A metil-jázmonát jellegzetes hidrolizálható tannin-, favonoid- és fito-oxilipin-válaszokat vált ki a gránátalma (Punica Granatum L.) leveleiben 1. rész

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Absztrakt:A növényekben termelődő metil-jázmonát (MeJA) közvetítheti a környezeti stresszre adott válaszukat. Kimutatták, hogy a MeJA exogén alkalmazása számos növényfajban aktiválja a jelátviteli útvonalakat és indukálja a fitoalexin felhalmozódását. Annak megértéséhez, hogy a gránátalma növények hogyan reagálnak biokémiailag a környezeti stresszekre, MeJA-val kezelt gránátalma leveleken metabolitanalízist végeztek, és egyedülálló változásokat tártak fel a hidrolizálható tanninokban, flavonoidokban és fito-oxilipinekben. Ezen túlmenően az ál- és MeJA-kezelt gránátalma levelek transzkriptom és valós idejű qPCR-elemzései differenciáltan expresszálódó metabolikus géneket és transzkripciós faktorokat azonosítottak, amelyek potenciálisan szerepet játszhatnak ahidrolizálhatótannin, flavonoid és fito-oxilipin útvonalak. Molekuláris, biokémiai és bioinformatikai jellemzése az egyetlenlipoxigenázA tartós, MeJA-indukált expresszió azt mutatta, hogy képes a többszörösen telítetlen zsírsavak oxidálására, bár nem található abban a szubcelluláris kompartmentben, ahol a nem jázmonát (nem JA) fito-oxilipinek termelődtek. Ezek az eredmények együttesen azt sugallják, hogy míg a flavonoidok és antocianinok széles körű elnyomása legalább részben szabályozott transzkripciós szinten, a nem-JA indukált bioszintéziseFito-oxilipinekvalószínűleg nincs transzkripciósan szabályozva. Összességében annak jobb megértése, hogy a gránátalma levelei hogyan reagálnak a környezeti terhelésekre, nemcsak a növények egészségét és termelékenységét mozdítja elő, hanem hatással lesz az emberi egészségre is, mivel a gránátalma növények által termelt gyümölcsök tápanyag-összetevők gazdag forrásai.

Kulcsszavak:Metil-jázmonát.Flavonoid·Antocianin · Zsírsav.Fito-oxilipin· Lipoxigenáz

Kérjük, kattintson ide, ha többet szeretne megtudni

Bevezetés

Amikor megsebesülnek vagy megtámadják növényevők és kórokozók, a növények metil-jázmonátot (MeJA) termelnek és bocsátanak ki, amelyet a nem sebzett növényi szövetek és a szomszédos növények védekező reakció aktiválásaként érzékelnek (Cheong és Choi 2003). Ezenkívül kimutatták, hogy a MeJA exogén alkalmazása növényen jelátviteli útvonalakat, valamint a patogenezishez kapcsolódó fehérjék és a fitoalexinként ismert védekező vegyszerek termelését váltja ki. A fenolos fitoalexinek, például a flavonoidok és az antocianinok fokozott felhalmozódást mutattak a MeJA-kezelés hatására különböző növényekben, mint például az Arabidopsis thaliana, a szőlő (Vitis vinifera), a banán (Musa acuminate), az alma (Malus Domestica) és a vörös málna (Rubus idaeus). ) (Pandey et al. 2016; Portu et al. 2015; De Geyteret al. 2012; Shafiq et al. 2011; Flo-res és Ruiz del Castillo 2014). A flavonoidok és antocianinok bioszintézise a naringenin kalkon képződésével kezdődik kumaroil-CoA-ból és három malonil-CoA-molekulából, amelyet kalkon szintáz (CHS) katalizál, majd a naringenin kalkont a kalkon (CHIRA) naringeninné izomerizálja. A naringenint ezután felhasználják a mag flavonoid és antocianin vázak létrehozására, amelyeket tovább módosítanak glikozil-, metil-, hidroxil- és prenil funkciós csoportokkal, hogy különböző szerkezeteket és funkciókat hozzon létre (Tian et al. 2008).

A Cistanche javíthatja az immunitást

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>75 százalékos hasonlóság), és nem tartalmaznak szignálpeptidet, míg a II-es típusú LOX-ok összességében alacsony szekvenciahasonlósággal rendelkeznek (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

A gránátalma (Punica granatum L.) egy speciális kertészeti növény, amelyet a gyümölcsében található fenolvegyületek, például flavonoidok, antocianinok és hidrolizálható tanninok (HT-k) miatt értékelnek, amelyek a shikimát útvonal egy köztes termékéből származnak (Ono et al. 2016). ). Eddig számos tanulmány foglalkozott a gránátalma fenoljainak szerepével az emberek stresszének és betegségeinek enyhítésében (Wu és Tian 2017). Ezzel szemben keveset tudunk a fenolok és más fitokemikáliák szerepéről a gránátalma abiotikus és biotikus tényezőkkel szembeni védelmében (pl. sebzés, kórokozók, MeJA indukció) levelekben és termésekben. Két közelmúltbeli jelentés értékelte a betakarítás előtti MeJA-kezelést a gránátalma gyümölcseinek betakarítás utáni minőségére vonatkozóan (Koushesh Saba és Zarei 2019; Garcia-Pastor et al. 2020). A MeJA-val kezelt gyümölcsök összes antocianin-, flavonoid- és fenoltartalmát, de a leveleket nem, együttesen elemeztük spektrofotométer segítségével. Az egyik tanulmány az egyes antocianinokat is elemezte tömegspektrometriával (Garcia-Pastor et al. 2020). Továbbra sem világos azonban, hogy a gránátalma növényi szövetei – akár levelei, akár termései – hogyan reagálnak a terméskötés előtti környezeti terhelésekre.

A gránátalma növények és a környezeti tényezők közötti kölcsönhatások boncolásának megkezdéséhez nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) és folyadékkromatográfiás-elektrospray ionizációs tandem tömegspektrometriával (LC-ESI-MS/MS) vizsgáltuk a gránátalma leveleinek metabolikus reakcióját az exogén MeJA alkalmazásra. . A HT-k, flavonoidok és antocianinok egyedi változásait, valamint a lipidek, zsírsavak és fito-oxilipinek változásait figyelték meg a MeJA-val kezelt gránátalma levelekben. A valós idejű qPCR-analízissel validált összehasonlító transzkriptom-analízis kimutatta, hogy a HT-, flavonoid-, antocianin- és fito-oxilipin-anyagcserében részt vevő strukturális és/vagy szabályozó gének eltérően expresszálódnak az ál- és MeJA-val kezelt gránátalma levelekben. Az egyetlen LOX gént, amely tartósan fokozott expressziót mutatott a MeJA-val kezelt levelekben, további molekuláris, biokémiai és filogenetikai jellemzésnek vetettük alá.

Anyagok és metódusok

Vegyszerek

A -glukogallin és pentagalloilglükóz standardokat a Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd-től (Sanghaj, Kína) vásároltuk. A LOX-tesztben használt vegyi anyagokat a következő szállítóktól szereztük be: 3-(dimetilamino)benzoesav (DMAB) (Adamas Reagent, Co., Ltd., Shanghai, Kína), linolsav (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 3-metil-2-benzotiazolinon (MBTH) és hemoglobin (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Kína).

Növényi anyagok

A gránátalma gyümölcsöket és magokat (Cv. Wonderful) a Panzhihua Mezőgazdasági és Erdészeti Tudományok Akadémia nagylelkűen biztosította, és Dr. Binjie Ge azonosította a Shanghai Chenshan Botanikus Kertben. Az utalványmintát (szám: CSHO173966) a Shanghai Chenshan Botanical Garden herbáriumában helyezték el, Sanghajban, Kínában. A gránátalma palántákat szabályozott hőmérsékletű termesztőhelyiségben neveltük 6 hétig 25 fokos hőmérsékleten és 16 óra világos/8 óra sötétben. A MeJA koncentrációja a növényi szövetekre történő permetezésnél a jelentések szerint 100 és 250 μM között van (Ku et al., 2014); Hickman et al.2017). Kezdetben különböző koncentrációjú MeJA-t alkalmaztak a gránátalma levelekre, amelyek közül 200 μM MeJA észrevehető metabolikus választ eredményezett az előzetes elemzésben, és ezt használták a jelen tanulmányban leírt metabolit- és génexpressziós elemzésekhez. A MeJA kezelés előtt a gránátalma növények felét egy másik termesztőhelyiségbe költöztették, hasonló körülmények között. Míg az egyik termesztőhelyiségben lévő növényeket 200 μM MeJA-val, a másik termesztőhelyiségben lévő növényeket vízzel (azaz álkontroll) permeteztük. 2-h,3-h,6- h,12-h,24-h, 30-h,36-h,48-h, and72-h a kezelés után indul 3-tól 5 ál- vagy MeJA-kezelt növényt egyesítettünk, amelyek egy biológiai ismétlést alkotnak. Három biológiai ismétlést gyűjtöttünk a próba- és MeJA-kezelési kísérletekhez; minden biológiai replikátumot aliquot részekre osztottunk a metabolitprofil meghatározásához és a génexpressziós elemzésekhez.

Metabolitprofil-elemzés

A gránátalma leveleit liofilizáltuk, lemértük és finom porrá őröltük cirkónium-oxid gyöngyökkel egy gyöngyhabverőben (Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haan, Németország) a 90-es években 30 Hz-en. A HPLC analízishez a levélmintát 70 százalékos metanolban 60 percig ultrahangos kezelés mellett extraháltuk, majd 13, 000 fordulat/perc mellett 10 percig centrifugáltuk. A felülúszót egy HPLC fiolába vittük át, amelyből 30 μL-t fordított fázisú HPLC-be fecskendeztünk (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), és a korábban leírtak szerint elemeztük (Wil-son et al. 2019). A metabolitokat UV-abszorpcióval detektáltuk 254 nm, 280 nm, 320 nm és 360 nm hullámhosszon. Megszerkesztettük a -glukogallin és a pentagalloilglükóz standard kalibrációs görbéit; a -glukogallin és a pentagalloilglükóz retenciós idejével és abszorpciós spektrumával megegyező csúcsok területeinek konvertálására használtuk a megfelelő koncentrációkra.

Az LC-ESI-MS/MS analízishez a homogenizált levélmintát (100 mg) 1 ml 70%-os metanollal extraháltuk 4 fokos éjszakai hőmérsékleten. A következő napon a metanolos kivonatot 10 °C-on centrifugáltuk. ,000×g 10 percig, majd a felülúszót egy CNWBOND Carbon-GCB SPE patronon (ANPEL, Sanghaj, Kína) és egy 022- μm-es fecskendőszűrőn (ANPEL) engedtük át. metabolit elemzés.

A kivonatot (2 μL) LC-ESI-MS/MS segítségével elemeztük (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Japán; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) és egy fordított fázisú C1s oszlop (ACQUITY UPLC HSS T3, 1,8 m, 2,1 mm × 10} 0 mm, Waters, Milford, MA, USA). A metabolitokat 0,04% ecetsavat tartalmazó oldószerekkel (A) vízzel eluáltuk. és (B) acetonitril, amely 0,04% ecetsavat tartalmaz, gradiens: 0-11 min, 95-5% A;11-12 min,5% A;12-12,1 perc ,5-95 százalék A;12.1-15min, 95 százalék A. Az áramlási sebességet 0,4 ml min-1 értéken tartottuk. Lineáris ioncsapda (LIT) és tripla kvadrupól (QQQ) MS vizsgálatokat végeztünk pozitív és negatív ion módban. A turbó permetező ionforrást 500 °C-on 5500 V ionizációs feszültséggel üzemeltettük. Az ionforrás gáz I, gáz I és függönygáz 55 psi, 60 psi és 25 psi nyomásra volt beállítva. Az ütközési gázt (nitrogén) 5 psi-re állítottuk be. Az MRM elemzéshez a deklaszterezési potenciált (DP) és az ütközési energiát (CE) optimalizáltuk minden egyes prekurzor-termék ionátmenetre.

For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>=1 jelentősen megváltozott.

Transzkriptom elemzés

A teljes RNS-t a gránátalma leveleiből TRIzol reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) extraháltuk, és mennyiségileg meghatároztuk Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) segítségével. Az RNS-minták integritását agaróz gélen történő elválasztással (látható lebomlás nélkül) és az OD20/28o arány meghatározásával (1,8 és 2,2 között) Nanodrop2000 segítségével ellenőriztük. Az mRNS teljes RNS-ből való feldúsítását oligo (dT) mágneses gyöngyök (Invitrogen) segítségével végeztük. Az mRNS-Seq könyvtárakat a Truseq RNS könyvtár előkészítő készlettel (Illumina, San Diego, CA, USA) hoztuk létre. A transzkriptomanalízist Illumina HiSeq4000-en végezték, és minden mintakönyvtárhoz 55-60 millió 150-bp páros végű leolvasást (PE150) kaptunk.

A nyers sorozatadatok feldolgozása az adapter szekvenciák eltávolításával, valamint a short(<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS:GitHub. com/Joshi/sickle).Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1, és beállított P érték<>

Valós idejű qPCR elemzés

A teljes RNS-t ál- és MeJA-val kezelt gránátalma levelekből extraháltuk az RNAprep Pure Plant Kit (Tiangen Biotech Co., Ltd., Peking, Kína) segítségével. A reverz transzkripciót (RT) teljes RNS és PrimeScriptTM RT Reagent Kit (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japán) felhasználásával végeztük. A kvantitatív PCR-t (qPCR) a TB GreenTM Premix Ex Taq TM(Tli RNaseH Plus) kit segítségével végeztük. Takara) és egy StepOnePlus valós idejű PCR rendszer (Ther-moFisher Scientific). Olvadási görbe analízist végeztünk, amely egyetlen amplifikációs terméket mutatott minden egyes primerpárhoz. Az RT-qPCR analízishez három biológiai ismétlést és mindegyiket három technikai ismétléssel vizsgáltunk ál- és MeJA-kezelt minták tekintetében. A génexpressziót összehasonlító C,(△AC) módszerrel elemeztük (Livak és Schmittgen 2001), a szignifikanciaszinteket pedig kétirányú Student-féle t-teszttel határoztuk meg. A valós idejű qPCR elemzés primer szekvenciáit és a primer párok amplifikációs hatékonyságát az S1 táblázat mutatja.

Rekombináns fehérjék expressziója és tisztítása és enzimes vizsgálatok

A Pgr025417 nyílt leolvasási keretét (amely egy feltételezett LOX-ot kódol) az optimális kodonhasználat érdekében szintetizáltuk E. coli-ban (Genewiz, Suzhou, Kína), és pET28a-ba klónoztuk. A rekombináns plazmidot E. coli BL21-be transzformáltuk. (DE3) sejtek. Egy 5- ml Luria Bertani (LB) tenyészetet 50 ug ml Ikanamycinnel indítottunk el egyetlen telepből, és egy éjszakán át inkubáltuk rázatás közben 37 °C-on. Az egy éjszakán át tartó tenyészetet egy 100- ml LB táptalaj 50 ug ml-kanamicinnel való beoltására használtuk, és hagytuk nőni 0,5 OD600-ra. Ezután izopropil- -D-tiogalaktozidot (IPTG) adtunk hozzá 0,1 mM végső koncentrációban a fehérjeexpresszió indukálására. 18 órás 16 fokos rázatással végzett inkubálás után a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük. A sejtpelleteket lízispufferben (50 mM NaH, PO, pH 7,4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol) újraszuszpendáltuk, és sejtroncsolóval (Constant Systems Ltd, Northants, Egyesült Királyság) homogenizáltuk. Ni-NTA gyöngyök (ThermoFisher Scientific) a mosópufferrel (50 mM NaH, PO, pH 7,4, 300 mM NaCl, 25 mM imidazol) és az elúciós pufferrel (50 mM NaH, PO, pH 7,4 300 mM NaCl, 500 mM) imidazol). A tisztított fehérjéket 10%-os SDS-PAGE gélen választottuk el a fehérje tisztaságának megjelenítésére. A tisztított fehérjék koncentrációját Bradford assay (Bradford 1976) alkalmazásával határoztuk meg.

A LOX-teszthez linolsavat használtak szubsztrátként egy kétlépcsős, kolorimetriás módszerrel, kis módosításokkal (Anthon és Barrett 2008). A 500-μL reakcióelegyet, amely 50 mM Na-foszfátot, pH 6, 10 mM DMAB-t, 0,5 mM linolsavat és különböző mennyiségű tisztított rekombináns fehérjét (1,5 mg ml-) tartalmaz, inkubáltuk. 25 °C-on 10 percig. Egy második oldatot (500 µl), amely 0,2 mM MBTH-t és 0,1 mg ml-'hemoglobint tartalmazott, adtunk a reakcióelegyhez, amelyet további 5 percig inkubáltunk. A reakciót 500 μl 1%-os (w/v) nátrium-lauril-szulfát hozzáadásával állítottuk le. A fényelnyelést 598 nm-en határoztuk meg.

Szubcelluláris lokalizáció és filogenetikai elemzések

A megjegyzésekkel ellátott gránátalma genomban végzett keresés (Qin et al. 2017) 1 liter feltételezett teljes hosszúságú LOX-ot azonosított (786-970 aminosav), beleértve a Pgr025413, Pgr020032, Pgr025418, Pgr02541gr1gr18, Pgr02541gr18,8 teljes hosszúságú sorozat a GenBank XP_031395793), Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 és PgrO13780 alkalmazásban. A gránátalma LOX-ok szignálpeptidjeinek szubcelluláris lokalizációját és hasítási helyeit a TargetP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/servi ces/TargetP/) (Almagro Armenteros et al. 2019) segítségével jósolták meg.

TF-kötőhely elemzés

A TF-ek kötőhelyeinek előrejelzéséhez a célgének ATG startkodonja előtt 1000 bp-nyire a GenBank-tól szereztük be, és az Eucalyptus Grandis TF-ek ellen kerestük a PlantRegMap-ben (5-ös verzió) (Tian et al. 2020). A kötődés küszöbértéke A hely azonosítását P értékre állítottuk. Kisebb vagy egyenlő, mint le-4.

Statisztikai analízis

A metabolitok mennyiségi meghatározására, a transzkriptomra és a valós idejű qPCR-adatokra vonatkozó statisztikai elemzést a megfelelő szakaszok ismertetik.

Eredmények

A MeJA modulálja a sejtjelátvitelt és a metabolikus útvonalakat a gránátalma levelében

A gránátalma genomszintű transzkripciós válaszának megértéséhez a MeJA kiváltására, a gránátalma leveleinek transzkripciói a MeJA után 2-h,6-h,24-h és 72-h után. álkezelést (mindegyik három biológiai ismétléssel) elemezték (S1. ábra). Körülbelül 55 millió nyers szekvencia-leolvasást (2 × 150 bp páros vég) kaptunk minden egyes transzkriptomra, ahol a GC-tartalom körülbelül 52%, a Q30-értékek pedig 91,6 és 95% közöttiek (S2 táblázat). Az összes transzkriptom esetében a tisztított szekvencia-leolvasások több mint 96 százaléka a referencia gránátalma genomhoz volt leképezve (Qin et al. 2017) (S3 táblázat). Az összeállított transzkriptumok többsége 1000 bp-nál (34,3 százalék), 1000 bp-nál kisebb volt. 2000 bp (32,9 százalék), vagy 2000–3000 bp (18,1 százalék) (S4 táblázat).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, korrigált P<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="">

Shikimát és HT útvonal gének és HT metabolitok indukálódtak MeJA-val kezelt gránátalmalevélben Amint az a transzkriptom és a KEGG útvonal dúsítási analíziséből kiderült, három shikimate bioszintetikus útvonal gén fokozott expressziót mutatott a MeJA-val kezelt levelekben a hamis kontrollokhoz képest {{3 }}h, beleértve a 3-dezoxi-D-arabinóz-heptulozonát-7-foszfát-szintázt (DAHPS), a 3-dehidrogenát-szintázt (DHS) és a bifunkcionális 3-dehidrogenát-dehidratázt/ shikimát-dehidrogenáz (DHQ/SDH; rövidítve SDH) (S1b. és la. ábra). Különösen a gránátalma SDH-k három izoformáját azonosították, amelyek eltérő expressziót mutattak a transzkriptomanalízisben: Pgr020271, Pgr019030 és Pgr019029,

Annak megállapítására, hogy a shikimát és a HT bioszintetikus géntranszkriptumok mennyiségének változása befolyásolhatja-e az ezen útvonalakból származó metabolitok szintjét, fenolos metabolitokat vontunk ki a 24-h, 30-h időpontban betakarított levelekből. 36-h,48-h és 72-h MeJA vagy álfelhordás után, és HPLC-vel elemezve (2. ábra). Megjegyzendő, hogy ezeket az időpontokat úgy választottuk ki, hogy figyelembe vegyék a fehérjeszintézishez és metabolittermeléshez és felhalmozódáshoz szükséges időt a shikimát és HT bioszintetikus gének megfigyelt expressziós változásai után 6- óránál. A 4,57 percnél (1. csúcs) és 24,98 percnél (2. csúcs) eluálódó két metabolit retenciós ideje és abszorpciós spektruma megegyezett a HT-útvonal intermedierei - glükogallin és Penta ötvözetek - glükóz retenciós ideje és abszorpciós spektruma (la és 2a ábra). Mindkét csúcs szignifikáns változást mutatott az integrált csúcsterületeken több időpontban (2b. ábra). Pontosabban, az 1. csúcs a MeJA-val kezelt levelekben nőtt a próbakontrollokhoz képest 30-h, 36-h és 48-h (2b. ábra). Érdekes módon a MeJA-val kezelt levelek 2-es csúcsértéke kezdetben 24-órán csökkent, de később 30-órán és 36-órán nőtt, majd visszatért a hamis kontrollokhoz hasonló szintre 48--kor. h és 72-h (2b. ábra).

A legtöbb flavonoid és antocianin csökkentése, valamint a metilált flavonok és flavonolok megnövekedett szintje nyilvánvaló volt a MeJA-val kezelt gránátalma levelekben

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; S5 és S6 táblázat). A differenciálisan felhalmozódott metabolitok esetében a növényi másodlagos/speciális metabolizmusban részt vevő metabolitok (67/102), különösen a fenolos vegyületek (63/102) általános feldúsulása figyelhető meg (S6. táblázat).

A fenolosok közül a flavonoidok és antocianinok széles körének összehangolt csökkenése (a 73 csökkent vegyület közül 42) nyilvánvaló volt a MeJA-val kezelt levelekben (3. ábra; S6 táblázat). Érdekes módon három mono- vagy di-O-metilezett flavon és flavonol, köztük a di-O-metil-kvercetin, a krizoberil-O-hexozil-O-hexozid és a 5-O-hexozid eladási mennyisége megnövekedett a MeJA-val kezelt levelekben (3. ábra; S6 táblázat). A flavonoid és antocianin útvonalak számos intermedierje, köztük a luteolin, krizoberil, dihidrokaempferol, dihidroquercetin, dihidromiricetin, epikatekin, delfinidin és pelargonidin kimutatható volt, de nem mutattak szignifikáns változást a MeJA-val kezelt leveleken (3. ábra; Table S5). A hidroxicin-namoil-származékok, az izoflavonok és a kumarinok többek között olyan fenolok voltak, amelyek csökkent felhalmozódást mutattak MeJA indukció hatására (S6. táblázat). Ezzel szemben két fenolsav, a 2,3-dihidroxi-benzoesav és a protokatekuinsav (3,4-dihidroxibenzoesav), valamint egy kumarin, a 6-metil-kumarin szintje emelkedett a MeJA-val kezelt levelekben. (S6 táblázat).

A MeJA-val kezelt gránátalma levelekben található flavonoidok és antocianinok nagymértékben csökkentett mennyiségével összhangban a flavonoidok és antocianinok bioszintéziséhez szükséges két kulcsenzim átirata. A CHS(Pgr005566) és a CHI (Pgr025966) értéke szignifikánsan csökkent a MeJA alkalmazását követő 6- és 24- órában a transzkriptomanalízis szerint (4. ábra). Valós idejű qPCR analízist végeztünk a CHS és CHI expresszió vizsgálatára további időpontokkal, például 2-h, 3-h, 6-h,12-h,{{ 11}}h,48-h és 72-h (4. ábra). A CHS-transzkriptumok leestek a MeJA-val kezelt levelekben 3-órában, és továbbra is szignifikánsan alacsonyabbak maradtak, mint a hamisaknál kontrollok 72- óráig, a legnagyobb csökkenés 12- óráig. Ezzel szemben a CHI expresszió csökkenése csak a MeJA-kezelést követő 24-, 48- és 72- órában volt szignifikáns (4. ábra).

Ez a cikk a Planta (2021) 254:89 oldalból származik: https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9