A MiR-199-3p fokozza az izomregenerációt, és javítja az öregedő izom- és izomdisztrófiát

További információért forduljon a következőhöz: oscar.xiao@wecistanche.com

A parabióziskísérletek arra utalnak, hogy a fiatalodással és öregedéssel kapcsolatos molekuláris tényezők keringenek a vérben. Itt megmutatjuk, hogy a miR-199-3p, amely sejtmentes miRNS-ként kering a vérben, szignifikánsan csökkent az idős egerek vérében a fiatal egerekhez képest; a miR-199-3p pedig képes a miogén differenciálódás és az izomregeneráció fokozására. Az idős egereknek miR-199 utánzók beadása, amelyek miR-199-3p-t biztosítanak, izomrost-hipertrófiát és késleltetett izomerő-vesztést eredményezett. A miR-199 utánzók szisztémás beadása mdx egereknek, amely a Duchenne-i izomdisztrófia (DMD) jól ismert állatmodellje, jelentősen javította az egerek izomerejét. Összességében a vérben lévő sejtmentes miR-199-3p öregedésgátló hatással bír, például ahipertrófiás hatást fejt ki az elöregedett izomrostokra, és új RNS-terápiás hatást fejthet ki a DMD, valamint az életkorral összefüggő betegségek kezelésére. Az eredmények új betekintést nyújtanak a vérben keringő miRNS-ek, mint életkorral összefüggő molekulákba.

További információért kattintson ide

A létfontosságú funkciók, mint például az izomerő, az idegrendszer működése, a légzésfunkció, a fertőzésekkel szembeni védekezés és a betegségekkel szembeni ellenállás az öregedéssel csökkennek. Az ilyen funkcionális hanyatlással összefüggő betegségek és működési zavarok egyre szaporodnak, és komoly problémává válnak az idősödő társadalmakban. Különféle változások, például anyagcsere- és génszabályozási változások következnek be a szervezetben az öregedéssel{0}}; és az ilyen változások tanulmányozása segíthet megérteni az öregedést, és stratégiákat kínálhat az elöregedő társadalmak előtt álló problémák kezelésére. Az öregedéssel kapcsolatos biomolekulákat (beleértve a géneket is) azonosították, és hasznosak lehetnek az öregedéskutatásban; például a -galaktozidáz és a plolnk4a expressziója a sejtek öregedéséhez kapcsolódik4-6, és a klotho gént nem tartalmazó egérmodellt számos fenotípusú öregedési modellként ismerik, amelyek az emberi idő előtti öregedéshez hasonlítanak.

A parabiózis két olyan személy egyesülése, akiknek közös érrendszere van, és kísérletileg műtéttel hozható létre8. A parabiózissal végzett kísérletek, amelyek során fiatal és idős rágcsálókat egyesítettek, hogy közös érrendszert használjanak, azt mutatták, hogy a fiatal állatok öregedési folyamata felgyorsult, míg az idős állatok megfiatalodtak9-12. Az eredmények határozottan azt sugallják, hogy bizonyos, a fiatalodással és öregedéssel kapcsolatos tényezők jelen vannak, és vérrel keringenek az érrendszerben, azonban ezek a keringési tényezők még nem teljesen ismertek3.

A Cistanche öregedésgátló hatású

A mikroRNS-ek (miRNS-ek) 21-23-nukleotid hosszúságú kis, nem kódoló RNS-ek, amelyeket hosszabb átiratokból (elsődleges miRNS-ek) dolgoznak fel emésztéssel, mikroprocesszor komplexszel a sejtmagban és Dicerrel a citoplazmában, és beépülnek az RNS-indukált csendesítő komplex (RISC)14,15. A RISC-ben lévő MiRNS közvetítőként működik a géncsendesítésben, ahol a miRNS-sel részlegesen komplementer hírvivő RNS-ek (mRNS-ek) transzlációja gátolt, vagy a miRNS-hez közel komplementer szekvenciákat hordozó mRNS-ek emésztettl4,15.Cistanche kivonat sugárzás elleni védelemÍgy a miRNS-ek fontos szerepet játszanak a génszabályozásban azáltal, hogy elnyomják a célgén expresszióját. Több ezer miRNS-gént találtak állatokban és növényekben [lásd a mikroRNS-adatbázist (miRBase): http://www.mirbase.org/index.shtml]. Megvizsgálták a miRNS-ek expressziós profilját, és kimutatták a miRNS-ek szövet- és fejlődési stádium-specifikus expresszióját és betegséghez kapcsolódó expressziójátl6-21. A miRNS-eket érintő génszabályozás szorosan összefügg különböző létfontosságú funkciókkal és életjelenségekkel, beleértve a betegségeket14,16,21-24

A MiRNS-ek a sejteken kívül és belül is jelen vannak25. Például a miRNS-ek sejtmentes nukleotidként vannak jelen a vérben, és az érrendszerben keringenek2627. Az ilyen sejtmentes miRNS-ek (cf-miRNS-ek) kis vezikulákba épülnek be, amelyeket extracelluláris vezikuláknak neveznek, vagy fehérjékhez kapcsolódnak, ezáltal védelmet kapnak az extracelluláris nukleázokkal szemben25, 28. Néhány cf-miRNS jelenléte jelentős lehet; például jelentős összefüggéseket mutattak ki a cf-miRNS-ek és bizonyos betegségek között26,27,29-31. A Cf-miRNS-ek tükrözhetik a fizikai állapot változásait; így az ilyen miRNS-ek potenciális biomarkerek lehetnek az életfenntartó rendszerek, valamint a betegségek monitorozásában.

A jelen vizsgálatot a cf-miRNS-ek és az öregedés közötti összefüggések vizsgálatára végezték, valamint a fiatal és idős egerek vérében lévő cf-miRNS-eket vizsgálták. Az eredmények a cf-miRNS-ek változását mutatták ki fiatal és idős egérvér között. Az ilyen miRNS-ek között a miR-199-3p jelentősen csökkent az idős vérben a fiatal vérhez képest. Érdekes módon a miR-19-3p képes fokozni az izmok differenciálódását és regenerálódását, és idős egereknek történő beadása az izomrostok bővülését eredményezte. Amikor a miR-199-3p-t bevitték mdx egerekbe, a Duchenne-i izomdisztrófia (DMD) állatmodelljébe, az egerek izomereje jelentősen javult. A jelen tanulmány új betekintést nyújt a vérben keringő cf-miRNS-ekbe az öregedés, a látens képesség és az orvosi alkalmazások szempontjából.

Eredmények

Cell-free miRNAs in the blood of young and aged mice. We investigated cf-miRNAs in the blood of young (6-week-old) and aged (>23-hónapos) C57BL/6J egerek, DNS microarray segítségével az életkorral összefüggő különbségek azonosítására. A cf-miRNS-ek profilja markáns különbségeket mutatott fiatal és idős egerek között, azaz olyan cf-miRNS-eket mutattak ki, amelyek a fiatal és idős egérvérre hajlamosak (1. táblázat). Az ilyen miRNS-ek közül a miogén miRNS-ek (pl. miR-1 és miR-133)1833 voltak jelen a fiatal vérben bőségesen előforduló miRNS-csoportban; más szavakkal, a miogén miRNS-ek lényegesen kevesebbet voltak az idős vérben (1. táblázat).cistanche herbaA fiatal és öreg vér közötti miRNS-ek különbségét kvantitatív reverz transzkripciós-polimeráz láncreakcióval (qRT-PCR; la ábra) igazoltuk, majd a plazmából izolált kis vezikulákból, úgynevezett exoszómákból kinyert RNS-források felhasználásával reprodukáltuk tovább. Kiegészítő 1. ábra).

A sejttenyésztési kísérletek viszont feltárták, hogy a fiatal egérszérum képes volt miogén differenciálódást indukálni, és ez a képesség erősebb, mint az idős egereké (1b. ábra). Megvizsgálták az inzulinszerű növekedési faktor I-et (IGF-I), amely a miogén differenciálódást kiváltó fő faktor a vérben34,35; azonban nem volt szignifikáns különbség a fiatal és az idős vér között (lc. ábra). Így a fiatal vérben lévő IGF-I-től eltérő tényezők is szerepet játszhatnak a miogén differenciálódásban.

A miR-199-3p erősen képes miogén differenciálódást indukálni. Vizsgáltuk a fiatal vérben bőségesen előforduló miRNS-ek hatását a miogén differenciálódásra. Szintetikus miRNS-utánzatokat juttattunk be C2C12 sejtekbe, egy egér myoblaszt sejtvonalba, és megvizsgáltuk a miogén differenciációs markerek, a miogenin (Myog) és miozin nehézlánc 1 (Myh1) gének expresszióját. Az eredmények váratlanok voltak, és felkeltették érdeklődésünket: a miR-199-3p, amelyet negatív miRNS-nek jósoltak a miogén differenciálódásra vonatkozó kevés információ miatt, jelentősen indukálta a Myog és a Myh1 expresszióját (2a, b ábra). Ezenkívül a miR-199-3p indukciója erősebb volt, mint a hagyományos miogén miRNS-eké: a miozin nehézláncának expressziója a miR-199-3p jelenlétében különösen figyelemre méltó (2b., c. ábra).

A miR-199-3p és a miogén differenciálódás közötti kapcsolat tisztázása érdekében megvizsgáltuk a sejtes és extracelluláris (exosomális) miR-199-3p-t a miogén differenciálódás során, valamint a miR-199-3p inhibitorok hatását. a megkülönböztetésről. Az endogén (celluláris) miR-199-3p expressziója a differenciálódás megindulása után felfelé ívelt. Az exoszomális miR-19-3p egyszer nőtt, majd csökkent (2a. kiegészítő ábra). Az inhibitoros kezelés elnyomta a myogén differenciálódási markerek, a Myog, Myh1 és a kreatin-kináz (Ckm) expresszióját (2b. kiegészítő ábra).cistanche pénisz növekedésÍgy az eredmények arra utalnak, hogy a miR{0}}p részt vesz a miogén differenciálódásban.

MiR{0}} utánzók tervezése. A miR-199 mimikákat úgy terveztük, hogy azok hatékonyan képesek miR-199-3p-t termelni, mint funkcionális közvetítőt (vezetőszálat) a géncsendesítésben. A tervezett miRNS-utánzatokat szűrtük, és a miR199#4-et választottuk ki kompetens miR-199 utánzónak (3. kiegészítő ábra). Ezt követően a miR199#4-et mind in vivo, mind in vitro kísérletekben alkalmazták.

A miR-199-3p célgénjei a miogén differenciációban. A miR-199-3p célgénjei miogén differenciálódás alatti azonosítása érdekében jelölt géneket kerestünk a TargetScan adatbázisból, és a Lin28b és Suz12 génekre összpontosítottunk, amelyek mindkettő C2C12 mioblasztokban expresszálódik. A Lin28b és a Suz12 feltételezett miR-199-3p-kötő szekvenciákkal rendelkezik a 3'-végi nem transzlált régiójában (UTR; 3a. ábra). Kimutattuk, hogy a feltételezett szekvenciák a miR-19-3p hiteles kötőhelyei, a kötőszekvenciákat és a megfelelő nem illő szekvenciákat hordozó luciferáz riporter génekkel (3a, b ábra). A feltételezett kötőszekvenciákat hordozó luciferáz géneket szignifikánsan elnyomta a miR-199-3p [pLin28b-(81), pLin28-(983) és pSuz12-(973)], míg a a nem illeszkedő szekvenciák, amelyek bázisszubsztitúciós mutációkat tartalmaznak a magban [pLin28b-(81)mut, régióban, megszüntették annak elnyomó hatását [pSuz12-(973)mut]. pLin28-(983)mut és Amikor miR-199 utánzót juttattak a C2Cl2 sejtekhez, a Lin28b és a Suz12 expressziója következetesen elnyomott (3c. ábra). Annak felmérésére, hogy a Lin28b és/ vagy a Suz12 közvetlenül hozzájárul a miogén differenciálódáshoz, a Lin28b és Suz12 specifikus gátlását géncsendesítéssel, RNS-interferencia segítségével végeztük (RNSi; 3d, e ábra). Amint az várható volt, a myogén differenciálódási markerek, mint például a Ckm,Myh1 és Myog expressziója a Lin28b és Suz12 géncsendesítés hatására felfelé szabályozott (3f, g ábra).

Mivel a Lin28b egy RNS-kötő fehérje, amely részt vesz a miRNS-ek3637 feldolgozásában, megvizsgáltuk a Lin28b-n keresztüli miR-19 mimikák hatását a miogén miRNS-feldolgozásra. A miR-1, egy fő miogén miRNS szintjét vizsgálták, mivel prekurzorának feldolgozását a Lin28b37 szabályozza. Az érett miR-1 szignifikánsan megemelkedett a miR-199 utánzó kezelés hatására (3h. ábra), ami arra utal, hogy a miR-199-3p képes szabályozni a miR-1 funkcionális expresszióját az elnyomás révén. célpontja Lin28b. Összességében az eredmények azt sugallják, hogy a miR-199-3p részt vesz a miogén differenciálódásban a célgének, a Lin28b és a Suz12 elnyomásán keresztül.

Az izomregeneráció fokozása a miR199#4 által izomsérült egerekben.a cistanche salsa előnyeiMegvizsgáltuk egy miR-199 utánzó (miR199#4) hatásait in vivo izomsérülési modellek segítségével (4a, b ábra). Nyolc hetes C57BL/6J egereket BaClz-vel fecskendeztek be a tibialis anteriorba (TA), hogy izomsérülést okozzanak, és 24 órával később miR19#4-et adtunk a sérült helyekre. Két nappal a miR199#4 beadása után megvizsgáltuk a miogén marker gének expresszióját. A myog expressziója szignifikánsan megnövekedett, és az 1-es myogén differenciálódás (Myod1) és az 5-ös myogén faktor (Myf5) szintén fokozódott a miR199#4 beadásával (4c. ábra). Az adatok összhangban vannak a fent leírt in vitro eredményekkel (2. ábra).

A regenerálódó izmok immunhisztokémiai analízisét 9 nappal a miR199#4 beadása után végeztük. Megvizsgáltuk a regenerálódó izomrostok (miofibrák) keresztmetszeti területeit, melyeket központi magok jellemeznek (4b. ábra). A miR199#4-gyel kezelt regenerálódó izomrostok átlagos keresztmetszete nagyobb volt, mint a nem hangtompító kontroll RNS duplexszel kezelt kontroll izomrostok (nsCont; 4d. ábra), a különbség megközelítette a statisztikai szignifikanciát. Az átlagos keresztmetszeti terület mellett a keresztmetszeti terület méretre osztott hisztogramja a megnagyobbodott izomrostok növekedését mutatta miR199#4 jelenlétében (4e. ábra).

A miR199#4 hipertrófiás hatása az elöregedett izomrostokra. Megvizsgáltuk a miR199#4 hatásait idős (~24 hónapos) egerekre. Idős egerek izom miR-199-3p-értéke szignifikánsan csökkent (5a. ábra), csakúgy, mint a vérkeringésben lévő cf-miR-19-3p, a fiatal egerekhez képest. Idős egerek TA izmainak miR199#4-et adtunk be, majd 2 nappal később a TA izmokat immunhisztokémiai analízissel vizsgáltuk (5b. ábra). A miR199#4-gyel kezelt izomrostok átlagos keresztmetszete szignifikánsan nagyobb volt, mint az nsCont-tal kezelt kontroll izomrostok keresztmetszete (5c. ábra). Ezzel összhangban a méretre osztott hisztogram elemzés a megnagyobbodott izomrostok jelentős növekedését mutatta ki miR199#4 jelenlétében (5d. ábra).

Mivel az idős egerekben a vérkeringésben lévő cf-miR-199-3p lecsökken, a miR199#4-et bevittük idős egerek keringő vérébe a farokürítésen keresztül. A miR19#4 intravénás beadása után megvizsgáltuk és elemeztük a myofibrák keresztmetszeti területét a fent leírtak szerint. Az 5e. ábrán látható eredmények összhangban vannak a miR199#4 idős izomzatba történő helyi adagolásának eredményeivel (5c., d. ábra).

Meg kell jegyezni, hogy különbség van a megnagyobbodott izomrostok tekintetében az izomsérülési modell és az idős egerek között. Központi magok láthatók a regenerálódó izomrostokban (4b. ábra), de ilyen izomrostokat alig lehetett kimutatni a miR199#4-gyel kezelt idős egerekben (5b. ábra). Ez arra utal, hogy a már meglévő izomrostok megnagyobbodhatnak idős egerekben a miR199#4 kezelést követően. Feltételeztük, hogy egy másik, az izomregenerációtól eltérő mechanizmus is szerepet játszhat a myofiber megnagyobbodásában idős egerekben, és javasoltuk az izomsorvadás útvonalának részvételét.cistanche tubulosa adagolás redditAz Atroginl és a MuRFI gének szorosan összefüggenek az izomsorvadással38, és expressziós szintjük szignifikánsan magasabb az elöregedett izmokban, mint a fiatal izmokban (6a. ábra). Megvizsgáltuk az Atroginl és a MuRFI szintjét idős egerek izomzatában a miR199#4 szisztémás beadása után. Az Atroginl és a MuRFI jelentősen csökkent a különböző izmokban a miR19#4 beadásával (6b. ábra), ami arra utal, hogy az izomsorvadás útvonal miR199#4 általi elnyomása a myofiber expanzióját okozhatja idős egerekben.

A MiR199#4 késlelteti az izomerő elvesztését idős egerekben. Érdekes a miR199#4 hatása az idős egerek izomműködésére. A fogásszilárdsági tesztet idős egereken végezték a miR199#4 szisztémás beadása előtt és után. A kísérletet kettős vak módszerrel hajtottuk végre; az RNS-injekciót és a 100 százalékos tapadási tesztet különböző kísérletezők végezték anélkül, hogy megosztották volna az információkat. A (80-hetes) hím C57BL/6 egereken tapadástesztet végeztünk, majd 1 héttel később intravénásan miR199#4-et és nsCont-ot injektáltak beléjük, és ismét fogástesztet kaptak. Az izomerő változása a miR199#4 injekció után a MiR199#4 javítja az mdx egerek izomerejét. Mivel a miR199#4 pozitív hatással van az izmokra, kísérletet végeztünk a miR199#4 beadása hatásának felmérésére mdx egerekben, amely egy jól ismert DMD állatmodell32. Nyolc hetes mdx egereket intravénásan injektáltunk miR199#4-gyel (1,6 mg/kg) kétszer (1 hetes intervallum), és a tapadástesztet 1 héttel az utolsó beadás után végeztük el. A kísérletet kettős vak módszerrel hajtottuk végre, amint az a 7. ábrán látható. Az eredmények (8a. ábra) szignifikáns javulást mutatnak az izomerőben a miR199#4-gyel kezelt mdx egerekben az nsCont-tal kezelt mdx egerekhez képest. Ezenkívül a kreatin-kináz (CK) aktivitásának és a sejtmentes miR-1 jelentős csökkenését figyelték meg a miR199#4-gyel kezelt mdx egerek vérében (8b. és c. ábra), amelyek a betegség lehetséges jelei. javulás.

Gyógyszerszállító reagensként az atelokollagén viszkózus és nehezen kezelhető, és úgy tűnt, hogy az atelokollagénnel kezelt egerek negatív hatásokat szenvedtek el a vivőanyag miatt. Így az atelokollagén alternatíváit kerestük gyógyszer-leadó rendszerünk (DDS) javítására, és a DC-CHOL/DOPE kationos liposzómákat találtuk új DDS-reagensként, amely egyenlő vagy jobb az atelokollagénnel (4. kiegészítő ábra). A miR199#4 gyógyszereloszlása ​​a kationos liposzómákkal azt mutatta, hogy a beadott miR19#4 az izomba került, és következetesen nagy mennyiségben felszívódik a májban (5. kiegészítő ábra). Az izomba juttatott extracelluláris miR199#4 közvetítőként működhet a géncsendesítésben, és hozzájárulhat az izomerő javításában szerepet játszó génszabályozáshoz.

Megkíséreltük azonosítani azokat a biomolekulákat, amelyek a miR199#4 beadását követő javuláshoz kapcsolódnak. A DMD-vel kapcsolatos különféle polipeptideket Western blottal vizsgáltuk, azonban ebben a vizsgálatban nem észleltünk a javulással kapcsolatos külön jeleket (kiegészítő 6. ábra). Ezt a kérdést a következő részben részletesebben tárgyaljuk.

Vita

A biomolekulák minőségileg és mennyiségileg is változnak az öregedéssel--3. Az ilyen változások megragadása és tanulmányozása létfontosságú az öregedés megértéséhez, és feltárhat stratégiákat az idősödő társadalmak problémáinak kezelésére. Azok a parabiózis-vizsgálatok, amelyekben a fiatal és idős állatokat közös érrendszerben egyesítik, fontos betekintést nyújtottak az öregedésbe és a fiatalításba9-l2. Az eredmények határozottan arra utalnak, hogy a fiatal, illetve az idős keringő vérben vannak fiatalító és öregedési tényezők. A korábbi tanulmányok különböző molekulákat jelöltek meg a fiatalítással és az öregedéssel kapcsolatban, de az eredmények ellentmondásosak3.

Fiatal és idős szérummal végzett in vitro sejttenyésztési kísérleteink hasonlóak a parabióziskísérletekhez (lb. ábra), és a keringő vérben találtunk miR-199-3p-t, amely az életkorral változik; a miRNS-ről kimutatták, hogy szignifikánsan csökkent az elöregedett vérben (1. táblázat és la. ábra). Ezenkívül az izom (celluláris) miR-199-3p expressziója jelentősen csökken az idős izmokban a fiatal izmokhoz képest (1. ábra). 5a); így a cf-miR-199-3p a vérben korrelálhat az izom miR-199-3p-vel. A miR-199-3p expressziójának csökkenése az öregedéssel a rhesus makákó csontvelőből származó mezenchimális őssejtekben is megfigyelhető39. Ezért a sejtes miR{10}p expressziója az életkorral összefüggő szabályozás alatt állhat. A miR-19-3p-vel ellentétben a sejtes miogén miRNS-ek, például a miR-1 és a miR-133 expressziója változatlan marad a fiatal és idős izmokban (5a. ábra), de a szint Az extracelluláris miRNS-eik mennyisége a vérben jelentősen csökkent idős egerekben (la ábra). A miR-199-3p és a miogén miRNS-ek (miR-1 és-133) közötti különbség tükrözheti a cf-miRNS feldolgozásában és/vagy a cf-miRNS-ek korfüggő szabályozásában mutatkozó különbséget. . Ennek a különbségnek a tisztázása érdekében a jövőben további vizsgálatokra van szükség.

Korábbi tanulmányok azt sugallták, hogy a miR{0}p különböző sejtfunkciókban és létfontosságú jelenségekben vesz részt a célgénjei elnyomásán keresztül; például a miRNS elősegítheti az endothel csúcssejtek proliferációját és migrációját, és módosíthatja a pubertás kezdetét a megcélzott szemaforin-3A gén40 leszabályozása és a célgének (Cdc42, Map3k2, Map3k4, és Taok1) részt vesz a p38MAPK útvonalban41. A jelen tanulmány azt találta, hogy a miR{11}p részt vesz a miogén differenciálódásban a célgének, a Lin28b és a Suz12 elnyomásán keresztül (3. ábra). A Lin28b egy RNS-kötő fehérje, és gátolja a miRNS-ek, köztük a miR-1 érését, amely egy izomspecifikus miRNS, és elősegíti a miogenezist37. A Lin28b miR-19-3p általi elnyomása az érett miR-1 növekedését okozza (3. ábra), ami lehetővé teheti a miogén differenciálódást.

A Suzl2 a 2. polikombin represszív komplex (PRC2) központi alegysége, amely részt vesz a kromatin42 elnyomásában. A PRC2 génszabályozása részt vesz az őssejtek fenntartásában, az embrionális fejlődésben, a sejtproliferációban és a differenciálódásban, beleértve a miogén differenciálódást is ilyen lókuszokból a differenciált myotubusokban43. Az RNSi által a Suz12 elleni géncsendesítés a miogén génexpresszió fokozódását okozza (3. ábra). A zeste homolog 2 (Ezh2) fehérje, a PRC2 másik mag alegységének fokozójának elnyomása szintén miogén differenciálódást okoz44. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a PRC2 képződésének a mag alegységeinek elnyomása miatti gátlása kiválthatja az izomdifferenciálódás genomi állapotának kialakulását. Így a Suz12 miR-199-3p általi elnyomása miogén differenciálódást indukálhat. Összességében a miR-19-3p fontos szerepet játszhat a miogén differenciálódásban, mivel gátolja a Lin28b-t és a Suzl2-t, amelyek mindegyike részt vesz a mioblasztok differenciálatlan állapotának fenntartásában.

A miR-199-3p miogén differenciálódásra gyakorolt ​​hatását in vivo is kimutatták (4. ábra). Az izomkárosodás az izomregeneráció következtében sejtproliferációt és differenciálódást vált ki. A miR-199-3p-t szállító miR199#4 bejuttatása a sérült helyekre fokozta az izomregenerációt és kiterjesztette a regenerálódó izomrostokat (4. ábra). A miogén génexpresszió következetesen fokozódott a miR199#4 kezelés alatt (4. ábra). Gyakorlati szempontból a miR199#4 hatékony és hasznos lehet a sebészeti kezeléseknél.

Amikor a miR199#4-et idős, vérkeringő miR-199-3p-hiányos egereknek adták be, az egerek izomrostjaik jelentősen megnövekedtek (5. ábra), és az öregedéssel késleltetett izomerő-vesztés (7. ábra). Az idős egerek kitágult izomrostjai különböznek a regenerálódó izomrostoktól, amelyek a miR199#4 jelenlétében megnövekednek; az előbbi a már létező izomrostokból, az utóbbi pedig a neo-miofibrákból (újszülött izomrostokból) származik. Így az izomrost-megnagyobbodásban különböző, egymástól független mechanizmusok léteznek. Tanulmányunk azt sugallja, hogy (i) az előbbi esetben az Atroginl és a MuRFI miR199#4 kezelés általi szuppressziója miatti izomsorvadás gátlása az elöregedett izomrostok megnagyobbodását eredményezi, és (ii) az utóbbi esetben a célgének, a Lin28b elnyomását. és Suz12, a regenerálódó izomrostok megnagyobbodását okozza. Összességében a miR-19-3p által szabályozott különböző (több) gén szerepet játszhat az izomhipertrófiában különböző helyzetekben. Az eredmények azt is sugallják, hogy a miR-199-3p legalább öregedésgátló hatással bír az izomzatra, és hogy a miR-199-3p-t biztosító miR199#4 potenciálisan új RNS-gyógyszer lehet az életkorral összefüggő izombetegségek kezelésére. mint például a szarkopénia.

A miR199#4 izmokra kifejtett nagy hatékonysága alapján miR199#4-et adtunk be mdx egereknek, egy jól ismert DMD-modellnek, és figyelemre méltó eredményeket értünk el: a miR199#4 szisztémás adagolása ~20 százalékkal javította az egerek izomerejét ( 8a. ábra). Az izomerő helyreállításának mechanizmusának megértése érdekében megkíséreltük azonosítani azokat a biomolekulákat, amelyeket javított (vagy befolyásolt) a miR-199-3p. A vér CK és a cf-miR-1 (8b., c. ábra) javulása kivételével azonban nem tudtunk ilyen javulást kimutatni molekuláris szinten. Ez a kimutatási nehézség a komplex sejtpopulációnak köszönhető, amely az mdx egerek regeneráló és széteső izomsejtek keverékéből áll. Még ha a miR199#4 javulást eredményez is, a komplex sejtpopuláció által okozott magas háttérzaj elfedi a javulás bizonyítékát. A probléma megoldásához kiterjedtebb vizsgálatokat kell végezni mdx egerekből származó homogén izomsejt-populáció felhasználásával, vagy különféle szövetekre összpontosítva, beleértve az izmokat is.

Bár a miR199#4 izomerő-visszanyerésének molekuláris mechanizmusa továbbra is ismeretlen, figyelemre méltó a miR19#4 adagja az izomerő javítására. A ~1,6 mg/kg miR199#4 kétszeri beadása javította az izomerőt mdx egerekben. Úgy tűnik, hogy az effektív dózis alacsonyabb, mint az antiszensz oligonukleotidoké a mutáns disztrofin gének in vivo elleni exonátugrására{10}}. Az oka annak, hogy a miR199#4 ilyen alacsonyabb dózisok mellett is képes az izomerőt növelni, az antiszensz oligonukleotidokhoz képest eltérő hatásmechanizmusának köszönhető. A miR19#4 hatásmechanizmusa a katalitikus géncsendesítés. Ezzel szemben az antiszensz oligonukleotidok mechanizmusa a fizikai hibridizáción alapul. Ezért a gyógyszer hatékonyságát mutató megfelelő dózisok különbségei a különböző hatásmechanizmusoknak tudhatók be.

A mechanizmus, amellyel a szervek, szövetek vagy sejtek miRNS-eket bocsátanak ki a keringő vérbe, még nem teljesen ismert, és az ilyen miRNS-ek felszabadulásának korral járó szabályozása sem tisztázott. A jelen tanulmány kimutatta, hogy a miogén cf-miR-NA-k, beleértve a cf-miR-199-3p-t is, keringenek a vérrel az érrendszerben, és az öregedéssel csökkennek. Az ilyen cf-miRNS-ek jelen lehetnek az exoszómákban, azaz exoszomális miRNS-ek.

A miogén miRNS-ek részt vesznek a miogén differenciálódásban, az izomregenerációban és az izom homeosztázis fenntartásában33. Korábbi tanulmányok arról számoltak be, hogy a miogén miRNS-ek, mint például a miR-1 és miR-133, megfigyelték, hogy a testmozgás hatására megnőtt a vérben4849. E jelentések alapján az aktív fiatal egerek több miogén miRNS-t bocsáthatnak ki a vérbe, mint az idős, lassan mozgó egerek, és az ilyen extracelluláris miRNS-ek, beleértve a cf-miR-199-3p-t, autokrin hatáson keresztül hozzájárulhatnak az izomháztartás fenntartásához fiatal egerekben. . Az extracelluláris (exoszomális) miRNS szintje azonban nem mindig korrelál a sejtes miRNS-szinttel, és különbségeket figyeltek meg a miogén miRNS-ekben és a miR{7}}p-ben fiatal és idős egerek között (la. és 5a. ábra), valamint a folyamat során. miogén differenciálódás (kiegészítő 2a ábra). Így egy másik lehetőségként elképzelhető, hogy az exoszómaképződés életkorral és differenciálódással kapcsolatos szabályozása befolyásolhatja a cf-miRNS termelést; konkrétan eltérések lehetnek az exoszómaképződésben a fiatal és idős egerek között. Ezekkel a hipotézisekkel összefüggésben további vizsgálatokra van szükség a miogén miRNS-ek életkorral összefüggő vérbe való felszabadulásának tisztázására.

Eltekintve a felszabadulási mechanizmustól, amikor a cf-miR-199-3p-t tartalmazó fiatal miogén cf-miRNS-ek parabiózissal az elöregedett vérkeringési rendszerbe áramlanak egy fiatal érrendszerből, a cf-miRNS-ek izomaktivációt és izomgátlást válthatnak ki. atrófia az idős oldalon; ezt az elképzelést támasztják alá idős egerekből származó bizonyítékok, akik intravénásan injektáltak miR19#4-et ebben a vizsgálatban (5-7. ábra). A vérben lévő Cf-miRNS-ek összefüggésbe hozhatók az életkorral összefüggő homeosztatikus funkcióval, és megváltozott homeosztázist jelenthetnek. Amikor az ilyen cf-miRNS-ek ektopikusan jelen vannak, például amikor a fiatal vérben lévő cf-miRNS-ek átkerülnek az elöregedett vérkeringési rendszerbe, egyes cf-miRNS-ek fiatalító hatást mutathatnak az idős oldalon, azaz öregedésgátló hatást fejthetnek ki. Ezzel szemben az idős vérben lévő cf-miRNS-ek az öregedés következtében megváltozott homeosztázist jelenthetnek. Amikor az ilyen cf-miRNS-ek átkerülnek a fiatal vérkeringési rendszerbe, egyes cf-miRNS-ek öregedéssel összefüggő állapotromlást válthatnak ki, és idő előtti öregedést okozhatnak a fiatal oldalon. Az idős vérben jelentősen megnövekedett Cf-miRNS-ek olyan jelöltek, amelyek részletes mechanikai elemzést igényelnek az öregedés megértéséhez és megelőzéséhez.

Összefoglalva, jelenlegi tanulmányunk új betekintést nyújtott a cf-miRNS-ekbe, mint az életkorral összefüggő molekulákba, és új kutatási irányt tárt fel az öregedés és a sejtmentes funkcionális RNS-ek, köztük a cf-miRNS-ek közötti kapcsolat tisztázására.

Ez a cikk a COMMUNICATIONS BIOLOGY|(2021) 4:427|https://doi.org/10.1038/s42003-021-01952-2|www.nature.com/commsbio