A miricetin javítja az ökör LDL-indukálta HUVEC-ek apoptózisát és gyulladását az LncRNA GAS5-ön keresztül, javítva a MiR 29a expresszióját 3p

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Az ateroszklerózis (AS) a szív- és érrendszeri betegségek jelentős morbiditási és mortalitási oka, amelyet kezdetben az endothel diszfunkció vált ki, és az aterogén lipoprotein komponensek beáramlása jellemez. Ez a legtöbb halálos betegség fő lehetséges tényezője, mint például a szívinfarktus, az instabil angina, a hirtelen szívhalál és a stroke. Bár az etiológia érintett, még mindig széles körben elfogadott az a károsodási válasz elmélet, amely szerint a vaszkuláris endoteliális sejt (EC) sérülése az AS kiváltó mechanizmusa3,4.Oxidatívaz alacsony sűrűségű lipoproteinről (ox-LDL) kimutatták, hogy részt vesz az érelmeszesedés kialakulásában, és indukált vaszkuláris endothel sérülése az atherosclerosis egyik korai patogenezise. Eddig az AS fejlődésének ellenőrzése továbbra is nagy kihívást jelent, mivel az AS molekuláris mechanizmusai nem teljesen ismertek. Ezért az ox-LDL által kiváltott EK-sérülés csökkentése és mechanizmusának további magyarázata potenciális stratégia lehet az AS megelőzésében és kezelésében. A miricetin (Myr) egy gyakori természetes flavonoid, amely számos gyümölcsben, zöldségben és gyógynövényben megtalálható. A Myr jelentős szerepet játszik bizonyos betegségek kezelésében és megelőzésében, beleértve a diabéteszes csontritkulást, a hepatocelluláris karcinómát8, az alkoholos májat³,és bőrrákl9,erős vaskelátképző képességének köszönhetően,antioxidáns és szabad gyökfogó tevékenység. Nemrég aszívvédőMyr szerepe felkeltette a kutatói közösség figyelmét. Myr védő hatást mutatott a lipopoliszacharid (LPS) által indukáltgyulladásos szívizomsérülés, szívhipertrófiaés ischaemia/reperfúzió (I/R) által kiváltott szívizom sérülés3. A Myr lipidanyagcserére és érelmeszesedésre gyakorolt ​​hatása azonban nem teljesen ismert.

További információért kattintson ide

Anyagok és metódusok

Sejtkultúra, ox-LDL-indukált sérülésmodell és proliferáció.

A Kínai Tudományos Akadémia Sejtbankjából (Sanghaj, Kína) származó humán köldökvéna endothel sejteket (HUVEC) tenyésztettük 10 százalékos FBS-sel kiegészített DMEM-ben.normoxikus37 fokos körülmények között. A HUVEC-ket különböző koncentrációkkal kezeltük（50,100,200 ug/ml）az ökör-LDL（Union-Bio Technology,Kína）és 24 órán belül összegyűjtöttük további mérésekhez. A gyártó utasításai szerint a sejtek proliferációs sebességét CCK8 assay-vel (Solarbio, Kína) mérték.

A Cistanche javíthatja az immunitást

Apoptózis áramlási citometriás analízise PI és annexin V kettős festéssel.

A sejtapoptózist áramlási citometriával értékeltük ki PI és annexin V kettős festődésű apoptózis vizsgálati kit (Solarbio, Kína) segítségével, a gyártó utasításait követve.

Reaktív oxigénfajták (ROS) mérése. Az intracelluláris ROS-t a ROS Assay Kit segítségével határoztuk meg（Beyotime,Kína）. Röviden,A sejteket 10 μM DCHF-DA-val 20 percig inkubáltuk, majd a fluoreszcencia intenzitását mikrolemez-leolvasóval mértük.

RNS immunprecipitációs (RIP) vizsgálat.

A RIP-t a Magna RIP Kit (Millipore, USA) segítségével végeztük, a gyártó protokollját követve18. Röviden, a HUVEC sejteket összegyűjtöttük és teljes RIP lízispufferben lizáltuk. A teljes sejtfehérje-kivonatot ezután humán anti-AGO2 antitesttel vagy negatív kontroll normál egér IgG-vel konjugált mágneses gyöngyöket tartalmazó RIP pufferrel inkubáltuk. A kinyert RNS-t ezután qRT-PCR-rel detektáltuk.

RNS fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) vizsgálat. A GAS5 szekvenciára és a miR-29a-3p-re vonatkozó specifikus próbákat a RiboBio tervezte és szintetizálta. A FISH Kit(RiboBio) segítségével detektálták a próbajeleket a gyártó utasításai szerint. A sejtmagokat DAPI-val festették meg.

Kettős luciferáz riporter vizsgálat. Kettős luciferáz riporter vizsgálatot alkalmaztunk a GAS5 és a miR{3}}a-3p promoter régió közötti kölcsönhatás kimutatására.

A kötőhelyek (WT-GAS5 és MUT-GAS5) vad típusú és mutációs szekvenciáit megterveztük és szintetizáltuk. A HUVEC sejteket WT(Mut)GAS5 vektorral és miR-NC-vel vagy miR{7}}a-3p-vel kombinálva transzfektáltuk Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen) alkalmazásával. 48 órás transzfekció után Dual-Luciferase riporter vizsgálati rendszert (Promega) használtunk a luciferáz vizsgálat elvégzésére.

A VCAM-1, IL-6 és MCP-1 meghatározása.

A felülúszó monocita kemoattraktáns fehérje-1(MCP-1), az interleukin-6 (IL-6) és az 1-es vaszkuláris sejtadhéziós molekula (VCAM{{6}) szintjei }) ELISA készlettel határozták meg. IL-6 ELISA Kit (ab178013), MCP-1 ELISA kit (ab179886) és VCAM-1 ELISA kit (ab223591) a gyártó előírásainak megfelelően utasítás.

Valós idejű kvantitatív PCR (gRT-PCR).

A teljes RNS-t Trizol reagenssel (Takara Bio Inc., Japán) izoláltuk）a gyártó protokollja szerint. A cDNS-t a teljes RNS-ből hoztuk létre（2 ug）cDNS Reverse Transcription Kittel (Applied Biosystems, USA), és SYBR-alapú valós idejű PCR-t hajtottunk végre a teljes mRNS-transzkriptumok kimutatására egy Applied Biosystems(ABI)7300 gyors valós idejű PCR rendszeren. A primer szekvenciákat az alábbiakban soroltuk fel.

Western blot vizsgálat.

A Bax, Bcl-2, kaszpáz3, CD31, SM22a, p-p65, p65, p-IkBa, IkBa és TLR4 fehérje expresszióját Western blottal mértük. A HUVEC sejtekből (25 ug) izolált fehérjemintákat SDS-PAGE segítségével rezolválták, majd polivinilidén-fluorid (PVDF) membránra (Millipore, USA) vitték át GAPDH-val (#2118, 1:5000, Cell Signaling), Bax. (#2772S,1:1000, Cell Signaling), Bcl-2 (#15071S,1:1000, Cell Signaling),kaszpáz3(#9662S,1:1000, Cell Signaling), CD31 (ab9498,1:1000 , Abcam), SM22a (ab14106,1:1000,Abcam),p-p65 (10745-1-AP 1:1000, Proteintech), p65 (66535-1-Ig,1:1000,Protein-tech), p-IkBa(10268-1-AP,1:1000, Proteintech),IkBa(66418-1-Ig,1:1000, Proteintech) és TLR4(66350-1-Ig, 1:1000, Proteintech) antitest ezt követi a megfelelő másodlagos antitest. Minden Western-blotot legalább háromszor megismételtünk. Végül a fehérje expresszióját fokozott kemilumineszcenciás (ECL) rendszerrel tettük láthatóvá.

Immunfluoreszcens vizsgálat.

A tárgylemezeken növesztett sejteket fixáltuk, permeabilizáltuk, blokkoltuk, és egy éjszakán át immunfestettük CD31 (ab9498, 1:200, Abcam) és SM22a (ab14106, 1:200, Abcam) antitestekkel. Mosás után a specifikus második FITC-vel jelölt IgG antitesteket folyamatosan inkubáltuk a sejtekkel. Végül mikroszkóp alatt (Olympus, Japán) készültek a képek megfelelő nagyítással.

Statisztikai elemzés. Az összes eredményt az átlag ± az átlag standard hibájaként mutatjuk be (SEM). A statisztikailag szignifikáns eredményeket egyutas ANOVA-val, majd a Student-Newman-Keuls(SNK)q teszttel határoztuk meg. Egy p-érték<0.05 was="" considered="" to="" be="">

Eredmények

A miricetin gyengíti az ox-LDL által kiváltott apoptózist és a ROS-t a HUVEC-ekben.

Először is, a 100 ug/ml ox-LDL 24 órás inkubálása a sejtek életképességének jelentős dózisfüggő csökkenéséhez vezetett. Az l uM Myr-rel végzett 2 órás előkezelésnek nem volt jelentős hatása a sejtek életképességére. azonban,A 2,5 és 5 μM Myr szignifikánsan csökkentette a sejtek életképességét (1A és B ábra). Ezenkívül észrevettük, hogy az ox-LDL által kiváltott ROS fokozódását a HUVEC-ekben csökkentette a Myr (1C. ábra). Megvizsgáltuk a Myr apoptózisra gyakorolt ​​hatását is. Ezenkívül az áramlási citometria és az apoptózissal kapcsolatos fehérje eredmények azt is feltárták, hogy a 100 ug/ml ox-LDL-indukált HUVEC apoptózis drámai módon dózisfüggően fordított MYR-előkezelt sejtek (1D és E ábra).

A miricetin gátolja a gyulladásos választ és az EndMT-t az ox-LDL-indukált HUVEC sejtekben. Az immunfluoreszcens festés azt mutatta, hogy a HUVEC-ek ox-LDL-lel történő inkubálása csökkenti a CD31 endoteliális marker expresszióját, és növelte az SM22a mezenchimális marker expresszióját, jelezve, hogy az ox-LDL állapot váltja ki az EndMT-t. De ezeket a hatásokat a MYR enyhíti. A Western blot következetesen azt mutatta, hogy a Myr gyengítette az ox-LDL által indukált HUVEC-ekben az SM22a fehérje emelkedett szintjét (2A és B ábra). Ox-LDL jelenlétében az IL-6, MCP{{ mRNS szintjei 11}}, a VCAM{12}} nyilvánvalóan felfelé szabályozott volt a HUVEC-ekben, míg a Myr-kezelés megfordította ezeket az aberráns változásokat (2C. ábra). Hasonló eredményeket az ELISA is megerősített (2D. ábra).

A GAS5 túlzott expressziója gyengíti a miricetin védőhatását az ox-LDL által közvetített HUVEC iniur ellen.

GRT-PCR-rel detektáltuk továbbá a GAS5 expresszióját HUVEC-ben. Amint a 3A. ábrán látható, a GAS5 szignifikánsan magasabb szintje volt megfigyelhető az ox-LDL csoportban, mint a kontrollban. Ezzel szemben a GAS5 mRNS szintje a Myr-rel kezelt csoportban dózisfüggő módon csökkent. Ezek az adatok azt mutatták, hogy a GAS5 szerepet játszhat a Myr endotélsejtekre gyakorolt ​​hatásában. Annak érdekében, hogy megértsük azokat a mechanizmusokat, amelyek révén a GAS5 szerepet játszhat a Myr védő hatásában, pcDNA-GAS5-öt alkalmaztunk a GAS5 expressziójának túlzott expressziójára HUVEC-ben. A GAS5 expresszióját fokozta a pcDNA-GAS5, amelyet kezdetben a Myr csökkentett az ox-LDL-indukált HUVEC-ekben (3B. ábra). További kísérletek kimutatták, hogy a HUVEC sejtek életképessége GAS5 túlzott expresszióval szignifikánsan csökkent, és az apoptózis jelentősen megnőtt a Myr kezelés hatására (3C és D ábra). Ezenkívül a GAS5 túlzott expressziója az ox-LDL-kezelt HUVEC-ekben magasabb ROS-tartalmat mutatott a megfelelő kontrollhoz képest (3E. ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a GAS5 expressziójának felszabályozása gyengíti a Myr védőhatását az ox-LDL által közvetített HUVEC sérülésekkel szemben.

A miR-29a-3p a GAS5 célpontja a HUVEC-ben.

A cél GAS5-öt a RegRNA 2.0 és a star-Base segítségével azonosították, a keresési eredmények a 4A. ábrán láthatók. Ezen miRNS-ek közül a miR-29a-3p volt a legjelentősebb csökkenés az ox-LDL által közvetített HUVEC sérülésben (4B. ábra). Bioinformatikai elemzéseket végeztünk a GAS5 és a miR-29a-3p közötti kötőrégiók előrejelzésére (4C. ábra). Ennek a bioinformatikai előrejelzésnek az igazolására a kettős luciferáz riportergén vizsgálatok azt mutatták, hogy a GAS5-WI alacsonyabb luciferáz aktivitást mutatott, mint a megfelelő MUT csoport, ami megerősíti a GAS5 és a miR-29a-3p kötődését. (4D. ábra). Mindeközben az Ago2 RIP-vel dúsított GAS5 szintje magasabb volt a miR-29a-3p-vel transzfektált sejtekben, mint a miR-NC csoportban (4E. ábra). Eközben a HUVECsejtek FISH-analízise azt mutatta, hogy a GAS5 a miR-29a-3p-vel együtt lokalizálódott, főleg a sejtmagban (4F. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a GAS5 a miR-29a-3p.

A miR-29a-3p utánzók megmentették a GAS5 hatásait a Myricetinnel kezelt ox-LDL-indukált HUVEC-ben.

Amint az 5A. ábrán látható, a miR-29a-3p expressziója jelentősen megnőtt az ox-LDL plusz Myr plusz pcDNA-GAS5 plusz miR-29a-3 p utánzó csoport az ox-LDL plusz Myr plusz pcDNA-GAS5 plusz mimika kontrollcsoporttal összehasonlítva (5A. ábra). Ezenkívül a felszabályozott GAS5 szignifikánsan növelte a Myr-rel kezelt ox-LDL-indukált HUVEC-k életképességét, míg a pcDNA-GAS5andmiR-29a-3p HUVEC-ekbe történő kotranszfekciója megszüntette ezeket a hatásokat (5B. ábra). Ezenkívül a ROS termelés és az apoptózis az ox-LDL-ben indukálta a Myr-rel kezelt HUVEC-ket a GAS5 túlzott expressziója után, míg a miR-29a-3p utánzók semlegesítették ezeket a hatásokat (5C és D ábra).

Az sh-GAS5 vagy a miR-29a-3p utánzók felgyorsíthatják a Myricetin védő szerepét az ox-LDL-indukált HUVEC-sejtekben.

Annak kiderítésére, hogy a GAS5 és a miR-29a-3p részt vesz-e a Myr által közvetített szabályozó mechanizmusban, a HUVEC-eket NC-vel transzfektáltuk, sh-GAS5 utánzó kontroll, miR-29a{{7} }p utánozza. A GAS5 expressziója szignifikánsan csökkent az sh-GAS5 csoportban az NC csoporthoz képest (6A. ábra). A transzfekciót követően az ox-LDL plusz Myr növelte az életképességet az ox-LDL csoporthoz képest, és a GAS5 gátlása vagy a felszabályozott miR-29a-3p növelte az ox-LDL-indukált HUVEC-ek életképességét. Myr (6B. ábra). Ezenkívül Myr visszafogta az ox-LDL által okozott sejtapoptózist, amelyet később az sh-GAS5 és a miR-29a-3p utánzatok módosítottak (6C. ábra). Ezenkívül a CD31 és az SM22a fehérjeszintje megemelkedett

A miricetin inaktiválta a TLR4/NF-KB jelátviteli útvonalat ox-LDL-lel kezelt HUVEC-ben a GAS5 leszabályozásával vagy a miR-29a-3p felszabályozásával. A TLR4/NF-KB jelátviteli útvonal szorosan részt vesz az AS folyamatában. Annak feltárása érdekében, hogy a Myr elnyomta-e a TLR4/NF-B jelátviteli útvonalat, a TLR4-et és számos kulcsfontosságú downstream fehérjét, például a p-p65, p65, p-IkBa, IkBa és TLR4 azonosítottuk HUVEC sejtekben Western blot segítségével. elemzés. A 6. ábra azt mutatja, hogy a Myr csökkentette a p-p65, p-IkBa és TLR4 expresszióját az ox-LDL csoporthoz képest, míg a p-p65,p-IkBa fehérjeszintjét. és a TLR4 csökkent az ox-LDL plusz Myr plusz sh-GAS5 és ox-LDL plusz Myr plus miR-29a-3p utánzó csoportokban az ox-LDL plusz Myr csoporthoz képest (7. ábra). . Összességében ezek az eredmények arra utalnak, hogy a GAS5/miR-29a-3p/TLR4/NF-KB útvonal lehet az egyik mögöttes mechanizmus, amelyen keresztül Myr csökkentette a HUVEC sejtgyulladást és az EndMT-t. Vita

Az AS egy tartós gyulladásos állapot, amelyet az alacsony sűrűségű lipoproteineknek az artéria falában történő lerakódása és felhalmozódása indít el19. Az alap- és tudományos kutatások terén elért óriási előrelépés ellenére továbbra is a vezető halálokok közé tartozik a világon2. Ebben a tanulmányban feltártuk a Myr molekuláris mechanizmusát a HUVEC-k ox-LDL-indukálta károsodására, feltárva az lncRNS GAS5 döntő szerepét ebben az eseményben. Eredményeink azt sugallják, hogy a Myr szabályozza a HUVEC-sejtek életképességét, a ROS-t, az apoptózist, a gyulladást és az EndMT-t a GAS5/miR-29a-3p/TLR4/NF-KB útvonalon keresztül, tisztázva a Myr új mechanizmusát. AS elleni védelem.

Az ox-LDL-ről kimutatták, hogy fokozott ROS-generációt indukál, ami kritikus szerepet játszik az AS progressziójában. Jelentős bizonyítékok arra utalnak, hogy a megnövekedett oxidatív stressz kiemelkedő szerepet játszik a vaszkuláris endoteliális diszfunkció patogenezisében, valamint az endothelsejtek EndMT-je, a gyulladás és az apoptózis. A korai érelmeszesedés szimulálására ox-LDL-stimulált HUVEC-ket használtunk, és a HUVEC-ek gyulladásos válaszreakciója és EndMT-je fokozódott, a Myr pedig szignifikánsan gátolta a gyulladásos választ és az EndMT az ox-LDL-lel stimulált HUVEC-ekre. A Myrről ismert, hogy antioxidatív citoprotektív hatást fejt ki különböző sejtekben, beleértve a HUVEC sejtvonalat21. Egy korábbi tanulmány megállapította, hogy a Myr proproliferatív és anti-apoptotikus hatást fejtett ki az LPS által kiváltott kardiomiociták H9c2 sejtkárosodásában2. Ebben a kutatásban megvizsgáltuk a Myr eredményét az ox-LDL-indukált ateroszklerotikus sejtváltozaton. Eredményeink azt sugallták, hogy az 5 μM Myr előkezelés jelentősen megfordíthatja az ox-LDL által kiváltott sejtek életképességének csökkenését a HUVEC-ekben. Eredményeink azt mutatták, hogy az ox-LDL terápia a CD31, SM22a és gyulladásos citokinek (IL-6, MCP-1, VCAM-1) szabályozásán keresztül hirdetheti a HUVEC-k gyulladását és EndMT-jét. Myr előkezeléssel megfordítható. Számos elem bizonyította, hogy a gyulladás és az EndMT kíséri az érelmeszesedést23. Egy korábbi tanulmány megállapította, hogy a VCAM{22}} és ICAM-1 expressziójának gátlását az érelmeszesedés elleni alapvető stratégiaként ismerték fel24. Ezenkívül a vakcina elnyomta az ox-LDL-indukálta endoteliális EndMT-t a CD31 endothel marker és az SM22a25 mezenchimális marker felfelé szabályozása révén. Eredményeink alapvetően megegyeznek ezekkel a kutatásokkal.

A GAS5 expressziója mind humán, mind állati modellekben erősen expresszálódott26,27. Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy a GAS5 felfelé és a miR-29a-3p alulszabályozott volt az ox-LDL által kiváltott HUVEC sérülésekben. . A Myr-kezelés visszafordíthatja ezeket a hatásokat. Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy az Mvr gátolta a HMGB1, TLR4 és MyD88 expresszióját a neuronokban, és helyreállította az NF-KB és MAPK jelutak aktiválása által okozott neuronális károsodást és gyulladást*8. Ebben a vizsgálatban az lncRNS GAS5 felszabályozását. és a miR-29a-3p lecsökkent szabályozása a sejtapoptózis, a gyulladás és az EndMT, valamint a TLR4/NF-KB jelátviteli útvonal aktivitásának csökkenéséhez vezetett. Eredményeink szerint a Myr csökkenti a p-p65,p-IkBa és a TLR4 p-p65,p-IkBa-t és a TLR4-et HUVEC-ben azáltal, hogy szabályozza a GAS5/miR-29a-3p-t, gyengíti a gyulladásos választ és az EndMT-t ox-LDL-indukált HUVEC-sérülésben. Végül kutatásunk kimutatta, hogy a Myr képes a sejtapoptózis, a sejtgyulladás és az EndMT enyhítésére a GAS5/miR-29a-3p/TLR4/NF-KB útvonalon keresztül (8. ábra), ami arra utal, hogy Myr, mint az AS lehetséges terápiás szere. Ezenkívül a GAS5-öt ígéretes célmolekulának javasolták, amely magában foglalja az AS patofiziológiai folyamatait.

Hivatkozások

1. Kondapalli, L., Bottinor, W.&Lenneman, C. A fékek immunterápiával történő felengedésével felgyorsítjuk az atherosclerosis kialakulását?

Körzet 142. (24), 2312-2315(2020).

2. Libby, P.Ridker, PM& Hansson, GKPogress és kihívások az atherosclerosis biológiájának fordításában. Nature 473(7347),

317-325 (2011).

3. Couto, NFet al. Az endoteliális sejtmembrán dinamikájának OxLDL-változásai a vezikulák forgalmának megváltozásához és növekedéséhez vezetnek

sejtek sérülésre való érzékenysége.Biochim.Biophys.Acta Biomembranes 1862,183139 (2019).

4. Yamagata, K. Az epigallocatechin-gallát protektív hatása az endothel rendellenességekre atherosclerosisban. J. Cardiovasc. Pharmacol.75,

292-298(2019).

5. Gao, S. & Liu, J. A cirkuláló oxidált alacsony sűrűségű lipoprotein és az atheroscleroticus kardiovaszkuláris betegség közötti összefüggés.

Krónikus Dis. Ford. Med. 3. cikk (2), 89-94 (2017).

6. Torisu, K. et al.Intact endothelialis autofágia szükséges a vascularis lipid homeosztázis fenntartásához.Aging Cell15(1),187-191 (2016).

7. Pan,X. et al.Nrf2/HO-1 jel aktiválása myricetinnel az ECM lebomlásának csillapítására humán porcsejtekben és az egér osteoarthritisének enyhítésére. Int. Immunopharmacol. 75,105742 (2019).

8.Li,M.et al. Myricetin gátolja a hepatocelluláris karcinóma terjedését a YAP expressziójának csökkentése révén. 8. cella (4),

358(2019).

9. Guo, C. et al. A miricetin javítja az etanol által kiváltott lipid felhalmozódást a májsejtekben a zsírsav-bioszintézis csökkentésével. Mol

Nutr. Food Res. 63. cikk (14), e1801393 (2019).