Natalenamidok A–C, ciklikus tripeptidek a termeszekkel kapcsolatos Actinomadura Sp. RB99

Absztrakt:

Az elmúlt években megnövekedtek a rovarokkal kapcsolatos baktériumok biokémiájával kapcsolatos vizsgálatok. Az analitikai dereplikációs folyamatokkal kombinálva ezek a vizsgálatok hatékony stratégiát kínálnak szerkezetileg és/vagy biológiailag új vegyületek azonosítására. A nem riboszómálisan szintetizált ciklikus peptidek széles bioaktivitási spektrummal rendelkeznek, és nagy gyógyászati ​​potenciállal rendelkeznek.

Itt három új ciklikus tripeptid felfedezéséről számolunk be: natalenamidok A–C (1–3. vegyület). Ezeket a vegyületeket a gombatermeszekkel kapcsolatos Actinomadura sp. RB99 folyadékkromatográfia (LC)/ultraibolya (UV)/tömegspektrometria (MS) alapú dereplikációs módszerrel. Az új vegyületek (1-3) kémiai szerkezetét átfogó spektroszkópiai módszerek, köztük egydimenziós (1H és 13C) és kétdimenziós (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC) magmágneses elemzésével állapítottuk meg. rezonancia spektroszkópia (NMR), valamint nagy felbontású elektrospray ionizációs tömegspektrometria (HR-ESIMS) adatok. Az új vegyületek abszolút konfigurációját Marfey analízisével tisztáztuk. A tripeptidek számos bioaktivitási tesztje során azt találtuk, hogy a 3. vegyület jelentős gátló hatást fejtett ki az 3-izobutil-1-metilxantin (IBMX) által kiváltott melanintermelésre. A 3-as vegyület hatása hasonló volt a kojsavéhoz, amely kozmetikai anyagként széles körben használt, bőrfehérítő hatású vegyület.

A szép, sima és finom bőr mindig is a keleti nők célja volt. A bőrápoló termékek fehérítő szerek kutatása és fejlesztése elsősorban a tirozináz aktivitás gátlásán alapul.

A benzolgyűrűket vagy fenolos hidroxilszerkezeteket tartalmazó vegyületek potenciális fehérítő hatással bírnak, mint például a jelenleg általánosan használt fehérítőszer, az arbutin, amely a tirozináz aktivitásának gátlásával fejthet ki fehérítő hatást.

És azt találtuk, hogy a Cistanche deserticolának fehérítő hatása van. A Cistanche deserticola fő hatóanyaga, a feniletanoid-glikozidok egyfajta természetes glikozidvegyület. Tanulmányok kimutatták, hogy a fenil-etanoid glikozidok gátolhatják a tirozináz aktivitását és a melanin termelődését az emberi epidermális melanocitákban, és fehérítő hatást fejtenek ki. a szer hatékonysága.

Click cistanche tubulosa kivonat por

Kulcsszavak:

gombatermesztő termeszek; Actinomadura sp.; tripeptidek; natalenamidok A–C; bőrfehérítő hatások.

1. Bemutatkozás

A mezőgazdasági rovarok védőbakteriális szimbiontáinak kémiai elemzése az elmúlt években nagy figyelmet keltett a természetes termékek vegyészei körében [1–5]. A legkorszerűbb nukleáris mágneses rezonancia (NMR)/tömegspektrometria (MS) alapú dereplikációs folyamatok és ökológiailag releváns biológiai vizsgálatok segítségével lenyűgöző mennyiségű szerkezetileg érdekes természetes terméket, köztük számos, nem riboszomálisan szintetizált ciklikus peptidet fedeztek fel. mikrobiális szimbiontákból [6]. A legkiemelkedőbb példák közé tartozik a gombaellenes dentigerumicin, egy gombatermesztő-hangya-asszociált Pseudonocardia sp. [7], valamint a gerumicin A–C, piperazinsavat tartalmazó ciklikus depszipeptidek, amelyeket a Pseudonocardia sp. [8].

Kimutatták, hogy a ciklikus peptidek biológiai aktivitások széles skáláját mutatják, és számos szintetikus megközelítést elősegítenek ezeknek a farmakológiailag ígéretes struktúráknak [9–12]. Jelenleg több mint 40 ciklikus peptid gyógyszert forgalmaznak és széles körben alkalmaznak klinikai környezetben, és évente átlagosan körülbelül egy új ciklikus peptid gyógyszer kerül a piacra [13].

Folyamatos törekvésünk részeként, hogy szerkezetileg új és/vagy bioaktív másodlagos metabolitokat azonosítsunk termeszek-asszociált mikrobákból [14–17], a termeszekhez kapcsolódó Actinomadura sp. RB99, a Macrotermes natalensis gombatermeszből izolált. Folyadékkromatográfia (LC)/ultraibolya (UV)/tömegspektrometria (MS) alapú dereplikációs stratégiánk potenciálisan új bioaktív természetes termékeket eredményezett. Ebben a tanulmányban beszámolunk három új ciklikus tripeptid, a natalenamid A–C (1–3. vegyület, 1. ábra) izolálásáról és kémiai azonosításáról, LC/UV/MS alapú dereplikációs módszerrel, valamint citotoxikus hatásuk biológiai értékeléséről. , gyulladáscsökkentő és bőrfehérítő tevékenység.

2. Eredmények és megbeszélés

2.1. Az 1–3. vegyületek folyadékkromatográfia (LC)/Ultraibolya (UV)/tömegspektrometria (MS) alapú izolálása

Actinomadura sp. Az RB99-et egy termeszmunkás (M. natalensis) felszínéről izolálták. Egy közel teljes 16S riboszomális ribonukleinsav (rRNS) szekvencia filogenetikai elemzése arra utal, hogy az RB99 törzs az Actinomadura nemzetségbe tartozik, a legközelebbi szomszédos Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T-vel. A dúsított tenyészet kivonatainak ezt követő LC/UV/MS alapú analízise jellegzetes UV-abszorpciók sorozatát tárta fel egyedi, nitrogénatomokat tartalmazó molekulaioncsúcsokkal.

A megfelelő metabolitok azonosítása és aktivitásuk vizsgálata érdekében nagy léptékű fermentációt végeztek optimalizált növekedési körülmények között (100 agarlemez 2 literes ISP2 agarból, pH 6, 10 nap 30 ◦C-on) és egy bevált feldolgozási és előtisztítási eljárást. alkalmazták [17]. Az ezt követő LC-UV/MS-vezérelt frakcionálás és ismétlődő félpreparatív nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) három metabolit izolálását eredményezte egyedi NMR/MS mintázattal. Különböző sók (NaCl, KBr 1-3 százalék ) és táptalaj összetételek (ISP1-6 táptalaj) felhasználásával végeztünk növekedési és tápközeg-vizsgálatokat, hogy utánozzuk a természetes környezetet és serkentsük a metabolittermelést, ami szintén a három új vegyület jelenlétéhez vezetett. metabolitok (lásd az S19 kiegészítő ábrát).

2.2. A vegyületek szerkezeti feltárása

A natalenamid A-t (1) amorf por formájában szereztük be. Az 1 molekulaképletét C19H25N3O5-ként határoztuk meg a nátrium-addukált molekulaionból, m/z 398,1691 [M plusz Na] plusz (C19H25N3O5Na-ra számítva, 398,1692) pozitív ion módú, nagy felbontású elektrospray-ionometria segítségével. ESIMS) adatok. Az infravörös (IR) spektrum erős abszorpciós sávot mutatott 1670 cm-1-nél, ami amidcsoportok jelenlétére utal a molekulában. Az 1. 1H-NMR-adatainak részletes elemzése (1. táblázat) egy peptidváz tipikus jeleit mutatta, két metiljelet megjelenítve (δH 0.91 (3H, d, J=7).{29) }} Hz, H-3) és 0.92 (3H, d, J=7.0 Hz, H-4)), három metilén jel (δH: 1,95 (1H, m, H-7a), 2,27 (1H, m, H-8a), 2,36 (1H, m, H-8b), 2,48 (1H) , m, H{{50}}b), 2,97 (1H, dd, J=14.0, 8.0 Hz, H{{58} }a), és 3,20 (1H, dd, J=14.0, 5,0 Hz, H-12b)), négy metin jel (δH 2,02 (1H) , m, H{70}}), 4,16 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1), 4,20 (1H, dd, J=8,5, 4,5 Hz, H-6) és 4,63 (1H, dd, J=8,0, 5,0 Hz, H-11)), és öt átfedő aromás proton (δH 7,18 (1H, m, H{96}}), 7,23 (2H, m, H{100}}/18) és 7,24 (2H, m, H{105}}}/17).

A 13C NMR spektrum (1. táblázat) a HSQC és HMBC spektrumok segítségével összesen 19 szénrezonanciát mutatott ki, amelyek két metil jelért (δC 18,9 és 19,9), három metilén jelért (δC 27.0) ​​felelősek, 30,6 és 38,8), kilenc metin jel (δC 32,1, 55,6, 58,0, 60,4, 127,8, 129,5 (×2) és 130,6 (×2)), beleértve öt aromás szénatomot, egy olefines szénatomot jel (δC 138,8) és négy karbonil szén szignál (δC 173,2, 173,3, 174,8 és 181,3). A fenti spektroszkópiai adatokkal kombinálva a kétdimenziós (2D) NMR részletes vizsgálata (1H-1H COSY, HSQC és HMBC kísérletek) három aminosav jelenlétét mutatta ki az 1-ben: glutamát (Glu), fenilalanin ( Phe) és valin (Val) (2. ábra). Ezen aminosavak összekapcsolhatóságát a H-1/C-5 és C-19, H-11/C-10 és C{ HMBC korrelációi határozták meg. {50}}, valamint H-6/C-5 és C-10 (2. ábra).

Az 1 abszolút konfigurációjának azonosítására Marfey módszerét alkalmaztuk a -H többszörösek (C-1, C-6 és C-11) sztereokémiájának meghatározására. Az 1 és a standard aminosavak (L/D-Glu, Phe és Val) savas hidrolizátumait 1-fluor-2,4-dinitrofenil-5-L-alaninnal derivatizálták. amid (L-FDAA). Ezt követően az 1. és a standard aminosavak derivatizált keverékét LC/MS-sel elemeztük, hogy megvizsgáljuk retenciós idejüket. A Glu-, Phe- és Val-részek abszolút konfigurációját úgy határoztuk meg, hogy L-formák, az L-FDAA-származékok 1-es retenciós ideje alapján, összehasonlítva a standard aminosavak retenciós idejével. Így az 1 szerkezete az 1. ábrán látható ciklikus tripeptidként derült ki.

A natalenamid B-t (2) amorf por formájában izoláljuk. Molekulaképletét (C20H27N3O5) a hidrogén- és nátriumaddukált molekulaion-csúcsokból vezették le 390,2032 [M plusz H] plusz (C20H28N3O5-re számítva, 390,2029) és 412,1849 [Na, illetve Na] plusz (0,8,1 H), 1,8,2,08. Összehasonlítva az 1 molekulaképletével és az NMR-spektrum adataival, úgy tűnik, hogy a 2. vegyület további CH2 csoporttal rendelkezik a peptidvázban. A 2 egydimenziós (1D) (1H és 13C NMR) és 2D NMR (1H–1H COSY, TOCSY, HSQC és HMBC) spektrumának átfogó vizsgálata három aminosav jelenlétét tárta fel: Glu, Phe és Leu. (leucin). Ezen aminosavak szekvenciáját a H-1/C-6 és C-20, H-12/C-11 és C HMBC korrelációi alapján állítottuk össze. -20, valamint H-7/C-6 és C-11 (2. ábra). A 2 abszolút konfigurációjának meghatározásához a Glu-, Phe- és Leu-maradékokat L-FDAA-val derivatizáltuk, majd LC/MS-sel analizáltuk. Az LC/MS adatokban az L-Glu-t, L-Phe-t és L-Leu-t a 2 L-FDAA származékainak retenciós idejének összehasonlításával mutatták ki a standard aminosavak retenciós idejével. Így a 2 kémiai szerkezetét az 1. ábrán látható ciklikus tripeptidként határoztuk meg.

A natalenamid C (3) pozitív módú HR-ESIMS adatai 424,1870 [M plusz H] plusz (C23H26N3O5-re számolva, 424,1872) és 446,1694 [M plusz Na2N, C35O] hidrogén- és nátrium-addukált molekulaionokat mutattak. 424.1692). Ez arra utalt, hogy a molekulaképlete C23H25N3O5. A 3 1D és 2D NMR spektrumának részletes elemzése azt mutatta, hogy kémiai szerkezete hasonló a 2-éhez, azzal a különbséggel, hogy a Leu Phe-vel volt helyettesítve a 3-ban. A 3-ban azonosított három aminosav összekapcsolhatóságát az H-1/C-9 és C-23, H-15/C-14 és C-23, valamint H-10/ C-9 és C-14 (2. ábra). Ha Marfey módszerét alkalmaztuk a 3-as vegyületre, a -H többszörösek abszolút konfigurációja (C-1, C-10 és C-15) egy L-Glu és két L. -Phe csoportok. Ennek megfelelően a 3 teljes szerkezetét az 1. ábra szerint határoztuk meg.

A natalenamidok A–C triciklusos peptidek, feltehetően nem riboszómális eredetűek. Jelenleg számos bioaktív ciklikus tripeptidet természetes termékként jellemeznek: a Penicillium rugulose-ból izolált citotoxikus 17-tagú ciklikus tripeptidek (pl. OF4949 I-IV) [18]; gombaellenes szklerotómiák A−K, amelyet halotoleráns baktériumok fermentléből azonosítottak [10]; és antiproliferatív pszichrofil E, amelyet két tengeri algából származó Aspergillus nemzetséghez tartozó gombatörzs vegyes kultúrájából izoláltak [19].

2.3. A vegyületek biológiai aktivitása 1-3

Mivel a ciklikus peptidekről beszámoltak arról, hogy biológiai aktivitások széles skáláját mutatják, az izolált ciklikus tripeptidek ({{0}}) biológiai hatásait három biológiai aktivitással értékelték. A 1-3 vegyületek citotoxicitását négy rákos sejtvonal (MCE7 mellráksejtek, HeLa méhnyakráksejtek, A549 humán tüdőráksejtek és HepG2 májráksejtek) ellen vizsgálták különböző koncentrációkban (0, 6,25). , 12,5, 25, 50 és 100 uM). Az 1. vegyület nem befolyásolta az MCF-7, a HeLa vagy az A549 sejtek életképességét. A HepG2 sejtek 100 M 1. vegyülettel való kezelése azonban a sejtek életképességét 78,5 plusz 3,2%-ra csökkentette (3. ábra). A 2. vegyület a HeLa és az A549 sejtek életképességét 82.9  2.1 százalékra, illetve 73.5=3.0 százalékra csökkentette, de nem befolyásolta az MCF-7 ill. HepG2 sejtek (3. ábra). A 3. vegyület egyik sejtvonal életképességét sem befolyásolta (3. ábra).

Ezt követően RAW264.7 makrofágokat használtunk az izolált vegyületek gyulladásgátló hatásának vizsgálatára. A NO-termelésben a sejtek túlélési arányának változása által okozott hibák kiküszöbölése érdekében minden egyes vegyület nem toxikus koncentrációját megvizsgáltuk. A 4. ábrán látható módon az 1–3. vegyületek kevés citotoxikus hatást fejtettek ki a RAW264.7 sejtekben (4A–C. ábra), és nem fejtettek ki gátló hatást a lipopoliszachariddal (LPS) stimulált RAW264.7 sejtekben a NO-termelésre (4D–F. ábra). .

Az 1–3. vegyületek B16F10 sejtek melanintartalmára gyakorolt ​​gátló hatását vizsgáltuk bőrfehérítő hatásuk bizonyítékaként (5. ábra). Mivel a sejtek életképességében bekövetkezett változások hibákat okoznak a melanin termelésében és mérésében, először az 1-3 vegyületek B16F10 sejtek túlélésére gyakorolt ​​hatását vizsgáltuk. Az 1–3. vegyületek egyik alkalmazott koncentrációnál sem fejtettek ki citotoxikus hatást a B16F10 sejtekben (5A–C. ábra). Ezt követően értékeltük a vegyületek gátló hatását az 3-izobutil-1-metilxantin (IBMX) által kiváltott melanintermelésre a B16F10 sejtekben (5D–F. ábra). Az IBMX, a melanogenezis jól ismert stimulátora, egyetlen kezelést követően jelentős növekedést indukál a melanintermelésben melanomasejtekben. A vizsgált vegyületek közül a 3-as vegyület (5-100 µM koncentrációban) dózisfüggő módon szignifikáns gátló hatást fejtett ki az IBMX által közvetített melaninszintézisre. Pozitív kontrollunk, a kojic savat széles körben használták bőrfehérítő hatású kozmetikai anyagként [20]. A 3-as vegyület IBMX-indukált melanintermelésre gyakorolt ​​gátló hatása hasonló volt a kojsavéhez (5F. ábra), ami arra utal, hogy a 3-as vegyület az IBMX által kiváltott melanintermelés erős inhibitoraként működik B16F10 melanomasejtekben.

Ezenkívül a 3-as vegyület kisszámú szennyeződéssel volt szennyezett, amelyeket az NMR spektroszkópiai adatok és az LC/MS analízis (kiegészítő anyagok, S11-S15 és S23 ábra) értelmezése alapján zsírsav-analógnak ítéltek. A szennyeződések aktivitásának azonosítására további kísérleteket végeztek a zsírsav-analógokkal, hogy gátló hatást fejtsenek ki az IBMX által kiváltott melanintermelésre B16F10 sejtekben, amelyek kimutatták, hogy a vizsgált vegyületeknek nincs fehérítő hatása (kiegészítő anyagok, S24 ábra). Így, bár nem zárhatjuk ki, hogy a 3. vegyület szennyeződései felelősek az IBMX által kiváltott melanintermelés gátló hatásáért, ez valószínűtlennek tűnik.

3. Anyagok és módszerek

3.1. Általános kísérleti eljárások

Az infravörös spektrumokat Bruker IFS{0}}/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, USA) spektrométeren vettük fel. Az elektrospray ionizációs és HR-ESIMS spektrumokat SI-2/LCQ DecaXP folyadékkromatográfiás (LC) tömegspektrométeren (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mértük. Az NMR-spektrumokat, beleértve az 1H–1H COSY, HSQC és HMBC kísérleteket, Varian UNITY INOVA 800 NMR spektrométerrel (Varian, Palo Alto, CA, USA) 800 MHz-en (1H) és 200 MHz-en (13C) hajtottuk végre. kémiai eltolódások ppm-ben (δ) megadva. A preparatív HPLC egy Waters 1525 bináris HPLC szivattyút használt Waters 996 Photodiode Array Detectorral (Waters Corporation, Milford, CT, USA). Az oszlopkromatográfiához Silica gel 60 (230–400 mesh, Merck, Kenilworth, NJ, USA) és RP-C18 szilikagélt (230–400 mesh, Merck) használtunk. A félpreparatív HPLC egy Shimadzu Prominence HPLC rendszert használt SPD-vel{ {22}}A/20AV sorozatú Prominence HPLC ultraibolya-látható (UV-Vis) detektorok (Shimadzu, Tokió, Japán). Az LC/MS elemzéseket Agilent 1200 sorozatú HPLC rendszeren (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) diódasoros detektorral és 6130-as sorozatú ESI tömegspektrométerrel, analitikai Kinetex-szel (4,6 × 100 mm, 3,5 µm). A vékony Merck szilikagél F254 lemezeket és RP-18 F254s lemezeket használtuk. -rétegkromatográfia (TLC) A foltokat vékonyrétegkromatográfiával detektáltuk UV fényben, vagy ánizsaldehid-kénsavas oldattal történő permetezés után melegítéssel.

3.2. Mikrobiális anyag

Actinomadura sp. Az RB99-et a M. natalensis nemzetségbe tartozó termeszek munkásának felszínéről izolálták (Mn103 kolónia, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) január 2-án{ {13}}10. A bioanyagot tiszta műanyag zacskókba helyezték, és a begyűjtést követő egy napon belül feldolgozták. A termeszeket steril ioncserélt vízben mostuk, és a kapott szuszpenziókat alacsony tápanyagtartalmú, kitintartalmú táptalajra szélesztve izoláltuk a baktériumokat (literenként: 4 g kitin, 0,7 g K2HPO4, 0,3 g). KH2PO4, 0,5 g MgSO4·5H2O, 0,01 g FeSO4·7H2O, 0,001 g ZnSO4, 0,001 g MnCl2 és 20 g agar) [21]. Az Actinobacteria-szerű morfológiájú izolátumokat átvittük ISP2 agarra (literenként: 10 g malátakivonat, 4 g élesztőkivonat, 4 g glükóz és 20 g agar), és addig tenyésztettük, amíg tiszta izolátumokat nem kaptunk.

3.3. DNS extrakció és polimeráz láncreakciós amplifikáció

Actinomadura sp. Az RB99-et tápanyagban gazdag ISP2 folyékony tápközegben tenyésztettük 5-7 napig 30 ◦C-on. A sejteket összegyűjtöttük, és a genomi DNS-t a GenJet genomiális DNS-tisztító készlettel (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) extraháltuk a gyártó utasításait követve, a következő változtatásokkal: (a) a lizozimkezelést 40 percre meghosszabbítottuk, és (b) A proteináz K-kezelést 40 percre meghosszabbítottuk. A DNS mennyiségét fotometriás úton Nanodrop Lite spektrométerrel (Thermo Scientific) határoztuk meg.

A filogenetikai vizsgálatokhoz a 16S rRNS gént az 1492R/27F primerkészlettel amplifikáltuk. Minden egyes amplifikációs reakciót 25 µl végső reakciótérfogatban készítettünk, amely 7,25 µl desztillált vizet, 5 µl HF puffert, 5 µl primert (2,5 µM), {{10}},5 µl dNTP-t tartalmazott. (10 µM), 0,25 µl Phusion High-Fidelity DNS polimerázt (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) és 2 µl extrahált DNS-t (templát). A polimeráz láncreakciót (PCR) a következő körülmények között hajtottuk végre: 98 ◦C 38 másodpercig; 32 ciklus 98 ◦ 30 másodpercig, 52 ◦ C 45 s, 72 ◦ C 1 perc 20 s; és a végső meghosszabbítás 72 ◦C 8 percig. A PCR-terméket agarózgél-elektroforézissel tettük láthatóvá, és a PCR-reakciókat PCR-tisztító készlettel (Thermo Scientific) tisztítottuk. A DNS-fragmenseket a GATC-ben (Konstanz, Németország) szekvenáltuk.

3.4. Szekvenálás és fajok azonosítása

A szekvenciák tisztaságát és eltéréseit a BioEdit segítségével értékelték [22]. Az egyes törzsekhez kapott előre és fordított szekvenciákat BioEdit-tel állítottuk össze, és DECIPHER (http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html) segítségével kimérákra teszteltük. Az eredményül kapott szekvenciákat a GenBank-ban helyeztük el (hozzáférési szám: KY558684). A csaknem teljes 16S rRNS-szekvenciákkal (1368 bp) végzett blasztelemzéseket a National Center for Biotechnology Information (NCBI) adatbázisával (referencia RNS-szekvenciák) végeztük. Az eredmények azt mutatták, hogy az RB99 törzs az Actinomadura nemzetség tagja. Az első 10 találat szekvenciáit letöltöttük az NCBI adatbázisból, és az Actinomadura sp. 16S rRNS-szekvenciájához igazították. RB99 a Sina szekvenciaillesztési szolgáltatás használatával [23]. Két különböző filogenetikai fát rekonstruáltak szomszéd-joining vagy maximum-likelihood algoritmusokkal a MEGA szoftver 7.0.26-os verziójával [24–26]. Tamura és Nei evolúciós távolságmodelljét használták evolúciós távolságmátrixok generálására a maximum-likelihood és a szomszéd-csatlakozó algoritmusokhoz, a teljes hiányosságok és a hiányzó adatok törlésével [27]. A maximum-likelihood algoritmushoz diszkrét gamma-eloszlást használtunk (plusz G), és a sebességváltozási modell lehetővé tette, hogy egyes helyszínek evolúciósan változatlanok legyenek (plusz I). A szomszédos csatlakozási algoritmus esetében a helyek közötti sebességváltozást gamma eloszlással ( plusz G) modelleztük. A csomópontok megbízhatósági értékeit bootstrap analízissel értékeltük 1000 újramintavételi lépés alapján [28].

3.5. Kivonás és izolálás

Actinomadura sp. Az RB99-et 50 ml ISP2 táplevesben növesztettük hét napig 30 ◦C-on (előtenyésztés), és 100 ISP2 agarlemezek beoltására használtuk. A lemezeket 10 napig 30 °C-on inkubáltuk, apró darabokra vágtuk, megszilárdítottuk, és egy éjszakán át MeOH-ba merítettük. A metanolos fázist szűrjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. A metanolos extraktumot (20 g) feloldjuk 700 ml desztillált vízben, majd az oldószert 700 ml etil-acetáttal háromszor megosztjuk, így 1,1 g maradékot kapunk. Az EtOAc-ban oldható frakciót (1,1 g) a MeOH-kivonatból szilikagél (230-400 mesh) oszlopra töltöttük kromatográfiás célokra, és CH2Cl2-MeOH (100:1-1:1) gradiens oldószerrendszerrel eluáltuk. 1, v/v). Ez hat frakciót (A–F) eredményezett, amelyeket LC-UV/MS alapú elemzésnek vetettünk alá. A házon belüli UV-spektrum könyvtár felhasználásával végzett dereplikációs analízis kisebb peptidanalógok jelenlétére utalt az E frakcióban. Ezek egyszerű UV-mintázatot mutattak körülbelül 220 nm-en, és egyedi molekulaképletű ioncsúcsokat tartalmaztak, amelyek nitrogénatomokat tartalmaztak. Az E poláris frakciót (233 mg) preparatív fordított fázisú HPLC-vel (Phenomenex Luna C18, 250 × 21,2 mm átmérőjű, 5 µm, Torrance, CA, USA) CH3CN/H2O (1:9-9:1, v) alkalmazásával frakcionáltuk. /v, gradiens rendszer, áramlási sebesség: 5 ml/perc), így öt alfrakciót (E1–E5) kapunk. Az E2 alfrakciót (27 mg) félpreparatív, fordított fázisú HPLC-vel (Phenomenex Luna C18, 250 × 10,0 mm átmérőjű, 5 µm) tisztítottuk 33% MeOH/H2O-val (izokratikus rendszer, áramlási sebesség: 2 ml/perc). 1. vegyületet kapunk (5,8 mg, tR=57,0 perc). A 2. vegyületet (1,6 mg, tR=42,0 perc) és a 3. vegyületet (1,5 mg, tR=55,0 perc) izoláltuk az E3 alfrakcióból (15 mg) félpreparatív fordított fázissal. HPLC eluálószer: 43% MeOH/H2O (izokratikus rendszer, áramlási sebesség: 2 ml/perc).

3.5.1. Natalenamid A (1)

3.5.2. Natalenamid B (2)

3.5.3. Natalenamid C (3)

3.6. Az 1-3. vegyületek savas hidrolízise

Mindegyik vegyületből (1-3) összesen 0,4 mg mennyiséget hidrolizáltunk 6 N HCl-lel (500 µL) 1 órán át 110 ◦C-on. Szobahőmérsékletre hűtés után az 1-3 hidrolizátumait bepároltuk, hogy eltávolítsuk a HCl nyomait. Desztillált vizet (500 µl) adtunk a hidrolizátum-elegyekhez, majd bepároltuk a HCl nyomainak eltávolítására; ezt az eljárást háromszor hajtották végre.

3.7. Az aminosavak abszolút konfigurációjának meghatározása az 1–3

A hidrolizátum-keverékeket (1-3), valamint a standard aminosavakat (L/D-Leu, Glu, Phe és Val) 1 N NaHCO3-ban (100 µL) feloldottuk, majd kezeltük. 50 µl L-FDAA-val (10 mg/ml acetonban). Ezt követően mindegyik hidrolizátumot 10 percig 80 °C-on melegítettük. Mindegyik elegyet 2 N HCl-oldattal (50 µl) leállítjuk, és vákuumban betöményítjük. A maradékot 300 µl MeOH-ban oldjuk. A hidrolizátumkeverékekből nyert minden egyes alikvot részt (5 µl) közvetlenül az LC/MS-be fecskendeztünk (Phenomenex Luna C18, 4,6 × 100 mm, 3,5 µm, áramlási sebesség 0,3 ml/perc), és teljes szkennelést végeztünk pozitív és negatív értékben. ionmódusokat (m/z 100 és 1000 közötti pásztázási tartomány) alkalmaztunk az L-FDAA-származék aminosavak retenciós idejének azonosítására.

A desztillált vízben lévő hangyasavból ({{0}},1 térfogatszázalék) (A) és acetonitrilből (B) álló mobil fázist gradiens oldószerrendszerrel vittük fel a következőképpen: 20-40 százalék (B) 10 percig, 100 százalék (B) izokratikus 5 percig, majd 20 százalék (B) izokratikus 5 percig, az oszlop futtatás utáni mosási eljárásához. A standardként használt L-FDAA származékos aminosavak retenciós ideje 16,7 perc (L-Glu, m/z 400 [M plusz H] plusz), 18,2 perc (D-Glu, m/z 400 [M plusz H]). plusz ), 22,1 perc (L-Val, m/z 370 [M plusz H] plus ), 25,1 perc (D-Val, m/z 370 [M plusz H] plusz), 25,6 perc (L-Phe, m/ z 418 [M plusz H] plusz), 27,0 perc (D-Phe, m/z 418 [M plusz H] plusz), 25,5 perc (L-Leu, m/z 384 [M plusz H] plusz), és 28,2 min (D-Leu, m/z 384 [M plusz H] plusz). Az 1-3 derivatizált hidrolizátumainak retenciós ideje L-Glu (16,9 perc), L-Phe (25,7 perc) és L-Val (22,5 perc) 1-től; L-Glu (16,7 perc), L-Phe (25,7 perc) és L-Leu (25,6 perc) a 2-ből; és L-Glu (16,9 perc) és L-Phe (25,7 perc) a 3-ból.

3.8. Citotoxikus vizsgálatok rákos sejteket használva

Az MCF7, HeLa és A549 sejteket az American Type Culture Collection-től (Rockville, MD, USA) vásároltuk. A HepG2 sejteket a Korean Cell Line Banktól (Szöul, Korea) vásároltuk. Az MCF7 sejteket Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 táptalajban tenyésztettük, amelyet 10% magzati szarvasmarha-szérummal egészítettünk ki. A HeLa és A549 sejteket Dulbecco minimális esszenciális tápközegében (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, USA) tenyésztettük, amelyet 10% magzati szarvasmarha-szérummal egészítettünk ki. A HepG2 sejteket Minimum Essential Mediumban tenyésztettük, amelyet 10% magzati szarvasmarha szérummal egészítettünk ki. A tenyésztési körülményeket 37 ◦C-on tartottuk 5% CO2-t tartalmazó párásított atmoszférában. A citotoxicitást ezen a négy humán sejtvonalon (MCF7, HeLa, A549 és HepG2) teszteltük az EZ-CyTox sejtéletképesség vizsgálati készlettel (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japán). Röviden, üregenként 5 × 103 sejtet oltottunk 96-lyukú lemezekre. 24 óra elteltével a sejteket a jelzett koncentrációjú vegyületekkel kezeltük. 72 órás inkubáció után az EZ-CyTox sejtéletképesség vizsgálati készletet használtuk. 2 órás inkubáció után az abszorbanciát 450 nm-en mértük, a referencia 620 nm-en. A sejtek életképességét a kontroll százalékában számítottuk ki.

3.9. Gyulladáscsökkentő tevékenység

A RAW264.7 egér makrofág sejtvonalat az American Type Culture Collection-től vásároltuk. A sejteket 10% magzati borjúszérummal (FBS), 100 egység/ml penicillinnel és 100 µg/ml sztreptomicinnel kiegészített DMEM-ben tenyésztettük, és 37 °C-on, párásított, 5% CO2-t tartalmazó atmoszférában inkubáltuk. A sejtek életképességét az Ez-Cytox sejtéletképesség-detektáló kittel mértük. A sejteket 96-lyuklemezeken inkubáltuk 2500 sejt/lyuk koncentrációban 24 órán keresztül, és 24 órán keresztül kezeltük az 1–3. számú vegyületek jelzett koncentrációival. Ezután Ez-Cytox reagenseket adtunk minden egyes lyukba. Az optikai sűrűséget 450 nm-en 1 óra múlva mértük meg mikrolemez-leolvasóval (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) a sejtek életképességének becslésére. Egy külön kísérletben a RAW264.7 sejteket 96-lyukas lemezeken inkubáltuk 30,000 sejt/lyuk koncentrációban 24 órán keresztül. 12 órás széruméheztetés után a sejteket 1 órán át előkezeltük az 1–3. vegyületekkel, majd 24 órán át 1 µg/ml LPS-sel stimuláltuk. A tenyésztőközeg abszorbanciáját Griess-reakcióban 540 nm-en mértük PowerWave XS mikrolemez-leolvasóval az NO-szint becslésére.

3.10. Melanintartalom mérése

A B16F10 egér melanoma sejtvonalat az American Type Culture Collection-től vásároltuk. A sejteket 10% FBS-sel, 100 egység/ml penicillinnel és 100 µg/ml sztreptomicinnel kiegészített DMEM-ben tenyésztettük, és 37 °C-on, 5% CO2-t tartalmazó párásított atmoszférában inkubáltuk. A B16F10 sejteket 6 cm-es tenyészedényekben inkubáltuk 250,{12}} sejt/lyuk sebességgel DMEM-ben, amelyet 10% FBS-sel, 100 µg/ml sztreptomicinnel és 100 U/ml penicillinnel egészítettünk ki 24 órán át. A sejteket kétszer mostuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), majd IBMX-szel stimuláltuk, és különböző koncentrációjú 1-3 vegyülettel vagy kojsavval (pozitív kontroll) inkubáltuk 10 százalékos FBS-sel kiegészített fenolvörös-mentes RPMI tápközegben, 100 egységben. /mL penicillint és 100 µg/ml sztreptomicint 24 és 48 órán keresztül. A táptalaj abszorbanciáját 405 nm-en mértük PowerWave XS mikrolemez-leolvasóval a melanintartalom becslésére. Az eredményeket a kontrollhoz (IBMX által nem stimulált sejtek) képesti változásként fejezzük ki.

3.11. Statisztikai analízis

Minden adatot, beleértve a sejtek életképességét, NO- és melanintermelését, átlagértékként és szórásként (SD) mutattuk be. Az összes vizsgálatot három párhuzamosban végeztük, és legalább háromszor megismételtük. Ebben a vizsgálatban minden sejtkísérletből csak néhány ismétlést vontunk be, így a statisztikai elemzéshez a nem paraméteres elemzési módszert alkalmaztuk. Az egyes változók statisztikai elemzéséhez Kruskall–Wallis tesztet használtunk. Minden elemzéshez az SPSS statisztikai csomagot használtuk (International Business Machines Corporation (IBM) SPSS statisztikai verzió 21, Boston, MA, USA). A statisztikai szignifikanciát 0,05-nél alacsonyabb p-értéknél vettük figyelembe.

4. Konklúziók

Jelentésünk egy gombatermeszkedő termeszből származó mikrobiális izolátumok kémiai elemzését tartalmazza. Három új ciklikus tripeptidet, az A–C (1–3) natalenamidokat izoláltuk és szerkezetileg jellemeztük a gombatermeszekkel asszociált Actinomadura sp. RB99 LC-UV/MS alapú replikációs módszerrel. Az összes izolált vegyület biológiai aktivitását sejtalapú vizsgálatokkal értékeltük. Az 1. és 2. vegyület gyenge citotoxicitást mutatott a HepG2 és HeLa/A549 sejtekkel szemben. Az izolált vegyületek egyike sem mutatott szignifikáns gátló hatást az NO termelésre LPS-stimulált RAW264.7 sejtekben. A 3. vegyület dózisfüggő módon jelentős gátló hatást fejtett ki az IBMX által közvetített melaninszintézisre. A hatás hasonló volt a kojsavéhoz, amelyet bőrfehérítő hatású kozmetikai anyagként használnak.

Köszönetnyilvánítás:

Mélyen hálásak vagyunk Michael Thomas-Poulsennek (Biológiai Tanszék, Koppenhágai Egyetem, Dánia), hogy támogatta terepmunkánkat.

Összeférhetetlenség:

A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.

Hivatkozások

1. Newman, DJ; Cragg, GM Natural products mint új gyógyszerek forrásai 1981 és 2014 között. J. Nat. Prod. 2016, 79, 629–661. [CrossRef] [PubMed]

2. Mishra, BB; Tiwari, VK Natural products: Változó szerep a jövőbeni gyógyszerkutatásban. Eur. J. Med. Chem. 2011, 46, 4769–4807. [CrossRef] [PubMed]

3. Beemelmanns, C.; Guo, H.; Rischer, M.; Poulsen, M. Természetes termékek rovarokkal kapcsolatos mikrobákból. Beilstein J. Org. Chem. 2016, 12, 314–327. [CrossRef] [PubMed]

4. Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Currie, CR; Clardy, J. Bakteriális szimbionták mezőgazdasági rendszerekben stratégiai forrást biztosítanak az antibiotikumok felfedezéséhez. J. Antibiot. 2014, 67, 53–58. [CrossRef] [PubMed]

5. Harvey, AL; Edrada-Ebel, R.; Quinn, RJ A természetes termékek újbóli megjelenése a gyógyszerkutatáshoz a genomika korszakában. Nat. Rev. Drug Discov. 2015, 14, 111–129. [CrossRef] [PubMed]

6. Sattely, ES; Fischbachb, MA; Walsh, CT Teljes bioszintézis: Poliketid és nem riboszómális peptid útvonalak in vitro helyreállítása. Nat. Prod. Rep. 2008, 25, 757–793. [CrossRef] [PubMed]

7. Ó, D.; Scott, JJ; Currie, CR; Clardy, J. Mycangimycin, polién-peroxid, amely a Streptomyces sp. Org. Lett. 2009, 11, 633–636. [CrossRef] [PubMed]

8. Ülj, CS; Ruzzini, AC; Van Arnam, EB; Ramadhar, TR; Currie, CR; Clardy, J. A változó genetikai architektúrák gyakorlatilag azonos molekulákat termelnek gombatermesztő hangyák bakteriális szimbiontáiban. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, 13150–13154. [CrossRef] [PubMed]

9. Alacsony, KE; Ler, S.; Chen, KJ; Campbell, RL; Hickey, JL; Tan, J.; Scully, CCG; Davies, RL; Judin, AK; Zaretsky, S. Calpain-inhibitorok racionális tervezése kalpasztatin peptidomimetikumokon alapulva. J. Med. Chem. 2016, 59, 5403–5415. [CrossRef] [PubMed]

10. Zheng, J.; Xu, Z.; Wang, Y.; Hong, K.; Liu, P.; Zhu, W. Ciklikus tripeptidek az Aspergillus sclerotiorum PT06-1 halotoleráns gombából. J. Nat. Prod. 2010, 73, 1133–1137. [CrossRef] [PubMed]

11. Weerakkody, D.; Moshnikova, A.; El-Sayed, NS; Adochit, RC; Slaybaugh, G.; Golijanin, J.; Tiwari, RK; Andreev, OA; Parang, K.; Reshetnyak, YK Új pH-érzékeny ciklikus peptidek. Sci. Rep. 2016, 6, 31322. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhao, M.; Lin, HC; Tang, Y. Biosynthesis of the -nitro-containing cyclic tripeptid psychrophilic. J. Antibiot. 2016, 69, 571–573. [CrossRef] [PubMed]

13. Zorzi, A.; Deyle, K.; Heinis, C. Ciklikus peptidterápia: Múlt, jelen és jövő. Curr. Opin. Chem. Biol. 2017, 38, 24–29. [CrossRef] [PubMed]

14. Kim, KH; Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Cao, S.; Poulsen, M.; Currie, CR; Clardy, J. Natalamycin A, egy ansamycin egy termeszek-asszociált Streptomyces sp. Chem. Sci. 2014, 5, 4333–4338. [CrossRef] [PubMed]

15. Kang, HR; Lee, D.; Benndorf, R.; Jung, WH; Beemelmanns, C.; Kang, KS; Kim, KH Termisoflavones A–C, izoflavonoid glikozidok termeszek-asszociált Streptomyces sp. RB1. J. Nat. Prod. 2016, 79, 3072–3078. [CrossRef] [PubMed]

16. Beemelmanns, C.; Ramadhar, TR; Kim, KH; Klassen, JL; Cao, S.; Wyche, TP; Hou, Y.; Poulsen, M.; Bugni, TS; Currie, CR; et al. Macrotermycins A–D, glikozilált makrolaktámok termeszek-asszociált Amycolatopsis sp. M39. Org. Lett. 2017, 19, 1000–1003. [CrossRef] [PubMed]

17. Guo, H.; Benndorf, R.; Leichnitz, D.; Klassen, JL; Vollmers, J.; Görls, H.; Steinacker, M.; Weigel, C.; Dahse, HM; Kaster, AK; de Beer, ZW; et al. Rubterolonok A–F izolálása, bioszintézise és kémiai módosításai: Ritka tropolon alkaloidok az Actinomadura sp. 5–2. Chem. Eur. J. 2017, 23, 9338–9345. [CrossRef] [PubMed]

18. Sano, S.; Ikai, K.; Katayama, K.; Takesako, K.; Nakamura, T.; Obayashi, A.; Ezure, Y.; Enomoto, H. OF4949, az aminopeptidáz B új inhibitorai. II. A szerkezet feltárása. J. Antibiot. 1986, 39, 1685–1696. [CrossRef] [PubMed]

19. Ciasullo, L.; Casapullo, A.; Cutignano, A.; Bifulco, G.; Debitus, C.; Hooper, J.; Gomez-Paloma, L.; Riccio, R. Renieramide, a Reniera n. vanuatui szivacsból származó ciklikus tripeptid. sp. J. Nat. Prod. 2002, 65, 407–410. [CrossRef] [PubMed]

20. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, GH Hipopigmentáló szerek: Frissített áttekintés a biológiai, kémiai és klinikai szempontokról. Pigm. Cell Melanoma Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

21. Visser, AA; Nobre, T.; Currie, CR; Aanen, DK; Poulsen, M. Az aktinobaktériumok, mint védekező szimbionták lehetőségeinek feltárása gombatermeszekben. Microb. Ecol. 2012, 63, 975–985. [CrossRef] [PubMed]

22. Hall, TA BioEdit: Felhasználóbarát biológiai szekvenciák igazítási szerkesztő és elemző program Windows 95/98/NT rendszerhez. Nukleinsavak Symp. Ser. 1999, 41, 95–98.

23. Pruesse, E.; Peplies, J.; Glöckner, FO SINA: A riboszomális RNS gének pontos, nagy áteresztőképességű többszörös szekvencia-illesztése. Bioinformatika 2012, 28, 1823–1829. [CrossRef] [PubMed].

24. Saitou, N.; Nei, M. The szomszéd-joining módszer: Új módszer filogenetikai fák rekonstruálására. Mol. Biol. Evol. 1987, 4, 406–425. [PubMed]

25. Felsenstein, J. Evolúciós fák DNS-szekvenciákból: A maximum likelihood megközelítés. J. Mol. Evol. 1981, 17, 368–376. [CrossRef] [PubMed]

26. Kumar, S.; Stecher, G.; Tamura, K. MEGA7: Molekuláris evolúciós genetikai elemzés, 7. verzió.0 nagyobb adatkészletekhez. Mol. Biol. Evol. 2016, 33, 1870–1874. [CrossRef] [PubMed]

27. Tamura, K.; Nei, M. Nukleotid szubsztitúciók számának becslése a mitokondriális DNS kontroll régiójában emberben és csimpánzban. Mol. Biol. Evol. 1993, 10, 512–526. [PubMed]

28. Felsenstein, J. A filogeniák bizalmi korlátai: A bootstrap-et használó megközelítés. Evolution 1985, 39, 783–791. [CrossRef] [PubMed]

Minta elérhetősége:

A vegyületek mintái nem állnak rendelkezésre a szerzőktől.

For more information:1950477648nn@gmail.com