A mortalin/glükóz által szabályozott protein 75 elősegíti a gyomorrák ciszplatin-rezisztenciáját

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Absztrakt

A platina gyógyszeres kezelés az egyik legdominánsabb kemoterápiás stratégia a gyomorrákban (GC) szenvedő betegeknél. A terápiás hatás azonban kevésbé kielégítő, nagyrészt a platina gyógyszerekkel szembeni megszerzett rezisztencia miatt. Ezért a mögöttes mechanizmusok jobb megértése nagyban javíthatja a GC terápiás hatékonyságát. Ebben a tanulmányban a glükóz-szabályozott protein 75 (GRP75) kemorezisztenciával kapcsolatos funkcióit/mechanizmusait és klinikai jelentőségét kívántuk megvizsgálni GC-ben. Itt adataink azt mutatták, hogy az SGC7901 sejtekhez képest a GRP75 expressziója jelentősen magasabb volt a ciszplatin-rezisztenciában (sejtek (SGC7901 *). A GRP75 leütése megszüntette a mitokondriális membránpotenciál (MP) fenntartását, és gátolta a nukleáris faktor eritroidot{{ 10}}kapcsolódó 2-es faktor (NRF2), foszfatidil-inozitol 3 kináz/protein kináz B (Pl3K/AKT), hipoxia-indukálható 1a faktor (HIF-1a) és c-myc, amelyek blokkolták a Ezek a folyamatok gyengítették az antioxidációs/apoptózis képességeket, és megváltoztatták az SGC7901" sejtek metabolikus átprogramozását, ami ezeknek a sejteknek a ciszplatinnal szembeni újraszenzibilizációjához vezetett. Az SGC7901 sejtekben a GRP75 túlzott expressziója azonban az ellenkező hatást váltotta ki. Egy xenograft modell Platina kemoterápiában és metaanalízisben részesülő GC-betegeknél a magas GRP75-szint pozitív összefüggést mutatott az agresszív jellemzőkkel és a rossz prognózissal, beleértve, de nem kizárólagosan a gastr-t. bélrákok, és független előrejelzője volt a teljes túlélésnek. Vizsgálatunk összességében azt mutatta, hogy a GRP75 szerepet játszik a GC ciszplatin-rezisztenciájában, és hogy a GRP75 potenciális terápiás célpont lehet a platinarezisztens sejtekben a gyógyszerre adott válasz helyreállításában, valamint hasznos additív prognosztikai eszköz a GC-betegek klinikai kezelésének iránymutatásában.

További információért kattintson ide

Bevezetés

A gyomorrák (GC) volt az első vezető incidencia és a második vezető halálozási arány az emésztőrendszeri rákos megbetegedések terén Kínában. Az előrehaladott GC jelenlegi kezelése a műtéti műtét volt szisztémás kemoterápiával kombinálva, de a hosszú távú túlélési arány nem volt kielégítő a műtét utáni magas recidíva miatt2. A klinikai gyakorlatban a platina gyógyszerek voltak az egyik első vonalbeli szerek a fejlett betegeknél. GC kemoterápia 3. A gyógyszerekkel szembeni szerzett rezisztencia azonban mindig többszörös platinaalapú kezelési ciklus után jelentkezett, és rossz prognózist jelez.cisztanchEzért sürgősen elengedhetetlen volt a lehetséges mechanizmusok megvilágítása és az új terápiás stratégiák azonosítása a platina gyógyszerekkel szembeni rezisztencia leküzdésére GC betegekben.

A Cistanche öregedésgátló hatású

A glükóz-szabályozott fehérje 75 (GRP75) a stressz által indukálható molekuláris chaperon volt, amely a hősokk-fehérje családba tartozott4. A GRP75 túlzott expressziója szorosan összefügg a tumor progressziójával különböző humán rákos megbetegedések esetén5-7. Itt egy metaanalízis feltárásával azt találtuk, hogy a GRP75 magas szintje számos emésztőrendszeri rák esetében (kolorektális rák, cholangiocarcinoma és hasnyálmirigyrák) szignifikánsan rossz prognózist jelez. A gyógyszerrezisztencia tekintetében a GRP75 gátlása megfordította a ciszplatin és doxorubicin rezisztenciát hepatocelluláris karcinómában és petefészekrákban. A GRP75 klasszikusan megkötötte a p53-at a citoplazmában, ami a p53 funkció inaktiválásához és az app-tózis elnyomásához vezetett10. Egy korábbi tanulmány szerint a GRP75 a pozitív daganatok rosszabb prognózisúak voltak, mint a GRP75 negatív tumorok normál p53 funkciójú GC-ben. Azonban a p53 volt az egyik leggyakrabban mutált gén a GC-ben (a betegek több mint 50 százalékát érinti)l2-15. Feltételeztük tehát, hogy hogy a p53 aktivitás klasszikus elnyomása mellett a GRP75 részt vehet a platina gyógyszerekkel szembeni rezisztencia kiváltásában/fenntartásában GC-ben ap53-független módon.

Ebben a vizsgálatban a GRP75 magasabb expressziója hozzájárult a ciszplatin rezisztenciához az SGC7901 sejtekben és egy xenograft modellben. Mechanikailag a GRP75 indukálta/fenntartotta a ciszplatin rezisztenciát az antioxidációs/apoptotikus képességek és az anyagcsere-átprogramozó tulajdonságok szabályozásán keresztül.cistanche AusztráliaGC betegekben a GRP75 túlzott expressziója hozzájárult az agresszív tulajdonságokhoz és a rossz prognózishoz. Eredményeink azt mutatták, hogy a GRP75 elősegítette a ciszplatin rezisztenciát GC-ben, és biomarker lehet a platina gyógyszeres kezelésre adott válasz előrejelzésében.cistanche előnyeiA GRP75 megcélzása új megértést adhat a GC szisztémás kemoterápiáról.

Eredmények

A GRP75 hatása a ciszplatin-rezisztenciára GC-sejtek életképességére vonatkozó vizsgálatokat alkalmaztunk az SGC7901~ sejtek rezisztenciájának igazolására, az SGC7901 és SGC7901CR sejtek ciszplatinjának Ipsos-értéke (uM): 5,518 vs. 72,46 (ábra). A KM-Plotter adatbázisok alapján a GRP75 fokozott expressziója rossz prognózist jelez (1B. ábra). Ezenkívül jelentősen megnövekedett a GRP75 expressziója az SGC7901CR sejtekben a szülői SGC7901 sejtekhez képest (1C. ábra), ami arra utal, hogy a GRP75 hozzájárulhat a ciszplatin-rezisztenciához. Ennek a hipotézisnek az igazolására az SGC7901~ sejteket scramble- vagy GRP75 siRNS-sel transzfektáltuk, és a ciszplatin IC50 értéke (uM) a scrambled- vagy GRP75 siRNS-sel transzfektált SGC7901CK sejtekre: 50,83 vs.20,.{29}} 1D). Ellentétben,

A GRP75 túlzott expressziója a GRP75 plazmidok SGC7901 sejtekbe történő transzfektálásával azt mutatta, hogy a scramble- vagy GRP75 plazmidokkal transzfektált SGC7901 sejtek ciszplatinjának IC50 értéke 3,825 vs. 6,98 (1E. ábra). Összességében ezek az eredmények azt mutatták, hogy a GRP75 döntő szerepet játszott a ciszplatin-rezisztencia fenntartásában/indukálásában GC-ben, de a mechanizmusok további vizsgálat tárgyát képezték.

A GRP75 mögött meghúzódó lehetséges mechanizmusok ciszplatin-rezisztenciát okoztak

A GEO-tól letöltöttük a GSE122130 (SGC7901CR vs. SGC7901) és GSE14209 (szövetek, ciszplatin-rezisztens vs. ciszplatinérzékeny) microarray adatkészleteket, majd elvégeztük a GO-Biological folyamatot és a KEGG-Pathway felső dúsításon, DAVID10 elemzésen és analízisen alapuló KEGG-Pathway-t. az eredményeket a 2A-D. Az SGC7901C* sejtek és az SGC7901 sejtek közötti biológiai folyamatok lényeges különbségei közé tartozik az oxidáció-redukció, az apoptotikus folyamat (2A. ábra), a KEGG-Pathway dúsítási analízis azt találta, hogy a DEG-készletek szorosan korrelálnak a metabolikus útvonalakkal, valamint a foszfatidil-inozitol-3-kináz B-protein kináz/protein. (PI3K/AKT) útvonal (2B. ábra). A gyógyszerre adott válasz a ciszplatin-rezisztens és a ciszplatin-érzékeny tumorszövetek közötti biológiai folyamatok lényeges különbségei közé tartozott, és a metabolikus útvonal is a KEGG-Pathway dúsítási analízis központi láncszeme volt (2C, D ábra). Emellett egy 60 fehérjéből álló, a GRP75-tel szignifikánsan kölcsönhatásba lépő fehérjéből álló hálózatot építettek ki a String adatbázis segítségével, majd a KEGG-Pathway elemzése megállapította, hogy a metabolikus útvonalak fontos szerepet játszanak a GRP75 és interaktorai között (2E. ábra). Ezen eredmények alapján feltételeztük, hogy az antioxidáció/apoptózis és a metabolikus átprogramozás elősegítheti a GC túlélését és növekedését, ami ciszplatin-rezisztenciához vezet. A GRP75 szabályozásban való részvételének mechanizmusai azonban további tanulmányozást igényelnek (2F. ábra).

A GRP75 hatása az antioxidációra és az apoptózis elleni küzdelemre Itt az intracelluláris ROS szint megemelkedett az SGC7901CR sejtekben szülői társaihoz képest (3A. ábra), ami arra utal, hogy az SGC7901Ck sejtek viszonylag magasabb oxidatív stressznek voltak kitéve. Egy korábbi tanulmány feltárta, hogy a GRP75 részt vett az MMP stabilizálásában, amely a ROS generálás egyik fontos forrása. Itt a GRP75 leütése megszüntette az MMP fenntartását a ciszplatin által indukált SGC7901CK sejtekben, és a GRP75 túlzott expressziója az SGC7901 sejtekben az ellenkező hatást váltotta ki (3B. ábra).cistanche koleszterinEzután validáltuk a kapcsolatot a GRP75 és az antioxidáció és az apoptózis elleni küzdelem között. Amint a 3C. ábrán látható, a GRP75 leütése csökkentette a nukleáris faktor eritroid -2-kapcsolódó 2. faktor (NRF2) és downstream célgénjei (HO-1 és NQO-1) szintjét az SGC7901-ben. ~ sejtekben, és a GRP75 túlzott expressziója ellentétes hatást mutatott az SGC7901 sejtekben. Ezenkívül a GRP75 vagy az NRF2 leütése az SGC7901CR sejtekben tovább fokozta a ciszplatin által kiváltott intracelluláris ROS-generációkat, az apoptózist (3D. ábra) és a kaszpáz-3 aktivitást (kiegészítő S1. ábra). Ezzel szemben a GRP75 túlzott expressziója az SGC7901 sejtekben jelentősen gyengítette a ciszplatin által kiváltott ROS generációkat, a sejt apoptózist (3E. ábra) és a kaszpáz-3 aktivitást (kiegészítő S1 ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a GRP75 fenntartott/indukált ciszplatin-rezisztenciája a GC-sejtekben az antioxidáció és az apoptózis elleni indukáláson keresztül valósulhat meg.

A GRP75 hatása a metabolikus átprogramozásra Ezután tovább vizsgáltuk, hogy a GRP75 miként váltotta ki a metabolikus átprogramozás változását. Egyre több bizonyíték támasztja alá, hogy a tumorsejtek anyagcseréje nem egyetlen anyagcsereútvonal abnormális változása, hanem a teljes sejtanyagcsere-hálózat átprogramozása17. Számos klasszikus onkogén vagy jelátviteli útvonal közvetlenül vagy közvetve részt vett a metabolikus átprogramozásban, mint például a PI3K/AKT, a hipoxia-indukálható la faktor (HIF-la), a c-myc és így tovább"'819. Ezért ellenőriztük, hogy a GRP75 A 4A. ábrán látható, hogy az SGC7901CR sejtekben megemelkedett p-AKT, HIF-la és c-myc szintet észleltünk a szülői SGC7901 sejtekhez képest. A GRP75 csökkentette a ciszplatin által kiváltott p-AKT, HIF-la és c-Myc fehérjeszinteket, valamint a glikolízishez kapcsolódó downstream célpontjaikat (HK2: hexokináz 2; PDK1: piruvát-dehidrogenáz kináz l; és LDHA: laktát-dehidrogenáz A lánc). Éppen ellenkezőleg, a GRP75 túlzott expressziója az SGC7901 sejtekben az ellenkező hatást mutatta (4B, C ábra). Ezenkívül a GRP75 vagy AKT leütése SGC7901CR sejtekben a ciszplatin által kiváltott glükózfelvétel és a sejtek életképességének/növekedésének jelentős csökkenését mutatta; a GRP75 túlzott expressziója az SGC7901 sejtekben megnövelte a ciszplatin által okozott glükózfelvételi képességet és a sejtek életképességét/növekedését. 4D-F). Összességében ezek az adatok azt mutatták, hogy a GRP75 fenntartott/indukált ciszplatin-rezisztenciája a GC sejtekben a p-AKT, HIF-la és c-myc által közvetített metabolikus átprogramozásban való részvétel révén lehet.

Az in vitro adatok megerősítése xenograft modellben Ezt követően megvizsgáltuk a GRP75 lehetséges klinikai jelentőségét in vivo. A xenograft adatok azt mutatták, hogy a ciszplatin önmagában történő kezelés vagy a GRP75 leállítása önmagában gátolhatja a tumor növekedését; azonban a ciszplatin kezelés és a GRP75 knockdown együttes alkalmazása jelentősen megkönnyítette a tumornövekedés ciszplatin által kiváltott gátlását (5A. ábra). Ezenkívül az IHC és qPCR vizsgálatok azt mutatták, hogy a ciszplatin plusz GRP75 siRNS szignifikánsan csökkentette a Ki67, GRP75, NRF2, p-AKT expresszióját és a downstream targetek expresszióját a ciszplatin önmagában végzett kezeléséhez képest, de növelte az apoptózist (a TUNEL festéssel meghatározva, 5B. ábra). , C). Összességében ezek az eredmények azt mutatták, hogy az antioxidációs/anti-apoptózis képességek szabályozásán és a metabolikus átprogramozáson keresztül a GRP75 stimulálta az in vivo túlélést és növekedést, ami viszont a GC ciszplatin-rezisztenciájához vezetett.

A GRP75, mint jellegzetes rákpromotáló faktor azonosítása és a GRP75 klinikai jelentősége GC-ben

Ezt követően értékeltük a GRP75 expresszióját a GC minták egymást követő metszeteiben. Amint a 6A. ábrán látható, a szomszédos, nem daganatos gyomorszövetekkel összehasonlítva a GRP75 expressziójának jelentős emelkedése volt megfigyelhető a GC szövetekben. A GRP75 túlzott expresszióját GC szövetekben mutattuk ki az IHC-intenzitás pontszámával (6B. ábra). A GRP75 erősebb festődését is megfigyelték a rosszindulatú daganatok TNM osztályozási stádiumának növekedésével (6C., D. ábra). Ezután ezt a 116 GC-mintát két csoportra osztottuk ("GRP75 alacsony" vs. GRP75 magas", az IHC-intenzitás szerint, 6E. ábra). A tumorok keresztirányú átmérője a "GRP75 high" csoportban szignifikánsan nagyobb volt, mint a "GRP75 low" csoportban (6F. ábra). Tovább validáltuk a GRP75 klinikai prognózisát GC-ben. A Kaplan-Meier túlélési elemzés azt is kimutatta, hogy a „GRP75 magas” csoportban a GC-betegek általános túlélése rosszabb volt, mint a „GRP75 alacsony” csoportban (6G. ábra).

A többváltozós elemzés kimutatta, hogy a GRP75 független előrejelzője a teljes túlélésnek (1. táblázat).cistanche deserticola mellékhatásai,Összefoglalva, ezek az eredmények azt sugallják, hogy a GRP75 jellegzetes szerepet játszott a GC progressziójában, a ciszplatin rezisztenciában és a rossz prognózisban. A GRP75 magas szintjének metaanalízise a prognózissal Az irodalom keresésének és kiválasztásának folyamatábrája és a metaanalízis az S2 kiegészítő ábrán láthatók. A HR-érték kiszámításához és elemzéséhez random-effektus modellt és fix hatású modellt használtunk, mindkettő azt mutatta, hogy a magas GRP75 szint szignifikánsan összefügg a rossz betegek kimenetelével. Az összesített HR 1,91 (95 százalékos CI 1,62-2,25), heterogenitással (I'=0.0 százalék ,p =0.559) (7A. ábra). Ezt követően alcsoportanalízist végeztünk, amely kimutatta, hogy a GRP75 expressziós szintje gasztrointesztinális rákban (összesített HR 1,99,95 százalék CI 1,64-2,43) szignifikáns összefüggésben áll a rossz túlélési prognózissal. Természetesen hasonló eredményeket találtak más daganatokban is (az összesített HR 1,74,95 százalékos CI 1,29-2,33) (7B. ábra). Mindkét

A Begg-féle tölcsér diagramot és az Egger-tesztet használtuk a bevont tanulmányok lehetséges publikációs torzításának felmérésére. A GRP75 és az OS közötti összefüggés elemzése során a Begg-teszt és az Egger-teszt p-értéke 0.076, illetve 0,024 volt (7C. és D. ábra). Az Egger-teszt azonban nagyobb érzékenységgel értékeli a publikációs torzítást. Így eredményeink hitelesebbé tételéhez a trim és fill módszert alkalmaztuk. Amint a 7E. ábra mutatja, a fix hatású modellben a korrigált HR 1,785 volt (95 százalékos CI 1,530-2,081, p<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">

Vita

Ebben a vizsgálatban az egyik első vonalbeli kemoterápiás szert használtuk GC-ben szenvedő betegeknél, platina gyógyszerek. Klasszikusan a platina gyógyszerek kovalensen kötődhetnek a guaninhoz a DNS-láncon, és így blokkolják a DNS2 replikációját és transzkripcióját. A gyógyszerrezisztencia és a nemkívánatos mellékhatások miatt azonban sürgősen elengedhetetlen volt új terápiás stratégiák azonosítása a GC-betegek rezisztenciájának visszafordítására. Ezenkívül a GC-s betegek gyógyszerrezisztenciát fejlesztettek ki több ciszplatin-kúra után, és eredményeink azt mutatták, hogy az SGC7901~ sejtek jelentős rezisztenciát mutattak a ciszplatinnal szemben, összehasonlítva az SGC7901 sejtekkel.

A GRP75 (mortalin/mot-2/HSPA9) kulcsszerepet játszott az emberi rákos megbetegedések kialakulásának és progressziójának szabályozásában-7. A közelmúltban világossá vált, hogy a GRP75-nek a kemoterápiás rezisztenciában is kritikus szerepe van. A GRP75 és a ciszplatin rezisztencia molekuláris mechanizmusáról azonban ritkán számoltak be. Vizsgálatunk kimutatta, hogy a GRP75 elősegítette az antioxidációs/apoptózisos képességeket és megváltoztatta az anyagcsere-átprogramozást, ami ciszplatin rezisztenciához vezetett a GC sejtekben. Azt is megállapítottuk, hogy a GRP75 felfelé szabályozott Az SGC7901~ sejtekben és a betegek szövetmintáiban, és összefüggést mutatott a gyógyszerrezisztenciával, a túlélés elősegítésével, a növekedéssel és a rossz eredményekkel. Eközben a többváltozós elemzés kimutatta, hogy a GRP75 független előrejelzője a teljes túlélésnek. Emellett a metaanalízis azt mutatta, hogy a GRP75 magas szintje rossz prognózist mutatott, beleértve, de nem kizárólagosan a GC-t, ami nagyon összhangban volt kutatásunkkal. A fenti eredmények mindegyike igazolta, hogy a GRP75 célzása várhatóan új megközelítéssé válik a ciszplatin rezisztencia visszafordítására és a GC-betegek prognózisának javítására.

Fiziológiás körülmények között a sejtek elkerülhetetlenül ki voltak téve a külső tényezők és az intracelluláris aerob anyagcsere hatásának. Kétélű fegyverként a megfelelő ROS fontos jelmolekulák voltak, amelyek szabályozzák a sejtek normális működését, míg a túlzott ROS apoptózishoz vezetett. Ezért a szervezetben létezett egy precíz antioxidáns szabályozási rendszer a redox egyensúly és az apoptotikus eljárások fenntartására 20. A fiziológiás körülményektől eltérően azonban a daganatok ROS szintje általában szignifikánsan magasabb volt, mint az azonos szöveti eredetű normál kontrollokban, ami meghatározta egy speciális szövet létezését. antioxidáns rendszer a daganatsejtekben, különösen a gyógyszerrezisztens tumorsejtekben27-29. Eredményeink megerősítették, hogy az SGC7901CR sejtek viszonylag magasabb ROS-szintet mutattak az SGC7901 sejtekhez képest, és hogy a GRP75 megnövelte az antioxidáció/apoptózis képességét. A daganatsejteknek hosszú ideje volt metabolikus rendellenességei. Otto Warburg már az 1930-as években felfedezte, hogy a daganatsejtek a glikolízist részesítik előnyben. Még megfelelő oxigéntartalmú körülmények között is a tumorsejtek továbbra is magas glikolízist tartottak fenn az ATP-termeléshez. Ezt a kóros anyagcsere-mintát "Warburg-effektusnak"3031 nevezték el. A Warburg-hatás által kiváltott metabolikus változásokat nemrégiben metabolikus átprogramozásnak nevezték, és ezeknek a változásoknak a tanulmányozása mélyebb megértést biztosított a GC-sejtek metabolizmusáról. Kimutatták, hogy a GC-sejtek és a normál sejtek metabolikus különbségeket mutatnak nemcsak a glükóz metabolizmusában, hanem a lipidek és aminosavak metabolizmusában is³2-35. Ebben a kutatásban azt találtuk, hogy a glükóz-anyagcsere változásai az egyik legfontosabb tényező. összekapcsolja a sejtnövekedést, ami végül GC ciszplatin rezisztenciához vezet.

Mint említettük, a klasszikus onkogének és jelátviteli útvonalak, mint a PI3K/AKT, HIF-la és c-myc közvetlenül vagy közvetve részt vettek a metabolikus átprogramozásban. A PI3K/AKT útvonal aktiválása tumorsejtekben számos metabolikus aktivitást fokozott. Először is, lehetővé tette a sejtek számára a glükóz, aminosavak és egyéb tápanyagok felvételét. Másodszor, az AKT növelte a glikolízist és a laktáttermelést a génexpresszióra és az enzimaktivitásra gyakorolt ​​hatása révén, és elegendő volt War-burg-hatás kiváltására rákos sejtekben. Harmadszor, ennek az útnak az aktiválása fokozta a makromolekulák bioszintézisét, és serkenti a lipogén gének expresszióját és a lipidszintézist7. Továbbá a GRP75-aktivált AKT és az extracelluláris szignál által szabályozott protein kináz 1 és 2 gátolta a Bax konformációs változásokat és az apoptózist. tejsav termelését és szekrécióját, glikogén tárolást, glutamin katabolizmust³, és elősegíti a trigliceridek felhalmozódását lipidcseppekben³. A közelmúltban világossá vált, hogy a GRP75 specifikusan kötődhet a HIF-la-hoz, és megcélozza a külső mitokondriális membránt, ami a VDAC1 és HK2, amelyek megakadályozták az apoptózist”. A C-myc számos módon közvetítheti a metabolikus átprogramozást, és a c-myc által közvetített metabolikus átprogramozást nagyrészt a mitokondriumok befolyásolásával érték el. Egyrészt a c-myc elősegítette a glikolízist is azáltal, hogy közvetlenül szabályozta a glikolitikus enzimek, köztük az LDHA, HK2 és PDK11938 expresszióját. Másrészt a c-myc által aktivált enzimek, amelyek a glutamin metabolizmusában transzkripción keresztül részt vesznek, elősegítették a glikolitikus enzimek hasznosítását. glutamin a mitokondriumok által a tumorsejtekben. Ezt a hatást "glutaminolízisnek" nevezik. Ezenkívül a GRP75-túlexpresszió csökkentette a Cyclin-B1-et, és felerősíti a Cyclin-D1-et és a c-myc-et, hogy elősegítse a petefészekráksejtek növekedését*. Jelen eredményeink alapján új megértést adtunk a GC ciszplatin rezisztenciáról a GRP75-ön keresztül, mint a tumor metabolikus átprogramozási hálózatainak szabályozásában.

Következtetések

Összefoglalva, kimutattuk, hogy a GRP75 túlzott expressziója elősegítheti a túlélést/növekedést GC-sejtekben az antioxidáció/apoptózis és a metabolikus átprogramozási hálózatok szabályozásával, ezáltal ciszplatin-rezisztenciát indukálva.

Anyagok és metódusok

Sejtek, reagensek és tenyésztési körülmények

GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >99.{1}} százalékos tisztaságú), a Sigma-Aldrich-től (Sanghaj, Kína) vásároltuk. A sejteket RPMI-1640tápközegben (Gibco, Grand Island, NY, USA), 10% magzati szarvasmarha szérummal (FBS), 100 U/ml penicillinnel, 100 ug/ml sztreptomicinnel (Gibco) egészítettük ki, és inkubáltuk. 5 százalékos CO2-ban 37 fokon. A ciszplatin-rezisztencia fenotípus fenntartása érdekében az SGC7901CR sejteket ciszplatint (5 μM) tartalmazó tápközegben inkubáltuk.

Xenograftok és kezelések

Ezt a vizsgálatot a Nanjing Orvostudományi Egyetem Intézményi Állatgondozói és Állathasználati Bizottsága hagyta jóvá, és az állatokat humánusan és a szenvedés enyhítésére tekintettel kezelték. A BALB/c csupasz egereket az SLRC Laboratory Animal Center-től (Sanghaj, Kína) szereztük be, és hagyományosan a korábban leírtak szerint tartották*l. A xenograft vizsgálathoz 2×10 fokos SGC7901CK sejteket 100 ul matrigelben injektáltunk szubkután az egerek oldalába 5 hétig. A GRP75 GC ciszplatin rezisztenciájára gyakorolt ​​hatásának meghatározására intratumorális és intraperitoneális injekciós assay-t végeztünk. Röviden, az egereket véletlenszerűen 4 csoportra osztották (5 egér csoportonként): (1) MOCK, (2) GRP75KD, (3) MOCK (ciszplatin) és (4) GRP75 KD (ciszplatin). 100 ul siRNS-t (si-Con vagy si-GRP75, 100 nM) adtunk intratumorális injekcióként 3 naponta. A ciszplatin (5 mg/kg) kezelésben részesült csoportok hetente háromszor intraperitoneális injekciót kaptak, a többi csoportot azonos térfogatú sóoldattal perfundáltuk. A daganatokat hetente mértük, és térfogatukat a következő képlettel számítottuk ki: V=Y (szélesség2 hossz). 5 hét elteltével az egereket leöltük, és a tumorszöveteket eltávolítottuk további vizsgálat céljából.

Betegek és szövetminták

Ezt a vizsgálatot a Nanjing Orvosi Egyetem Második Társult Kórházának Orvosi Etikai Bizottsága és a Nanjing Orvosi Egyetem Changzhou No. 2. Kórháza hagyta jóvá, és a résztvevők írásos beleegyezését kérték minden betegtől. A klinikai patológiai adatokat az S1 kiegészítő táblázat tartalmazza. A szöveti microarray-t a Zhuoli Biotechnology Co.Ltd (Sanghaj, Kína) állította össze, ahogy azt korábban leírtuk*

Sejttranszfekció

A transzfekcióhoz a kódolt és a pcDNA-3.1-GRP75-Flag-ot a General Biotech (Sanghaj, Kína) szintetizálta; míg az siRNS-eket az S2 kiegészítő táblázat tartalmazza. A sejteket átmenetileg transzfektáltuk lipofectamine 3000 reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, USA), a gyártó protokollja szerint. Röviden, a sejteket 6-lyuklemezekre szélesztettük 1 × 10 fokos sejtsűrűséggel RPMI 1640 tápközegben, amely 10% FBS-t tartalmazott antibiotikumok nélkül. 24 órás inkubálás után a sejteket átmenetileg 5 ng/ml scrambled vagy GRP75-Flag, vagy 20 nM si-Con vagy si-GRP75-tel transzfektáltuk 12 órán át. A transzfekció után a sejteket 10 százalékos FBS-sel kiegészített friss tápközegben tenyésztettük további 24 órán át, mielőtt más kísérletekhez felhasználtuk volna.

Kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció (qPCR) A használt primereket az S3 kiegészítő táblázat tartalmazza. A teljes RNS izolálása, az RNS cDNS-vé történő transzkripciója és az Applied Biosystems 7300HT géppel végzett qRT-PCR végrehajtása mind a korábbi 2. vizsgálatunk szerint történt. Az -aktint amplifikáltuk a cDNS integritásának biztosítása és az expresszió normalizálása érdekében. Az egyes gének expressziójában bekövetkező változásokat összehasonlító küszöbciklus (Ct) módszerrel számítottuk ki a 2-(4ACt) képlet alapján.

Ez a cikk Dai et al. Cell Death Discovery (2021) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w