A többkomponensű, primer-boost Chlamydia Trachomatis elleni vakcinázási rendszerek antitest- és T-sejt-válaszokat indukálnak, és felgyorsítják a fertőzések kiürülését egy nem humán főemlős modellben Ⅱ

Anyagok és metódusok

Vakcina antigének és adjuvánsok

Különböző vakcina antigéneket és adjuvánsokat használtak ebben a vizsgálatban: a MOMP (11) alapú CTH522 vakcina antigént intramuszkuláris úton (IM) adtuk be CAF01 adjuvánssal (42) vagy alumínium-hidroxid (AlOH) adjuvánssal, vagy intranazális úton ( IN) adjuváns nélkül. A plazmid DNS-vakcinát, a pcDNA3.{5}}MOMP-t a MOMP konszenzusos klónozásával állítottuk elő a pcDNA3.1 plazmidvektorba (14), és intradermálisan (ID) adtuk be elektroporációval (EP) a hátoldalon. A MOMP-t (HuAd5-MOMP) expresszáló rekombináns humán adenovírus 5-ös szerotípusú (rHuAd5) vakcinát úgy állítottuk elő, hogy a konszenzus MOMP-t (AAC45154.1) homológ módon rekombináltuk egy E1 és E2 deletált HuAd5 pAL1112 plazmidba, és intramuszkulárisan beadtuk (1 vektoron keresztül) . Módosított vaccinia Ankara-MOMP vakcina gyártmányaa konszenzus MOMP rekombinációja(AAC45154.1) a p3186 plazmidba és az attenuált MVA vektor (14), majd beadjukintramuszkuláris úton.

Kattintson ide a Cistanche gyulladáscsökkentő beszerzéséhez

C. trachomatis D szerovariáns törzs

A Chlamydia trachomatis D szerovariáns (Ct SvD; UW{{0}}/Cx, ATCC® VR-885™) az American Type Culture Collection-től (ATCC, Manassas, VA) származott, és HeLa{ban szaporítottuk. {2}} sejteket gyűjtöttük össze és tisztítottuk Caldwell és mtsai. (43). A C. trachomatis SvD törzset -80 fokon 0,2 M szacharózban, 20 mM nátrium-foszfátban (pH 7,4) és 5 mM glutaminsavban (SPG) tároltuk, és meghatároztuk a zárványképző egységeket (IFU) a koncentrációt. HeLa-229 sejtek és McCoy sejtek.

Nem humán főemlősök

Harminc, 3-5 kg ​​tömegű cynomolgus makákót (Macaca fascicularis) vontak be az IDMIT ("Infectious Disease Models and Innovative Therapies") NHP 3. biobiztonsági szintű (ABSL3) létesítményében végzett vizsgálatba a CEA "Commissariat à l'Energie Atomique"-ben. Fontenay-aux-Roses, Franciaország; akkreditációs szám: #D92- 032-02). A protokollokat a "Comité d'Ethique en Expé rimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) intézményi etikai bizottság hagyta jóvá A14-026 számú nyilatkozattal. A tanulmányt a „Kutatási, Innovációs és Oktatási Minisztérium” engedélyezte, APAFIS#720-201505281237660 regisztrációs számmal. A vizsgálat előtt minden állat SIV, SHIV, STLV (majom Tlymphotropic vírus), herpes B vírus, filovírus, SRV-1, SRV-2 tekintetében negatív volt, és megerősítették, hogy szeronegatívak Chlamydia fertőzésre. Minden kísérleti eljárást az állatgondozásra vonatkozó európai irányelvek szerint végeztek ("Journal Officiel de l'Union Europé enne", 2010/63/EU irányelv, 2010. szeptember 22.).

Oltási protokollok

A 30 makákót véletlenszerűen 6 csoportra osztották, mindegyikben 5 állattal. Az 1. ábra részletesen szemlélteti a 6 csoport különböző oltási prime-boost rendszereit. Valamennyi oltás során a makákókat ketamin-klórhidráttal (10 mg/ttkg intramuszkulárisan) szedálták. A CTH522-t (85 µg állatonként) intramuszkulárisan (IM) adtuk be CAF{{20}}1 adjuvánssal (625 µg/125 µg) vagy AlOH adjuvánssal (0,425 mg) Az IM immunizálást 0,6 ml térfogatban végeztük az állat jobb combjában (M. quadriceps). A CTH522 intranazális (IN) immunizálást (30 µg állatonként) 1 ml-es fecskendőhöz csatlakoztatott Vaxinator eszközzel végeztük, két egymást követő 0,25 ml-es beadással, mindkét orrlyukban egy-egy. A DNS-MOMP vakcinát intradermális (ID) úton, elektroporációval (EP) adták be a hát bőrébe. 6 ismételt 0,1 ml-es térfogatot fecskendeztünk be ID-n (összesen 1 mg), majd EP-t a Nepagen™ rendszerrel (beállítások: 6 négyzet alakú, 10 ms-os impulzus 90 ms-os intervallumokkal 110 V-on, (300- 700mA)). . A hAd5-MOMP vakcinát IM-ben adták be állatonként 1011 vírusrészecske 1 ml-ben. Az MVA-MOMP vakcinát intramuszkulárisan adtuk be állatonként 4*108 PFU dózisban 0,5 ml térfogatban**. A naiv csoport nem kapott semmilyen védőoltást, és kontrollcsoportnak számított.

Minta kollekció

Valamennyi mintavételi eljárás során a makákókat ketamin-klórhidráttal (10 mg/ttkg IM) szedáltuk. Vért vettünk femorális vénapunkcióval a 0., 2., 4., 6., 8., 10., 16., 18., 20., 22., 24. héten. Az antitestek kimutatására szolgáló cervicovaginális folyadékot Weck-Cel®spears (Medtronic Ophthalmics, Jacksonville, FL) segítségével vettük. , USA) a 4., 8., 16., 18., 20., 22. és 24. héten. A chlamydia terhelés kimutatására szolgáló cervicovaginális mintákat szokásos lapos tamponnal vettük (Mast Diagnostic - ref.: 552C/10). A hüvely-nyaki nyálkahártyával való érintkezést követően a tampont egy UTM-RT táptalajt (Mast Diagnostic – ref.: 330C/6) tartalmazó fiolába helyeztük, és jégen tartottuk.

Vaginális fertőzés fertőzés 5*107 IFU-val C. trachomatis SvD

Az állatokat ketamin-klórhidráttal (10 mg/kg IM) nyugtattuk, felemelt csípőjükkel hasfekvésbe helyeztük, és 1 ml oltóanyagot traumatikusan közvetlenül a hüvely nyálkahártyájára vittünk a vagino-cervicalis átmenetnél 1 ml-es fecskendővel. Minden állatnak 5*107 IFU-t adtunk. Az állatot az oltás után rövid ideig felemelt csípővel hasi fekvésben hagytuk.

Enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat

CTH522specifikus antitestekszérumban és tamponmintákban indirekt ELISA-val detektáltuk. A Maxisorp® lemezeket (NUNC A/S, Roskilde, Dánia) CTH522-vel (0,5 µg/ml) vontuk be egy éjszakán át 4 °C-on. Az IgG és IgA izotípusokat a nem humán főemlős IgG elleni specifikus HRP-vel konjugált antitestekkel mutatták ki (43R-IG020HRP, Fitzgerald, Acton, MA, USA, 1:75).{10 }}) és IgA (43C-CB1631, Fitzgerald, USA, 1:50.{16}}). A reakciókat TMB PLUS szubsztráttal (KemEnTec, Taastrup, Dánia) tettük láthatóvá, és 0,5 M kénsavval állítottuk le. A lemezeket ELISA leolvasóval olvastuk le 450 nm-en, 650 nm-es korrekcióval. Egy pozitív kontrollt (egy korábbi vizsgálatból származó szérum) használtunk belső standardként a lemezek közötti eltérések korrigálására. Mindkét lemezen negatív kontrollként szubsztrát nélkül két lyukat futtattunk. Az antitest titereket a legmagasabb hígítás reciprokaként számítottuk ki, ahol az optikai sűrűség (OD) érték magasabb, mint a cut-off. A határértéket a 0. napi mintaátlag plusz 2*SD alapján határoztuk meg.

Peptid tömb és elemzés

A CTH522 peptid tömb 14 aminosavval átfedő immobilizált 15 tagú peptidek három példányával készült, amelyeket funkcionalizált üveglemezekre nyomtattunk, és szérummintákkal inkubáltuk a JPT Peptide Technologies, Berlin. Röviden, a tömböt a 24. héten gyűjtött szérummintákkal inkubáltuk, és az IgG peptid komplexeket biotinilált kecske majomellenes IgG és Alexa Fluor® 647 Streptavidin alkalmazásával tettük láthatóvá. A tárgylemezeket nagy felbontású szkennerrel szkenneltük 635 nm-en, és az adatokat tetszőleges fluoreszcencia egységként adtuk meg. A háromszoros értékek átlagát határoztuk meg, ha a variációs együttható nagyobb volt, mint 0,5, akkor csak a 2 legközelebbi értéket használtam. A maximális intenzitású jel (65 535) 10 százalékát használták levágásként egypozitív válasz, és az e küszöb alatti átlagos jelekhez a küszöbérték felének megfelelő értéket rendeltünk (3277).

In vitro neutralizációs vizsgálat

Az in vitro neutralizációs vizsgálatot a vakcina által kiváltott szérum antitestek HaK-sejtek Chlamydia fertőzésének in vitro semlegesítésére irányuló képességének tesztelésére végeztük. A vizsgálat alapvetően a korábban leírt protokollt követte (44). Először az egyes állatokból származó szérummintákat inkubáltuk 56 fokon 30 percig, hogy inaktiváljuk a komplementet. A chlamydia törzsállományt (SvD, SvE és SvF) összekevertük, és mindegyik vakcinázott állatból származó inaktivált szérum sorozathígításaival inkubáltuk 30 percig, majd egy HaK-sejtek egyrétegű rétegére oltottuk 96-lyukú, lapos fenekű lemezeken. másolatok. 30 órás inkubációt követően a sejteket és zárványokat poliklonális nyúl anti-Ct043 szérummal és fluoreszcenciával jelölt másodlagos antitesttel (Alexa Flour 488, kecske anti-nyúl IgG, A11008, Life Technologies) 1:5000 hígításban rögzítettük és láthatóvá tettük. . A zárványok számlálása manuálisan történt 20 látómezőben, 40-szeres nagyítás mellett (Olympus IX71 fordított fluoreszcens mikroszkóp). A semlegesítést az IFU-k átlagos számának százalékos csökkenéseként számítottuk ki a kontrollcsoport (naiv) állatokból származó szérumkészletéhez képest.

Intracelluláris PBMC citokinfestés és társcitometria

A PBMC-ket izoláltuk, és ({{0}} x 106) újraszuszpendáltuk 150 µl teljes tápközegben, amely 0,2 µg CD28 és CD49b kostimuláló antitestet tartalmazott. A stimulációt 96 lyukban/lemezben végeztük, 2 µM mindegyik peptidkészletből vagy SEB-ből (pozitív kontrollként), vagy önmagában táptalajból (negatív kontrollként). Brefeldin A-t adtunk minden egyes lyukhoz 10 µg/ml végső koncentrációban, és a lemezt 37 °C-on, 5% CO2-tartalom mellett inkubáltuk egy éjszakán át. A sejteket ezután mostuk, életképességi festékkel (ibolya, fluoreszcens reaktív festék, Invitrogen) megfestettük, fixáltuk, és BD Cytofifix/Cytoperm reagenssel permeabilizáltuk. A permeabilizált sejtmintákat ezután -80 fokon tároltuk a festési eljárás előtt. Az antitestfestést egyetlen lépésben végeztük a permeabilizálást követően. Az összes használtantitestek30 perces, sötétben, jégen végzett inkubálás után a sejteket BD Perm/Wash pufferben mostuk. A sejteket közvetlenül a festési eljárás után LSR II-vel (BD) számoltuk, és az adatok elemzéséhez FlowJo szoftvert használtunk.

1. TÁBLÁZAT Az immunsejt markerek és intracelluláris citokinek festésére használt antitestek

Hüvelyi chlamydia DNS kimutatása kvalitatív PCR-rel

Az Abbott RealTime CT/NG assay (ABBOTT, Rungis, Franciaország) egy in vitro polimeráz láncreakciós (PCR) vizsgálat a plazmid DNS közvetlen, kvalitatív kimutatására CT (C. trachomatis) és NG (N. gonorrhoeae) genomokhoz. . A nukleinsavat UTM (univerzális szállítóközeg) mintákból vontuk ki M2000SP-n, és az amplifikációt M2000SP-n végeztük a gyártó utasításai szerint. Az eredményeket ciklusküszöbként (Ct) fejeztük ki.

Statisztikai analízis

Minden statisztikai adatot a GraphPad Prism szoftverrel (8.1.2-es verzió) végeztünk. A nem normál eloszlású adatokat nem paraméteres tesztekkel elemeztük; Kruskal–Wallis teszt és Dunn többszörös összehasonlító tesztje a csoportok közötti különbség szignifikancia meghatározására. A PCR-negatív állatok százalékos arányát mutató görbéket egy log-rank (Mantel-Cox) statisztikai teszttel hasonlítottuk össze. Az összehasonlításokat statisztikailag szignifikánsnak tekintettük, ha a P érték < 0.05 (P < 0.05). A további szignifikanciaszinteket *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 csillagok jelzik.

Az adatok rendelkezésre állásáról szóló nyilatkozat

A tanulmányban bemutatott eredeti hozzájárulásokat a cikk/kiegészítő anyag tartalmazza. További kérdésekkel fordulhat a megfelelő szerzőhöz.

Etikai nyilatkozat

Az állatkísérletet a "Comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) felülvizsgálta és jóváhagyta az A14-026 számú nyilatkozat alatt. A tanulmányt a "Kutatási, Innovációs és Oktatási Minisztérium" engedélyezte, APAFIS#720-201505281237660 regisztrációs számmal.

Szerzői hozzájárulások

Kigondolt és tervezett kísérletek: JD, FF, EL, PA, RG, RS. Végzett kísérletek: VC, DD, BD, SL, CD, CJ, ND-B, CB, BB, AT. Gyártott vakcinák és antigénkonstrukciók: IR, PM, AO. Az adatok elemzése: JD, EL, FF, IR, HJ. A dolgozatot készítette és szerkesztette: JD, EL, FF. A felsorolt ​​társszerzők mindegyike jelentős mértékben hozzájárult a munkához a tervezés és a koncepció, és/vagy az adatok megszerzése, elemzése és értelmezése révén. Minden szerző hozzájárult a cikkhez, és jóváhagyta a benyújtott változatot.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük a Fondation Dormeur, Vaduz adományát a Viral Evolution and Transmission Unit számára a projekthez kapcsolódó laboratóriumi műszerekért.

Összeférhetetlenség FF, IR, PA és AWO társfeltalálók a chlamydia elleni vakcinákról szóló szabadalmi bejelentésben [WO2014146663A1]. Minden jogot a Statens Serum Institut, egy dán non-profit kormányzati intézethez ruháztak át. A többi szerző kijelenti, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális összeférhetetlenségnek tekinthetők.

A kiadó megjegyzése Minden, ebben a cikkben megfogalmazott állítás kizárólag a szerzők állításaira vonatkozik, és nem feltétlenül jelenti a kapcsolt szervezeteik, illetve a kiadó, a szerkesztők és a lektorok állításait. A jelen cikkben értékelt termékekre vagy a gyártó által megfogalmazott állításokra a kiadó nem vállal garanciát és nem hagy jóvá.

Hivatkozások

1. Newman L, Rowley J, Vander Hoorn S, Wijesooriya NS, Unemo M, Low N és munkatársai. Négy gyógyítható szexuális úton terjedő fertőzés prevalenciájának és incidenciájának globális becslése 2012-ben szisztematikus áttekintés és globális jelentések alapján. PLoS One (2015) 10(12):e0143304. doi: 10.1371/journal.pone.0143304

2. Longbottom D, Coulter LJ. Állati klamidiózisok és zoonózisos következmények. J Comp Pathol (2003) 128(4):217–44. doi: 10.1053/jcpa.2002.0629

3. Haggerty CL, Gottlieb SL, Taylor BD, Low N, Xu F, Ness RB. Chlamydia trachomatis genitális fertőzés utáni következmények kockázata nőknél. J Infect Dis (2010) 201 Suppl 2:S134–55. doi: 10.1086/652395

4. Dodet B. A hatékony STI-vakcinák kifejlesztésének jelenlegi akadályai, kihívásai és lehetőségei: vakcinagyártók, biotechnológiai cégek és finanszírozó ügynökségek nézőpontja. Vaccine (2014) 32(14):1624–9. doi: 10.1016/ j.vaccine.2013.08.032

5. Brunham RC, Kuo CC, Cles L, Holmes KK. A gazdaszervezet immunválaszának összefüggése a Chlamydia trachomatis kvantitatív gyógyulásával az emberi endocervixből. Infect Immun (1983), 39(3):1491–4. doi: 10.1128/iai.39.3.{10}}.1983

6. Cotter TW, Meng Q, Shen ZL, Zhang YX, Su H, Caldwell HD. A fő külső membránfehérje-specifikus immunglobulin a (IgA) és IgG monoklonális antitestek védelmi hatékonysága a chlamydia trachomatis genitális traktus fertőzésének egérmodelljében. Infect Immun (1995) 63(12):4704–4714. doi: 10.1128/iai.63.12.{11}}.1995

7. Johansson M, Schon K, Ward M, Lycke N. Knockout egereken végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy a chlamydia elleni védelemhez IFN-gammát termelő TH1-sejtekre van szükség: igaz ez az emberekre? Scand J Immunol (1997), 46(6):546–52. doi: 10.1046/j.{11}}.1997.d01-167.x

8. Gondek DC, Olive AJ, Stary G, Starnbach MN. A CD4 plusz T-sejtek szükségesek és elegendőek ahhoz, hogy védelmet nyújtsanak a chlamydia trachomatis fertőzés ellen az egér felső nemi traktusában. J Immunol (2012), 189(5):2441–9. doi: 10.4049/ jimmunol.1103032

9. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Wijburg OL, Beagley KW. Az intra- és extra-epiteliális szekréciós IgA értékelése chlamydia fertőzésekben. Immunology (2014), 143(4):520–30. doi: 10.1111/imm.12317

10. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Blumberg RS, Beagley KW. Eltérő eredmények az intracelluláris és extracelluláris chlamydia antigéneket célzó IgG transzcitózisát követően. Immunol Cell Biol (2014) 92(5):417-426. doi: 10.1038/icb.2013.110

11. Olsen AW, Follmann F, Erneholm K, Rosenkrands I, Andersen P. Védelem a Chlamydia trachomatis fertőzés és a felső genitális traktus kóros elváltozásai ellen vakcina által támogatott neutralizáló antitestek által, amelyek a fő külső membránfehérje VD4-ére irányulnak. J Infect Dis (2015) 212(6):978–89. doi: 10.1093/infdis/jiv137

12. Nguyen N, Guleed S, Olsen AW, Follmann F, Christensen JP, Dietrich J. A Th1/Th17 T-sejt-szövet-rezidens immunitás növeli a védelmet, de nem szükséges a chlamydia trachomatis által okozott genitális fertőzés elleni vakcina stratégiában. Front Immunol (2021) 12:790463. doi: 10.3389/fifimmu.2021.790463

Kérdezz többet:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plusz 86 15292862950

Cistanche-kiegészítés hozzáadása a kosárhoz:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop