával és oxidációjával tölti be, így megakadályozza a steatosist és a lipotoxicitást más szervekben [1]. Az életkorral összefüggő inzulinrezisztencia a legelterjedtebb anyagcsere-betegség. Az Egyesült Államok 65 év feletti népességének körülbelül 25 százaléka szenved cukorbetegségben, ami magasabb halálozási arányt, csökkent funkcionális állapotot, fokozott kórházi kezelés kockázatát és az egészségügyi gazdaság túlzott terheit eredményezi [2]. Bár a cukorbetegség és az elhízás közötti összefüggést régóta felismerték, az öregedés és a 2-es típusú cukorbetegség közötti kapcsolat továbbra is megfoghatatlan [3]. Az első megfigyelés a glükóztolerancia öregedéssel való csökkenésével kapcsolatban 1921-ben történt [4]. Azóta számos tanulmány a csökkent inzulinérzékenységet azonosította a glükóz metabolizmus életkorral összefüggő károsodásának elsődleges okaként [5,6]. Anatómiai lokalizáció alapján a zsírszövet nagy vonalakban két depóra osztható: szubkután és zsigeri zsírraktárra. Az inzulinérzékenység szempontjából fontos a zsírszövet-raktár elhelyezkedése és működése; például a zsigeri depó ellenállóbb, míg a szubkután depó érzékenyebb az inzulinra [7]. A bőr alatti zsírszövet mennyiségének korral összefüggő fokozatos csökkenése csökkent glükóz- és lipidfelvételt eredményez, ami lipid túlcsorduláshoz és a lipidek méhen kívüli lerakódásához vezet az izomzatban és a májban, ami hozzájárul az inzulinrezisztencia kialakulásához [8].

A zsírszövet különböző típusú sejtekből áll. A zsírszövet kollagenázzal történő enzimatikus emésztése során két fő frakció keletkezik: a zsírszövet frakció és a stroma vascularis frakció (SVF)[9]. Az SVF zsírból származó őssejteket (ASC), limfocitákat, endoteliális sejteket, pericitákat és fibroblasztokat tartalmaz [10]. Az ASC-ket immunfenotípus szerint a mezenchimális eredetű CD34 plusz CD90 plusz CD29 plusz CD45-CD31 sejtként határozzák meg, amelyek háromvonalas differenciálódási képességet mutatnak csonttá, porcba vagy zsírba [11,12]. A fehér zsírszövetekben ezek a sejtek főként a kis vérerek körüli vaszkuláris stromában találhatók, és szaporodhatnak és zsírsejtekké differenciálódhatnak[11]. A zsírból származó őssejtek (ASC) fontos szerepet játszanak a zsírszövet regenerációjában azáltal, hogy proliferáción, önmegújuláson és differenciálódáson mennek keresztül. Az öregedés az ASC-kben ezeknek a szártulajdonságoknak a elvesztésével jár [13,14]. A szubkután zsírraktár méretének életkorral összefüggő csökkenése feltehetően az ASC-k megváltozott replikációjának és differenciálódásának tudható be[15-17]. Findeisen et al. oxidatív stressz felhalmozódására utalnak a zsírszövetben az öregedés során, ami negatívan befolyásolja a differenciálódási képességet;[15] azonban az ASC-k szárának elvesztésének hátterében álló pontos mechanizmus(ok) nem ismertek. A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a csökkent autofágia, a rapamicin (mTOR) útvonal aktivitásának magasabb mechanikai célpontja és a reaktív oxigénfajták (ROS) felhalmozódása összefügg az ASC-k szárának elvesztésével és az ASC-k korai öregedésének indukciójával [18-20].

A Cistanche öregedésgátló hatású

A metformin egy antidiabetikus gyógyszer, amelyet általában a vércukorszint csökkentésére és az inzulinérzékenység javítására használnak. Számos öregedéssel összefüggő anyagcsere-rendellenesség kezelésére használható, mint például a szív- és érrendszeri betegségek, a rák és a kognitív hanyatlás [21,22]. A metformin élettartam-növelő hatását férgek, egerek és patkányok esetében kimutatták étrend-korlátozással, ami az adenozin-monofoszfáttal aktivált protein kináz aktivitás (AMPK) stimulálásának hatását utánozza[23]. Különféle tanulmányok kimutatták, hogy a metformin gátolja a rapamicin (mTOR) emlős célpontját [24,25]. Az AMPK-mTOR jelátviteli útvonalak specifikusan szabályozzák a sejtes homeosztázisok jellemzőit, mint például az autofágiát, a proliferációt, az energiametabolizmust és a fehérjeszintézist [26]. A metforminról kimutatták, hogy gátolja a proliferációt, a differenciálódást és a gyulladást, csökkenti az oxidatív stresszt és a mitokondriális potenciált, valamint javítja az általános ősállományt különböző típusú felnőtt őssejtekben [27,28]. A metformin hatása az ASC-k metabolizmusára és sztemére in vitro és in vivo nem egyértelmű.

Ebben a tanulmányban humán ASC-k 2D-tenyésztését és a teljes emberi zsírszövet-tenyésztési technikákat alkalmaztuk az in vivo sejtszerveződés és szöveti mikrokörnyezet szimulálására. Ezekkel a kísérleti modellekkel tanulmányoztuk a metformin kezelés hatását az ASC-k differenciálódására, proliferációjára és szárasságára, és megvizsgáltuk az ezekben a sejtfolyamatokban szerepet játszó molekuláris mechanizmusokat.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Az adományozó specifikációi

Öt nem cukorbeteg női donortól gyűjtöttek zsírszövetet, akik életkora 39 ± 13 és BMI tartomány 27 ± 4 volt, és akik elektív plasztikai sebészeti beavatkozásokon estek át a University of Pittsburgh Medical Centerben (UPMC). A szövetgyűjtés eljárását a Pittsburgh Egyetem Intézményi Felülvizsgáló Testülete hagyta jóvá (IRB No.0511186).

2.2. Humán ASC-k izolálása és tenyésztése

A zsíros prekurzor sejteket az alábbiak szerint izoláltuk [19,29]. A műtéti eljárások után a zsírszövet-biopsziákat steril, lezárt tartályban vitték át a laboratóriumba. A szövetet Dulbecco foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) öblítettük, majd a rostos anyagokat és az ereket boncolással eltávolítottuk. A szövetet darabokra vágtuk (1-2 mg), és emésztési pufferben (200 U/mL kollagenázt tartalmazó HBSS (CLS Type II, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NI) emésztettük. 2% w/o BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)) keverés közben 60 percig 37 fokon; 1 mg zsírszövet/3 ml emésztőpuffer. A diszpergált szövetet 10 percig centrifugáltuk 200xg-vel szobahőmérsékleten. A lebegő zsírsejteket leszívtuk, és a stromális vaszkuláris frakció (SVF) pelletált sejtjeit eritrocita lízis pufferben (0,155 M NH4CI, 5,7 mM K2HPO4, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) szuszpendáltuk, és 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A szövettörmelék eltávolítására a sejtszuszpenziót nejlonhálón (100 um pórusméret; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) átszűrtük. Egy újabb centrifugálási lépés után (10 perc 200×g-vel) a pelletált SVF-et ASC táptalajban (Dulbecco módosított Eagle táptalaj (DMEM)/F-12 táptalaj (1:1) HEPES-sel és L-glutaminnal (Thermo Fisher) szuszpendáltuk. Scientific, Waltham, MA, USA), kiegészítve 33 μM biotinnal (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 17 μM pantotenáttal (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 10 ng/mL EGF,1 ng/mL bFGF, 500 ng/ml inzulin, 2,5% magzati szarvasmarha szérum és 12,5 μM/mL gentamicin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), és 50,{46}} sejt sűrűségben van beoltva /cm2 T175-ös lombikban.

A 70 százalékos összefolyás elérése után a sejteket PBS-sel mostuk, és 0,05 százalékos tripszin-EDTA 1x oldattal tripszineztük (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). A tripszint ASC tápközeg plusz 10% FBS hozzáadásával inaktiváltuk, és 300xg-vel 5 percig végzett centrifugálással eltávolítottuk, mielőtt a sejteket 5000 sejt/cm2 sűrűséggel beoltottuk. Az ASC-ket ismét 70 százalékos összefolyásig növesztettük, mielőtt felosztották volna őket. Ebben a vizsgálatban a 3-4 passzusokban található ASC-ket használtuk. A sejteket különböző koncentrációjú metforminnal (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), rapamicinnel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) vagy U0126 inhibitorral kezeltük a kísérleti séma szerint.

2.3. Adipogén differenciálódás

Az adipogenezis indukálására az ASC-ket 50,000 sejt/cm² sűrűséggel oltottuk be 6-lyukú sejttenyésztő lemezekre. Az adipogenezist egy 0,2 uM inzulinból (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0,5 mM 1-metil{{9) álló differenciálódási táptalaj segítségével indukáltuk. }}izobutilxantin (IBMX) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0,25 μM dexametazon (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) és 10 ug/mL transzferrin (St. Louis, MO, St. Louis, MO, USA) az ASCmediumban. 3 napos differenciálódás után a tápközeget kicseréltük, és a sejteket IBMX nélküli differenciáló tápközegben tenyésztettük 14 napig.

2.4.Zsírszövet kultúra

A zsírszövettenyésztést 6-lyukú sejttenyésztő lemezeken végezték, némi módosítással, ahogyan azt Harms és munkatársai publikálták. [30]. Az egész zsírszövetet kisebb, 3-5 mm méretű darabokra vágtuk, és 5 ml sejttenyésztő tápközegben tenyésztettük. 70 μM pórusméretű sejtszűrőket tartottunk a szövetfragmensek felett, hogy a szövetet a táptalajba merítsék. A szövetfragmenseket kollagenázzal emésztettük, amint azt fentebb az ASC-k izolálási eljárásánál kifejtettük, és az SVF-et elemeztük az ASC-hez kapcsolódó törzsgének expressziójára.

2.5. Olajvörös O festés

A lipidcseppek megjelenítéséhez a sejteket 4 százalékos paraformaldehiddel PBS-ben fixáltuk 1 órán át, majd 0,3 százalékos Oil Red O-val (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) izopropanol/víz elegyben festettük. 60:40) 1 órán keresztül. A végső mosást kétszer desztillált vízzel végeztük. Az abszorbeált Oil Red O mennyiségi meghatározásához a foltot izopropanollal eluáltuk (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), és az optikai sűrűséget 518 nm-en mértük.

2.6. Testfestés

Az adipogenezis indukálása utáni 14. napon a sejteket Bodipy-val (Invitrogen, Waltham, MA, USA) és Hoechst-tel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) festettük 30 percig 37 °C-on. A képeket fluoreszcens mikroszkóppal vettük, és az ImageJ szoftverrel elemeztük.

2.7. FlouCitometria

A harmadik szakaszban lévő ASC-ket áramlási citometriás elemzésekhez használták a CD29 (Biolegend, San Diego, CA, USA), CD90 (Biolegend, San Diego, CA, USA), CD45 (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) felszíni expressziójára. , CD24 (Biolegend, San Diego, CA, USA) és CD31 (BD, NJ, USA). A sejteket tripszinnel kezeltük, PBS-sel mostuk, és FACS festőpufferben (1% BSA PBS-ben) lévő antitestekkel festettük. Kontrollként festetlen ASC-ket használtunk. A fluoreszcens jelet áramlási citométerrel (Fortessa, BD, Franklin Lakes, NJ, USA), az adatokat FlowJo szoftverrel (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) elemeztük.

2.8. Osteogén differenciálódás

Az ASC-ket összefolyásig növesztjük {{0}}lyuklemezeken, és oszteogén táptalaj segítségével (DMEM 10% FBS, 0,1 uM dexametazon, 10 mM glicerin-foszfát és 50 μM aszkorbinsav) oszteogén differenciálódást váltottunk ki. A differenciálódás utáni 21. napon a sejteket 4 százalékos paraformaldehidben fixáltuk (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), és Alizarin Red Stain festékkel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) megfestettük. Image J szoftverrel történt.

2.9. Apoptózis kimutatása Annexin V-APC/PI festéssel

Az apoptotikus sejthalált egy Annexin V-APC/PI kit (Biolegend, San Diego, CA, USA) segítségével mértük. Összesen 10,000(sejt/lyuk) ASC-t oltottunk 6-lyukú lemezekre, és 37 fokon inkubáltuk 5 százalékos CO2 mellett. A sejteket metforminnal kezeltük (0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2,5 mM és 5 mM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). 72 órás kezelés után a sejteket tripszinezéssel gyűjtöttük össze, és 2,5 μL AnnexinV-APC-vel és 2,5 μL PIin kötőpufferrel festettük, sötétben inkubáltuk szobahőmérsékleten 15-20 percig, és áramlási citometriával analizáltuk (Fortessa, BD, NJ, USA).

2.10. Reactioe oxigénfajok kimutatása

A ROS-szinteket fluoreszcens festék 2',7'-diklór-fluoreszcein-diacetát (DCFH2-DA) próbával (Invitrogen, Waltham, MA, USA) határoztuk meg. Az ASC-ket (10,000 sejt/lyuk) egy 6-lyukú lemezen tenyésztettük, és metforminnal (5 mM) inkubáltuk 37 °C-on, 5 százalékos CO-tartalom mellett 72 órán keresztül. Inkubálás után az ASC-ket tripszinnel kezeltük és 50 μM DCFH2-DA festékkel festettük 30 percig 37 fokon, majd fluoreszcens mikroszkóppal elemeztük.

2.11. TMRM festés

ASC-ket (10,000 sejt/lyuk) egy 6-lyukú lemezen tenyésztettük, különböző dózisú metforminnal (5 mM) kezeltük 72 órán keresztül, és 37 fokon 100 nM TMRM-mel (Sigma-Aldrich) inkubáltuk. , St. Louis, MO, USA) 30 percig 37 °C-on. Inkubálás után a sejteket fluoreszcens mikroszkóp alatt figyeltük meg. Image]-t a mikroszkópos képek fluoreszcenciájának számszerűsítésére használták.

2.12. Kvantitatív RT-PCR génexpresszió

A teljes RNS-t az RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Németország) segítségével izoláltuk, a cDNS szintézist pedig a RevertAid First Strand cDNS Synthesis Kit-tel (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) végeztük. A génspecifikus primereket a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) vásároltuk. A kvantitatív expressziós elemzést Quantstudio 3 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) segítségével végeztük. Az mRNS mennyiségi meghatározását -aktin használatával végeztük a normalizáláshoz. Az egyes géntranszkriptumok adatait a Ct-housekeeping és a Ct-Target gének közötti különbség (ACt) kiszámításával normalizáltuk. Az expresszió relatív növekedését vagy csökkenését a referenciagén és a célgén (AACT) összehasonlításával számítottuk ki a relatív expresszió képletével (=24ACt).

2.13. Western Blot

A Western blot analízist lényegében a leírtak szerint [19] végeztük. A fehérjeszintek normalizálására használt módszer a "Pierce BCA Protein Assay Kit" (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) volt. A sejtlizátumokat (15 ug összfehérje sávonként) nátrium-dodecil-szulfát (SDS) mintapufferben készítettük, SDS-PAGE-val elválasztottuk, és polivinilidén-difluorid membránokon blottoltuk. A következő antitesteket használtuk: egér anti-humán -aktin (Proteintech, IL, USA), perilipin (Cell Signaling, MA, USA), foszfor-P70S6K (Cell Signaling, MA, USA), teljes P70S6K (Cell Signaling, MA, USA), pERK1/2 (Cell Signaling, MA, USA), teljes ERK1/2 (Cell Signaling, MA, USA), anti-egér IgG HRP konjugátum (Proteintech, IL, USA) és nyúl anti-patkány IgG HRP ( Proteintech, IL, USA). A denzitometriás elemzésekhez Image J szoftvert használtunk. 2.14. Statisztikai elemzés

A statisztikai elemzéseket GraphPad Prism-ben (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) végeztük. A FACS elemzéshez FlowJo-t használtunk. Az átlagok közötti különbség jelentőségét Student-féle t-próbával vagy varianciaanalízissel értékeltük. A csupasz hiba az átlag ± SEM. Az értékek szignifikánsak voltak a p értékeinél<><0.01 and=""><>

3. Eredmények

A metformin egy jól bevált cukorbetegség elleni gyógyszer, amelyről kimutatták, hogy fontos szerepet játszik a hosszú élettartam meghosszabbításában [31]. A metformin kezelés zsírból származó őssejtek szárra gyakorolt ​​hatásának vizsgálatára humán donorok zsírszövetéből ASC-ket izoláltunk kollagenáz emésztéssel. Az izolált ASC-k képlékenyen tapadtak, és fibroblasztos vagy orsó alakú morfológiát mutattak. Az áramlási citometriás analízis azt mutatta, hogy az ASC-k pozitívak voltak a mezenchimális őssejt markerekre, például CD29-re, CD90-re és CD24-re, de negatívak voltak a CD45 hematopoietikus vonalmarkerre és a CD31 endoteliális vonal markerére (1A. ábra). Amellett, hogy a tipikus ASC fenotípust mutatták, az ASC-k erőteljes adipogén és osteogén differenciálódási potenciált mutattak, amelyeket Bodipy és Alizarin Red S festéssel azonosítottak (1B. ábra).cistanche แอ ม เว ย์A jellemzett ASC-ket tanulmányunk további kísérleteihez használtuk.

A szakirodalomban beszámoltak arról, hogy a metformin csökkenti az őssejtek adipogén differenciálódását. Célunk, hogy feltárjuk az ASC-k zsírsejt-differenciálódásának szabályozását metformin kezelés hatására. Az ASC-ket 1, 2,5 és 5 metforminnal kezeltük, 2 nappal az adipogén indukció előtt és a differenciálódási folyamat során. Bodipy és Oil Red Ostains segítségével vizualizáltuk az olajcseppeket a differenciálódás indukcióját követő 14. napon. Az Oil Red O (1C ábra) és a Bodipy festés (1D ábra) eredményei azt mutatják, hogy a metformin kezelés dózisfüggő módon jelentősen gátolja az adipogén differenciálódást a kontroll sejtekhez képest. Az adipogén differenciálódás gátlását tovább igazoltuk a perilipin zsírsejtek differenciálódási marker fehérje Western blot analízisével. Ehhez sejtlizátumokat gyűjtöttünk a differenciált sejtekből az adipogén differenciálódás 14. napján, és elemeztük a perilipin expressziót. Western blot eredményeink a perilipin expresszió szignifikáns csökkenését mutatják metformin kezelés hatására az adipogén differenciálódás során (1E. ábra), ami korrelált a Bodipy és az Oil Red O foltok csökkenésével. Megállapítottuk, hogy a metformin kezelés gátolja a humán ASC-k adipogén differenciálódását, és a gátlás mértéke pozitívan korrelál a metformin kezelés dózisával.

A magasabb differenciálódási és proliferációs ráta a szár elvesztését eredményezi. Mivel megfigyeltük, hogy a metformin csökkenti az adipogén differenciálódást, érdekelt bennünket a metformin kezelés hatásának vizsgálata az ASC-k in vitro proliferációjára. Az ASC-ket metforminnal kezeltük, és a sejteket a tenyésztés utáni 4. napon metformin jelenlétében vagy hiányában megszámoltuk. Eredményeinkből azt tapasztaltuk, hogy a metformin szignifikánsan csökkenti a sejtproliferációt a kontroll ASC-khez képest (2A ábra). Az őssejtek fontos szerepet játszanak a szövetek regenerációjában és karbantartásában.mennyi cistanche-t kell venniAhhoz, hogy az őssejtek hatékonyan elláthassák regeneráló szerepüket, meg kell őrizniük törzsi jellemzőiket. Elemeztük a metformin kezelés hatását a törzsi gének expressziójára ASC-ben. Ebből a célból kvantitatív valós idejű PCR-t alkalmaztunk az ASC-k szárának fenntartásával kapcsolatos gének elemzésére. Megfigyeltük, hogy a metformin szignifikánsan megnövelte a zsíros őssejt markerek, például a BMP7, DPP4, Sox2, Oct3/4, Wnt2, ICAM1, CD90 és DLK1 expresszióját, összehasonlítva a kontroll ASC-kkel (2B. ábra). Eredményeink azt mutatják, hogy a metformin kezelés hatékonyan lassítja az ASC-k proliferációját, így megakadályozza a sejtek proliferációjának kimerülését azáltal, hogy fokozza a szárba tartozó gének expresszióját.

1. ábra. A metformin kezelés dózisfüggő módon gátolja az ASC-k adipogén differenciálódását. (A) Az ASC-ket CD29, CD90, CD24, CD31 és CD45 expressziójára teszteltük áramlási citometriával. Mind a hisztogramon látható százalékos pozitivitás, mind a kontroll táblázatban látható átlagos fluoreszcencia intenzitás (MFI) (festetlen ASC-k) és festett (a megfelelő antitestekkel kezelt ASC-k) bemutatásra kerül. (B) Az ASC-ket adipogén vagy osteogén differenciálódásnak vetettük alá, vonal-specifikus differenciálódási koktélok segítségével. Az adipocita vonaltól való differenciálódást Bodipy festéssel, az oszteogenezist pedig Alizarin Red festéssel igazoltuk. Az Alizarin Red festett terület százalékos arányát a J kép segítségével számítottuk ki. (C) Az ASC-ket zsírsejtek differenciáló koktéljával kezeltük különböző dózisú metformin jelenlétében vagy hiányában 14 napon keresztül. Az adipociták fejlődését az indukció utáni 14. napon lipidcseppek Oil Red O festéssel történő megfestésével értékeltük. Az abszorbeált Oil Red O foltot kivontuk, és megmértük az optikai sűrűséget. A kontroll ASC-k optikai sűrűségét 100 százaléknak vettük, és a metformin-kezelés hatására bekövetkező relatív változást ábrázoltuk (n =3). (D) A lipidtartalmat a 14. napon Bodipy festéssel (zöld) határoztuk meg. Hoechst-et (kék) használtunk a sejtmagok megfestésére.mi az a cistanche(E) A perilipin fehérje expressziójának Western blot analízise. - Az aktint alkalmaztuk terhelési kontrollként. A perilipin fehérjesáv-sűrűség kvantifikálása -Aktinra normalizálva. Kép ​​J. A képek és grafikonok három független ismétlést reprezentálnak (n=3). *p<0.05,**><0.01,***p><0.001 and="" ***=""><0.0001 as="" compared="" with="">

Annak kizárására, hogy a differenciálódás és a proliferáció csökkenése nem a metformin ASC-kre gyakorolt ​​citotoxikus hatásai miatt következhet be, elemeztük a metforminnal kezelt sejtek életképességét. Az AnnexinV/PI festődés áramlási citometriával végzett elemzése nem mutatott ki szignifikáns növekedést az apoptotikus vagy nekrotikus sejtek számában, ha a metformin koncentrációját 5 jim-ig növelték a sejttenyésztő tápközeg kontrolljához képest (3A. ábra). A mitokondriális aktivitás és a reaktív oxigénfajták (ROS) képződése fontos szerepet játszik a sejtdifferenciálódásban, és az adipogén differenciálódás során fokozott mitokondriális metabolizmust és ROS-képződést figyeltek meg [32]. Eredményeinkből azt tapasztaltuk, hogy a metformin kezelés csökkenti az ASC-k adipogén differenciálódását. Ezt követően a mitokondriális aktivitásra és a ROS termelésre gyakorolt ​​hatásokat vizsgáltuk. Az ASC-ket metforminnal kezeltük, és TMRM-mel festettük a mitokondriális membránaktivitás értékelésére, valamint DCF2DA-val a ROS-koncentráció becslésére. A fluoreszcens mikroszkópos felvételek és a fluoreszcens jel mennyiségi meghatározása feltárta, hogy a metformin kezelés jelentősen csökkenti a mitokondriális aktivitást (3B, C ábra) és a ROS termelést (3D, E ábra). Arra a következtetésre jutottunk, hogy a mitokondriális aktivitás és a ROS termelés metformin által közvetített csökkenése hozzájárul az ASC-k szárának növekedéséhez.

Annak érdekében, hogy megértsük a lehetséges jelátviteli kaszkádot, amely az ASC-kben a zsírsejtek differenciálódásának, proliferációjának és a törzsgének felszabályozásáért felelős metformin kezelés hatására, az mTOR-ra, az autofágiára és az extracelluláris szignál-szabályozott kináz (ERK) jelátviteli kaszkádokra összpontosítottunk. Korábbi tanulmányok kimutatták ezen útvonalak fontos szerepét az ASC-k szárának megőrzésében[19,33]. Mind az ERK, mind az mTOR jelátvitel fontos szerepet játszik a sejtproliferáció és -differenciálódás elősegítésében. Miután az ASC-ket különböző dózisú metforminnal kezeltük, a sejtlizátumokat összegyűjtöttük, és Western blottoltuk az LC3, foszforilált-p70S6 kináz, teljes p70S6 kináz, foszforilált ERK42/44 és teljes ERKp42/44 antitestek kimutatására. A béta-aktint háztartási génként alkalmazták. A Western blot analízis azt mutatta, hogy a kontroll ASC-kkel összehasonlítva a metformin kezelés csökkentette a foszforilált p70S6K és a foszforilált-ERK42/44 kináz expresszióját (4A, B, D ábra). Mind az ERK, mind az mTOR jelátvitel fontos szerepet játszik az autofágia útvonal szabályozásában.bioflavonoidokA Western blot eredmények azt mutatták, hogy a metformin kezelés fokozza az autofágia aktivitást az ASC-kben (4A, C ábra). Kvantitatív valós idejű PCR alkalmazásával tovább elemeztük az autofágia útvonal gének expresszióját metformin kezelés hatására mRNS szinten. A qPCR elemzéssel a VMP1, P62, ATG5 és ATG7 autofágia útvonal gének szignifikáns növekedését figyeltük meg metformin kezelés hatására (4E ábra), ami összhangban van a Western blot eredményeinkben mutatott autofágia aktivitás növekedésével. Elemzéseink során az ATG 9 expressziójának nem szignifikáns növekedését is megfigyeltük. Arra a következtetésre jutottunk, hogy a metformin-kezelés csökkenti az ERK- és mTOR-aktivitást, és fokozza az autofágiát az ASC-kben, mint a csökkent proliferáció és differenciálódás, valamint a megnövekedett szárfajta lehetséges mögöttes mechanizmusa.

Az ERK és mTOR jelátvitel közvetlen szerepének hangsúlyozása érdekében a differenciálódás metformin-kezelés által közvetített gátlásában és az ASC-k szárának növekedésében külön-külön gátoltuk az ERK jelátvitelt és az mTOR útvonalat az ERK gátló U0126 és a rapamicin segítségével, és elemeztük az ASC-re gyakorolt ​​​​hatásokat. differenciálódás és szárasság [19,33]. Az U0126 ERK-inhibitor hozzáadása az ASC-k zsírsejt-differenciálódása során szignifikánsan csökkent differenciálódást eredményezett, amint azt a Bodipy-festett képek és a fluoreszcencia kvantifikálása mutatta (5A., B. ábra). Kvantitatív valós idejű PCR-eredmények, amelyek azt mutatják, hogy az inhibitor által közvetített specifikus gátlás hatására a törzsi gének felszabályozódnak. Az ERK-jelátvitel (5C. ábra) további alátámasztotta azt a megállapításunkat, hogy az ERK-útvonal metformin-kezelés általi downregulációja hozzájárul a szár növekedéséhez.

Ezt követően rapamicint, egy jól ismert mTOR-útvonal-gátlót használtunk, amely képes aktiválni az autofágiát, és értékeltük az adipogenezisre és a törzsi génexpresszióra gyakorolt ​​​​hatásokat [19]. A rapamicinnel kezelt ASC-k sejtlizátumait összegyűjtöttük, és foszforilált-p70S6 kinázzal, teljes p70S6 kinázzal és -aktin antitestekkel vizsgáltuk. Megfigyeltük, hogy a rapamicin csökkentette a foszforilált-p70S6 kináz expresszióját (6A ábra). Az adipogén differenciálódásban betöltött funkcionális szerep meghatározásához az ASC-ket rapamicinnel kezeltük, és adipogén táptalajjal indukáltuk. 14 nap elteltével a sejteket Bodipy festéssel festettük meg, hogy értékeljük az adipogenezist. Megfigyeltük, hogy a rapamicin kezelés szignifikánsan csökkentette az adipogén differenciálódást (6B, C ábra). Ezt követően elemeztük az mTOR jelátvitel blokkolásának hatását az ASC-k törzsére. Ennek érdekében az ASC-ket rapamicinnel kezelték, és valós idejű PCR-t alkalmaztak a szárhoz kapcsolódó transzkriptumok expressziójának mérésére. Megfigyeltük, hogy a rapamicin szignifikánsan növelte a szárral kapcsolatos markerek expresszióját (6D ábra). Arra a következtetésre jutottunk, hogy mind az ERK, mind az mTOR útvonal gátlása hozzájárul a zsírsejtek differenciálódásának csökkenéséhez és a szár növekedéséhez a humán ASC-kben.

Ezt követően azt teszteltük, hogy képesek vagyunk-e reprodukálni a metformin kezelés szárnövelő hatásait 2D-kultúrott ASC-ken egy összetettebb és in vivo lefordítható teljes zsírszövet-tenyésztési modellben. Ehhez módosítottuk a Harms és munkatársai által közzétett zsírszövettenyésztési protokollt30], transzwell inszertek helyett sejtszűrőket használva, hogy a zsírszövet-fragmenseket a táptalajba merülve tartsuk (7A. ábra). Miután 5 napig tenyésztettük az emberi zsírszövet 3-5 mm-es fragmenseit metforminnal vagy anélkül, zsírszöveti fragmentumok kollagenázos emésztésével izoláltuk a stromális vascularis frakciót (SVF), és elemeztük a szárhoz kapcsolódó gének expresszióját. A valós idejű PCR-adatok azt mutatták, hogy a metforminnal kezelt zsírszövetből származó SVF szignifikánsan megnövelte az olyan szár markerek expresszióját, mint a BMP7, DLK1, MYC1, DPP4, OCT3/4, Sox2, Nanog, KLF4, PDGFR és Wnt2 (7B. ábra). ).

4. Megbeszélés

A zsíros őssejtek (ASC) önmegújuláson és differenciálódáson keresztül regenerálják a zsírszövetet, így fenntartják a szövet őssejtkészletét. Az öregedés és az elhízás azonban az ASC-k szár tulajdonságainak elvesztésével jár. A metformin egy antidiabetikus gyógyszer, és ígéretes eredményeket mutatott öregedésgátlóként. A metforminnak az ASC-k törzsére gyakorolt ​​hatásának elemzésére és a mögöttes mechanizmus megértésére összpontosítottunk, azzal a céllal, hogy a metformint az életkor előrehaladtával fenntartsuk az ASC-k szárának fenntartásához szükséges potenciális szerként. Eredményeink humán alanyokra való könnyebb átültetése érdekében humán ASC-k 2D sejttenyésztési modelljét alkalmaztuk, és a humán zsírszövettenyésztési módszert alkalmaztuk a bonyolultabb szöveti környezet szimulálására. Vizsgálataink során szöveti forrásként a bőr alatti zsírszövetet használtuk. Ezekkel a változatos sejt- és szövettenyésztési módszerekkel vizsgáltuk a metformin kezelés hatását az ASC-k szárára.

Az elhízás megváltoztatja az ASC differenciálódási kinetikáját, ami csökkenti az őssejtállományt. Eredményeink arra utalnak, hogy a kezeletlen ASC-kkel összehasonlítva a metformin kezelés dózisfüggő módon csökkentette az adipogenezis sebességét. Ez a megfigyelés összhangban van a korábbi jelentésekkel, amelyek kimutatták, hogy a metformin gátolja az adipogenezist a zsír őssejtekben, a csontvelő stromasejtekben, a parodontális ínszalag őssejtekben és a 3T3 sejtvonalakban [34-37]. Az őssejtek szaporodási sebessége fontos szerepet játszik az őssejtkészlet, az őssejt és az önmegújulási képesség fenntartásában. Megfigyeltük, hogy a metformin gátolta az ASC-k proliferációját anélkül, hogy citotoxikus hatást váltana ki az ASC-kre, ami megegyezik az egerekből származó zsírból származó őssejteken [28], stromasejteken és fibroblasztokon [38,39] publikált egyéb tanulmányokkal.vegyél cistanche-tEgy közelmúltban végzett, zsírból származó, lovakból származó őssejtekkel végzett tanulmány kimutatta a metformin proliferációt elősegítő hatását [27]. Ezeknek az ellentmondásos megfigyeléseknek a legvalószínűbb magyarázata a donorfajok és a sejtgyűjtés anatómiai helyének különbsége, mivel a ló ASC-it a farkából gyűjtötték be. Agnieszka Smieszek et al. megfigyelték, hogy a metformin növekvő dózisokkal (5 és 10 mM) gátolja a sejtproliferációt és elősegíti a sejthalált egér csontvelő-eredetű stromasejtekben és a Balb/3T3 embrionális fibroblaszt sejtvonalban [40]. Ezenkívül a metformin gátolja az egérizmokból izolált szatellitsejtek proliferációját |41. Megfigyelésünket alátámasztva Min-lung Park et al. beszámoltak arról, hogy a metformin javítja a humán ASC-k gyulladásgátló tulajdonságait az IL-1, IL-6 és TGF- expressziós szintjének csökkentésével; A metformin emellett növeli a transzplantált ASC-k túlélését, és védelmet nyújt az apoptotikus sejthalál ellen [42]. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a metformin-kezelés eltérő hatással van a különböző fajokból származó sejtek életképességére, és hogy a humán ASC-k rezisztensek a metformin-kezelés lehetséges citotoxikus hatásaival szemben.

Az ASC-k zsírsejtekké történő differenciálódása magasabb energiaigénnyel és metabolikus sebességgel jár, ami magasabb mitokondriális aktivitást és ROS-termelést eredményez. A ROS kritikus szerepet játszik a felnőtt őssejtek nyugalmának és őssejtjének fenntartásában, mivel a magasabb ROS szint a sejteket a differenciálódás és végső soron az őssejt öregedés és sejthalál felé tolja [43]. Megfigyeltük, hogy a metformin jelentősen csökkenti a mitokondriális membránpotenciált és a reaktív oxigénfajták képződését. Adatainkkal összhangban korábbi tanulmányok arról is beszámoltak, hogy a metformin csökkenti az oxidatív stresszt és javítja az antioxidáns expressziót egérembrionális fibroblasztokban [44], egér ASC-ben [38] és humán aorta endothel sejtjeiben [45]. Ezen túlmenően, tanulmányunkkal egyetértésben Chien-Hung Lin és munkatársai arról számoltak be, hogy a metformin neuroprotektív szerként működik azáltal, hogy csökkenti az oxidatív stresszt az emberi idegi őssejtekben [46]. Számos más tanulmány is megerősíti, hogy a metformin antioxidánsként hat az oxidatív stressz csökkentésével és az antioxidáns enzimek expressziójának fokozásával, mint például az egér ASC-kben a szuperoxid-diszmutáz, az egér C2C12 mioblasztjai és a keringő humán endothel progenitor sejtjei [38,47,48]. Sőt, Alejandro Martin-Montalvo és munkatársai tanulmánya. alátámasztja megfigyelésünket, amely igazolja, hogy a metformin jelentősen gátolja a mitokondriális komplexet, gátolja a mitokondriális légzést egerekben [49] A metforminnak a csökkent reaktív oxigénfajták képződésére kifejtett hatásait valószínűleg a redukált glutation [50] növekedése közvetíti egy olyan mechanizmusban, amely magában foglalja a redox- szenzitív transzkripciós faktor Nrf2 [51].

Kimutatták, hogy a metformin elősegíti a szatellitsejtek nyugalmi állapotát azáltal, hogy csökkenti a proliferációhoz és differenciálódáshoz szükséges metabolizmust. Különböző tanulmányok azt is megerősítik, hogy a metformin erősen elősegíti az őssejtek őssejtjét és megfiatalodását [23,39,41,49,52,53]. Az is ismert, hogy jelentősen javítja és szabályozza az őssejtmarkerek expressziós szintjét. Mivel megfigyeltük, hogy a metformin gátolja a proliferációt és az adipogenezist az oxidatív stressz és a mitokondriális aktivitás gátlásával, megpróbáltuk megerősíteni, hogy a metformin javítja-e a szárat ASC-kben vagy egy in vitro zsírszövettenyésztési modellben. Ennek megfelelően megfigyeltük, hogy a metformin szignifikánsan javította a DPP4, Wnt2, THP1, DLK1, PDGFR, ICAM1 és Annexin3, Oct3/4, Nanog, BMP4, SOX2 és Mycl törzshöz kapcsolódó markerexpresszióját 2D ASCculture és zsírszövettenyésztési modellekben. . A teljes zsírszövettenyészet alkalmazása egyedülálló lehetőséget kínál az emberi szövetek in vivo mikrokörnyezetének szimulálására, ahol a sejtek a természetes felépítésükhöz hasonlóan orientálódnak, és a szöveti mátrixba beszőtt különböző sejttípusokból interaktív támogatást kapnak. Legjobb tudomásunk szerint tanulmányunk első ízben bizonyítja a metformin kezelés szárnövelő hatását humán ASC-kre, mind 2D, mind teljes zsírszövettenyészetekben. Eredményeink, amelyek a metforminnal kezelt zsírszövet-fragmensekből izolált ASC-kben a törzsi gének szignójának felszabályozását mutatják, a metformin öregedési folyamat lassítására és az elöregedett zsírszövetek megfiatalítására szolgáló terápiaként való további vizsgálatát javasolják.

A rapamicin mechanisztikus célpontja (mTOR) kulcsszerepet játszik az őssejtek proliferációjában és differenciálódásában. Az mTOR-aktivitás génmanipulációval, terápiás beavatkozással vagy életmóddal összefüggő változtatásokkal történő downmodulálása növeli a törzset és a hosszú élettartamot [19,20]. Mivel megfigyeltük, hogy a metformin gátolja az adipogenezist, teszteltük a metformin hatását az mTOR jelátvitelre. Érdekes módon az eredmények azt mutatták, hogy a metformin szignifikánsan csökkenti a PS70S6 kináz foszforilációs szintjét, amely kulcsfontosságú jelzőmolekula az mTOR-tól lefelé, és az mTOR útvonal aktivitásának riportere. Korábbi tanulmányok arra is utalnak, hogy a metformin elnyomja az adipogenezist azáltal, hogy gátolja az mTOR jelátviteli útvonalat egérembrionális fibroblasztokban (MEF), C3H10T1/2 egér mezenchimális őssejtekben és 3T3-L1 preadipocitákban [34]. A rapamicin mechanikus célpontja két komplexből, az mTORCl-ből és az mTORC2-ből áll, és a jelátvitel fontos szerepet játszik az adipogenezisben. Az mTORC1 jelátvitel rapamicinnel történő gátlása kimutathatóan károsítja az adipogenezist a PS6-kináz foszforilációjának csökkenése révén a 3T3-L1 preadipocitákban. Ezek a vizsgálatok azt is kimutatták, hogy az mTOR jelátvitel gátlása gátolja az adipogenezist azáltal, hogy csökkenti az adipocita-vonal markerek, például a PPARgamma, CEBPI, CEBP1 és adiponektin expressziós szintjét [54-56]. Ezenkívül az mTOR jelátvitelt az S6 kináz foszforilációja közvetíti. Az S6 kináz leütése az adipogenezis károsodása miatt ellenállónak bizonyult az elhízással és a súlygyarapodással szemben a magas zsírtartalmú étrend mellett [57]. Megerősítettük azt a megfigyelésünket, hogy az mTOR aktivitás metformin által közvetített downregulációja a szár növekedésének és az ASC-k csökkent differenciálódásának lehetséges közvetítője lehet rapamicin alkalmazásával, amely specifikusan blokkolja az m TOR útvonal aktivitását.

Az mTOR mellett az ERK jelátviteli útvonal döntő szerepet játszik a proliferációban és az adipogenezisben. Xiaomin Ning és munkatársai publikációjukban azt állítják, hogy az adipogenezist az ERK jelátvitel aktiválja [58]. Mivel megfigyeltük, hogy a metformin gátolja az adipogenezist és a proliferációt, úgy döntöttünk, hogy megvizsgáljuk a metformin hatását az ERK jelátvitelre. A korábbi jelentésekkel összhangban eredményeink arra is utaltak, hogy a metformin gátolja az adipogenezist az ERK jelátvitel elnyomásán keresztül, és fokozza a törzshöz kapcsolódó génexpressziót. Az mTOR jelátvitel szükséges a sejtproliferációhoz és differenciálódáshoz, és az autofágia negatív szabályozója [{{2 }}]. Az autofágia elvesztése azonban összefügg a szár elvesztésével, bár a metformin kezelés javította a szárral kapcsolatos génexpressziót az autofágiával kapcsolatos markerexpresszió, például az LC3Il aktiválásával. Eredményeink tehát azt sugallják, hogy a metformin az autofágia aktiválásával és az mTOR jelátviteli útvonalak gátlásával rontja az adipogenezist azáltal, hogy javítja a törzset a humán ASC vagy a humán zsírszövettenyészet modellekben. A metforminnak az ASC-k biológiájára gyakorolt ​​​​hatásának felmérésére összpontosító jövőbeni in vivo állat- és emberkísérletek irányítják majd a metformin, mint őssejt-öregedésgátló szer alkalmazásának adaptációját.

Ez a cikk a Biomedicines 2021, 9, 1782-ből származik. https://doi.org/10.3390/biomedicines9121782 https://www.mdpi.com/journal/biomedicines