A MiR-103a-3p hangcsillapítás javítja a kalcium-oxalát lerakódását a patkányvesében az UMOD/TRPV5 tengely aktiválásával

Az egyensúly fenntartásakalcium (Ca2+) anyagcseréta vesében döntő fontosságúa vesekövek képződésének megakadályozása. Funkcionálisan az ebben a folyamatban részt vevő mikroRNS-t (miRNS) fel kell tárni. Az NRK{0}}E sejt sérülését okoztukoxalát kezelés. A tranziens receptorpotenciál kationcsatorna V tagú 5. alcsaládjának (TRPV5) szerepét oxalát-indukált sejtekben TRPV5 overexpressziós transzfekcióval, qRT-PCR-rel, Western blot-tal, MTT-vel és kristályadhézió detektálással vizsgáltuk. Miután azonosítottuk az uromodulin (UMOD) expresszióját sérült sejtekben, megerősítettük a TRPV5 és az UMOD közötti kölcsönhatást koimmunprecipitációs (CoIP) és sejtfelszíni biotinilációs vizsgálatokkal. Elvégeztük az UMOD-szabályozó TRPV5 validálását az oxalát-indukált sejtek életképességében, kristályadhéziójában és Ca2+ koncentrációjában. Bioinformatikai analízist és luciferáz vizsgálatot használtunk a miRNS-t célzó UMOD azonosítására. A miR-103a-3p-szabályozó UMOD/TRPV5 tengely szerepét mentési kísérletek mutatták ki. Etilénglikollal (EG) kezelt patkánymodellt készítettünk a miR-103a-3p/UMOD/TRPV5 tengely in vivo vizsgálatára hematoxilin-eozin (H&E) festéssel, Western blottal és immunhisztokémiával. (IHC). A TRPV5 fokozott szabályozása megvédte az NRK-52E sejteket az oxalát által kiváltott sérülésektől a sejtek életképességének fokozásával és a CaOx adhézió gátlásával. Az UMOD kimerült az oxalát-indukált sejtekben, és pozitív kölcsönhatásba lép a TRPV5-tel. Az UMOD elnémítása megfordította a TRPV túlzott expressziójának hatását az oxalát által kiváltott sejtekre. A miR-103a-3p az UMOD-t célozta meg, és az UMOD/TRPV5 tengely szabályozásában közvetített oxalát-indukált sejtekben. A miR-103a-3p csökkentése csökkentette az EG által kiváltott CaOx-szintetlerakódás a veseszövetekbenin vivo az UMOD/TRPV5 tengely aktiválásával. A miR-103a-3p az UMOD/TRPV5 tengely aktiválásával javította a CaOx-lerakódást a patkányvesében.

NÖVÉNYI KÉSZÍTMÉNY ALErakódás a veseszövetekben

1. Bevezetés

Húgyúti fogkő, az egyik leggyakori betegségek az urológiában, a vesében a vizeletből túltelített kristályok kicsapódása okozza [1]. Bár nem olyan agresszív, mint a rosszindulatú daganatok, a húgyúti fogkő régóta komoly hatással van az emberi egészségre magas előfordulási és kiújulási arányuk miatt [2]. Tanulmányok megerősítették, hogy a húgykő megjelenése többtényezős, és magában foglalja a genetikát, az anyagcserét, a környezeti klímát és az életmódbeli szokásokat [3, 4]. A kalcium-oxalát (CaOx) kövek felelősek a betegség eseteinek többségéért, és a legtöbb Ca{4}-tartalmú kövekben szenvedő betegeknél a hypercalciuria kombinációja [5]. Fizikai-kémiai vizsgálatok igazolták, hogy a vizelet CaOx telítettsége összefügg a Ca2+ koncentrációjával, és hogy a megnövekedett vizelet kalcium hajlamosítja vagy elősegíti a Ca2+- tartalmú nephrolithiasis kialakulását [6]. A vesekő magas vérnyomáshoz, krónikus vesebetegséghez és végstádiumú vesebetegséghez vezethet. Tanulmányok beszámoltak arról, hogy átfogó anyagcsere-felmérést követően megelőző intézkedések, beleértve a specifikus farmakológiai beavatkozásokat, valamint az életmód- és táplálkozási változtatásokra vonatkozó ajánlásokat, folytathatók [7, 8]. Különböző humán vizsgálatok azt sugallták, hogy a magasabb zöldség- és gyümölcsbevitelt tartalmazó étrend szerepet játszik a vesekő kialakulásának megelőzésében [9–11]. Jelenleg mélyreható vizsgálatot kell végezni a vesekőképződésben fellépő rendellenes kalcium-anyagcsere által kiváltott hiperkalciuria molekuláris mechanizmusáról.

A TRPV5 egy fontos fehérje, amely szabályozza a Ca2+ transzportját a sejtmembránokon [12]. A veseszövetekben a TRPV5 főként a disztális csavart tubulusban (DCT) és a gyűjtőtubulusban (CNT) található, amelyek a vizelet Ca2+ reabszorpciójának szabályozásáért és a Ca2+ homeosztázis fenntartásáért felelősek a szervezetben [13] . A rendelkezésre álló bizonyítékok arra utalnak, hogy a csökkent TRPV5 expresszió létfontosságú patogén tényező lehet a hypercalciuria és a Ca{8}}tartalmú nephrolithiasis kialakulásában [14].

1. táblázat: A qRT-PCR-hez használt primer szekvenciák.

Az uromodulin (UMOD), más néven Tamm-Horsfall fehérje, a vizeletben a legnagyobb mennyiségben előforduló glikoprotein [15], amely elsősorban a vese tubulusos hámsejtjeiben expresszálódik, számos fiziológiai funkcióval, mint például a víz-elektrolit anyagcsere kiegyensúlyozása, az immunitás szabályozása. , megelőzi a vesekőképződést és véd a húgyúti fertőzések ellen [16–18]. Jelenleg kevés jelentés szól az UMOD specifikus molekuláris mechanizmusáról a vesekőképződésben.

A mikroRNS-ek (miRNS-ek) kisméretű, nem kódoló, egyszálú, körülbelül 20-22 nukleotid hosszúságú RNS-molekulák osztálya, amelyek széles körben előfordulnak emlősökben [19]. Az érett miRNS-ek szabályozhatják a célgének poszttranszkripciós expresszióját azáltal, hogy teljesen vagy részben komplementer módon kötődnek a cél-mRNS 3'-UTR-jához, ami a fehérje transzlációs szintézis lebomlását vagy gátlását eredményezi [20]. Mivel a miRNS-ek drámaian befolyásolják az emberi fiziológiai tevékenységeket, például a növekedést és fejlődést, a sejt apoptózist és az anyagcserét, nagy ígéretet jelentenek a betegségek megelőzésében és kezelésében [21]. Az elmúlt években a miRNS-ek vesekövek kialakulásában és kialakulásában betöltött szerepével kapcsolatos kutatások forró témává váltak [22, 23].

Ezért ez a tanulmány megvizsgálta az UMOD és a TRPV5 közötti kapcsolatot a vesekőképződés megelőzésében, és megvilágította a miR-103a-3p szerepét az UMOD célzásában és szabályozásában, hozzájárulva a vesekőképződés mélyebb megértéséhez. a vesekő patogenezisét, és új ötleteket ad a betegség megelőzésére és kezelésére.

2. Anyag és módszer

2.1. Sejtkultúra és oxalátos kezelés.

Az NRK{{0}}E (GNR 8) epithelioid patkányvese sejtvonalat a China Center for Type Culture Collection-től (CCTCC) (Sanghaj, Kína) szereztük be. DMEM-et (12800017, Gibco, USA) desztillált vízzel, 7,5%-os NaHCO3-oldattal (25080094, Gibco, USA) és 5%-os magzati szarvasmarha-szérummal (FBS) (BC-SE-FBS02, Bio channel, Kína) készítettünk a tenyésztéshez. sejteket inkubátorban (37 °C és 5% CO2). Az áttenyésztés után a sejteket hígított oxaláttal (0,75 mmol/l, 135623, Sigma Aldrich, USA) indukáltuk 48 órán át (óra), a korábban leírtak szerint [24]. 2.2. Sejttranszfekció. A molekuláris mechanizmus vizsgálatához TRPV5-túlexpresszáló plazmid (Bes-mR-001007572, Ber sinBio, Guangzhou, Kína), UMOD-t túltermelő plazmid (Bes-mR-001278605, BersinBio, Guangzhou, Kína), kis interferáló RNS UMOD (siUMOD) ellen (5'-CTCTTT TATCACACTTGATATGA-3', GenePharma, Shanghai, Kína), miR-103a-3p inhibitor (GenePharma, Shanghai, Kína) és a miR-103a-3p mimic-ot (BersinBio, Guangzhou, Kína) különböző transzfekcióknak vetettük alá NRK- 52E sejtekben, a megfelelő kontrollok beállításával. A transzfekció előtt az NRK-52E sejteket 6-lyukú lemezen tenyésztettük (2 × 106 sejt/lyuk). Körülbelül 80%-os sejtösszefolyás eléréséig a TRPV5-túlexpresszáló plazmidot, az UMOD-t túlexpresszáló plazmidot, a siUMOD-ot, a miR-103a-3p inhibitort vagy a mimikát NRK-52E-be transzfektáltuk. sejtek lipoic time 2000 (11668019, Invitrogen, USA) alkalmazásával a gyártó protokollja szerint. Ezt követően a transzfektált NRK- 52E sejtek kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakciót (qRT-PCR) és Western blotot kaptak minőségértékelés céljából, majd oxaláttal kezelték őket.

2.3. RNS extrakció és qRT-PCR.

Az NRK{0}}E sejtekből származó teljes RNS-t és miRNS-t Cell RNA Kit (19231ES50, Yeasen, Kína) és MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit (19331ES50, Yeasen, Kína) segítségével extraháltuk. Ezután a HiScript II One-Step RT-PCR készletet (P612-01, Vazyme, Kína) alkalmaztuk a kivonattal való reakcióhoz a kezelési utasításokat követve. Az erősítési feltételeket a következőképpen állítottuk be: 50 °C 30 percig, 94 °C 3 percig, majd 30 ciklus (94 °C 30 másodpercig, 60 °C 30 másodpercig és 72 °C 40 másodpercig), és 72 °C-on 5 percig. A qRT-PCR-t ABI 7500 rendszerben (Applied Biosystems, USA) végeztük. A relatív mRNS expressziót a 2−ΔΔCt módszerrel [25] elemeztük, normalizáláshoz -aktint vagy U6-ot használtunk. Az összes primer szekvenciát az 1. táblázat mutatja.

2.4. Western Blot.

A mintákból (NRK-52E-sejtek és patkányveseszövetek) származó teljes fehérjét RIPA lízispufferrel (R0010, Solarbio, Kína) lizáltuk, és a BCA Protein Assay Kit-tel (BI-WB005, Sbjbio, Kína) határoztuk meg. Egyenlő mennyiségű fehérjét választottunk el 10%-os nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (P0690, Beyotime, Kína), és PVDF membránokra vittük (AR0136- 02, Boster, Kína). A blokkoló pufferrel (P0252, Beyotime, Kína) végzett kezelés után a membránokat anti-TRPV5-tel (ab137028, 83 kDa, 1/10000), anti-UMOD-dal (ab207170, 110 kDa, 1/1000) és anti{ {20}}aktin (ab8226, 42 kDa, 1/1000) antitestek 4 °C-on egy éjszakán át. A másodlagos antitesteket, beleértve az anti-nyúl IgG-t (ab97051, 1/2000) és az anti-egér IgG-t (ab205719, 1/2000), ezután a membránok 2 órán át szobahőmérsékleten történő inkubálására használtuk. A relatív fehérje blot detektálást az iBright Imaging Systemben (CL750, Invitrogen, USA) végeztük ECL puffer (WBKlS0100, Millipore, USA) segítségével a vizualizációhoz. - Az Actin belső kontrollként szolgált.

2.5. Sejtéletképességi vizsgálat.

A sejtszuszpenziókat a jelen tanulmányban leírtak szerint állítottuk elő [24]. Az NRK-52E sejteket 5000 sejt/lyuk sűrűséggel 96-lyukú tenyésztőlemezekre oltottuk, és 10 μL metil-tiazolil-difenil- tetrazólium-bromid (MTT) oldattal (40201ES72, Yeasen, Kína) kezeltük a sejteket minden egyes lyukban 37 °C-on 4 órán át, majd SDS-HCL kezelést. A sejtek életképességének értékeléséhez az optikai sűrűség (OD) értéket 570 nm-es hullámhosszon mikrolemez-leolvasóval (VL0L00D0, Thermo Fisher, USA) mértük.