Az Nc886, egy nem kódoló RNS, a sejtek öregedésének új biomarkere és epigenetikai közvetítője a fibroblasztokban

Absztrakt:

Az organizmusok és az emberi modellek funkcionális vizsgálatai kimutatták, hogy az epigenetikai változások jelentősen befolyásolhatják az öregedés folyamatát. Az egyik epigenetikai szabályozó, a nem kódoló RNS (ncRNS) fontos szerepet játszik az mRNS-ek és fehérjeik expressziójának módosításában. Képes közvetíteni a sejtek fenotípusát. Beszámoltak arról, hogy az nc886 (=vtRNS2-1 vagy pre-miR-886), egy hosszú ncRNS, képes elnyomni a tumorképződést és a keratinociták UVB által okozott fotokárosodását. Ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy meghatározza az nc886 szerepét a fibroblasztok replikatív öregedésében, és meghatározza, hogy az nc886 expresszióját szabályozni képes anyagok szabályozhatják-e a sejt öregedését. A replikatív öregedő fibroblasztokban az nc886 expressziója csökkent, míg a metilált nc886 nőtt.

Változások mutatkoztak az öregedési biomarkerekben, beleértve az SA{{0}}gal aktivitást, valamint a p16INK4A és p21Waf1/Cip1 expresszióját öregedő sejtekben. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az nc886 öregedéssel kapcsolatos csökkenése összefügg a fibroblasztok celluláris öregedésével, és hogy az nc886 expressziójának növekedése elnyomja a sejt öregedését. Az AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) növelte az nc886 expresszióját és javította a fibroblasztok sejtes öregedését az életkorral összefüggő biomarkerek gátlásával. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az nc886 potenciális új célpont az öregedésgátlásban, és hogy az ATC hatékony epigenetikus öregedésgátló összetevő lehet.

Az öregedés a funkcionális és szervi hanyatlás progresszív folyamata, amely idővel minden egyénben előfordul. Sok tényező befolyásolja az öregedést, és különböző társadalmi tényezők, a gazdaság, a betegségek, a táplálkozás, az öröklődés, a környezet és a mentális állapot egyaránt szerepet játszanak. Az öregedés mechanizmusa nagyon összetett, és a reprezentatívabb öregedéselméletek főként a sejtmutáció-elméletet, a DNS-károsodás elméletét, a mitokondriális károsodás elméletét, a telomerelméletet, a szabadgyök-elméletet, a nem enzimes glikozilációs elméletet, az immunfunkció-változás elméletét és a neuroendokrin öregedés elméletét foglalják magukban. . Hazánk gazdag a hagyományos kínai orvoslás forrásaiban, ami alapot ad ahhoz, hogy kiváló adalékokat találjunk a bőr öregedésének késleltetésére.

Például a kutatás során kiderült, hogy a Cistanche deserticolának öregedésgátló hatása van. A Cistanche deserticola öregedésgátló hatását elsősorban a benne található aminosavaknak és poliszacharidoknak tulajdonítják. Az aminosav az emberi szervezet számára nélkülözhetetlen tápanyag, amely képes fehérjeszintetizálni és fenntartani a szervezet normális anyagcseréjét. A Cistanche deserticolában nagyon magas az aminosav tartalma. Ezek az aminosavak energiával látják el a test sejtjeit, és elősegítik az új anyagcserét, ami előnyös a sejtek helyreállításában és megújulásában.

Kattintson a cistanche deserticola kiegészítő termékre

Kulcsszavak:

fibroblasztok; replikatív öregedés; epigenetikai szabályozás; nc886; zöld tea kivonat.

1. Bemutatkozás

A sejtproliferáció leállását követő visszafordíthatatlan állapotú sejtek öregedése a szöveti diszfunkció és az organizmusok öregedésének potenciálisan fontos tényezőjeként jelent meg [1]. Az öregedést az öregedéssel összefüggő béta-galaktozidáz (SA- -gal) magas aktivitása, az öregedési biomarkerek, például a p16INK4A és a p21Waf1/Cip1 expressziójának fokozása, valamint a LaminB1 csökkent expressziója jellemzi [2]. A sejtek öregedésének két alapvető típusa van: a replikatív öregedés és a stressz által kiváltott korai öregedés. A replikatív öregedésnek azt a jelenséget nevezzük, amikor a normál sejtek korlátozott számú osztódás elérése után abbahagyják az osztódást. Összefügg a kronológiai öregedéssel. A károsodások folyamatos felhalmozódása a fibroblasztok replikatív öregedését idézheti elő, ami az extracelluláris mátrix (ECM) átalakításának és szervezésének elvesztéséhez vezethet. Az elöregedett dermisz fő jellemzői a kollagénrostok csökkenése és a mátrix metalloproteinázok (MMP) fokozott termelése, amelyek hozzájárulnak a dermis vékony és rendezetlen szerkezetéhez [3,4].

Az epigenetikai szabályozó mechanizmusok kulcsfontosságú közvetítői az öregedési folyamatnak, alkalmazkodva a stresszorokhoz és a genomi és molekuláris környezetben az életkorral összefüggő változásokhoz. Ezek az epigenetikai változások különböző szinteken fordulnak elő, beleértve a maghiszton masszív redukcióját, a hiszton deformációját poszttranszlációs módosítással és DNS-metilációval, a kanonikus hisztonok hisztonváltozatokkal való helyettesítését, valamint a nem kódoló RNS (ncRNS) megváltozott expresszióját a szervezet és a replikációs öregedés során [5] ,6]. Az nc886 egy 101 nukleotid hosszúságú ncRNS, amely képes kötődni egy célfehérjéhez, így közvetíti a fehérje aktivitását és szabályozza a génexpressziót [7]. Az nc886-ot tumorszuppresszorként is javasolták, amelyre nagyrészt az expressziós mintázatából és az 5q31 humán kromoszómán, a tumorszuppresszor gén helyén elhelyezkedő genomiális elhelyezkedéséből következtetnek. Az nc886 expresszió sajátossága a rosszindulatú daganatok gyakori elhallgatása a CpG DNS metilációjával a promóter régióban [8]. Korábbi tanulmányok alapján azt találtuk, hogy az nc886 expressziójának UVB besugárzás által okozott csökkenése a keratinocitákban a protein kináz RNS-aktivált (PKR) útvonalon keresztül a COX-2 és az MMP-9 növekedésével jár, és hogy Az nc886 expressziójának elősegítése hasznos stratégia lehet UVB-védő anyagok kifejlesztésében [9,10].

A zöld teát számos bőrgyógyászati ​​állapot, például akne, rosacea, pikkelysömör, vírusos szemölcsök és még bőrrák kezelésére is tanulmányozták. A fenolos vegyületek, köztük a galluszsav (GC) és az epigallocatechin-gallát (EGCG), a zöld tea jól ismert hatóanyagai. (-)-Epigallocatechin-3-(3"-O-methyl) gallate (3" Me-EGCG) az EGCG egyedülálló O-metilezett formája, és az oolong teában és a zöld teában található. A Jangwon No. 3 (a zöld tea amorepacific fajtái) több 3" Me-EGCG-t tartalmaz, mint a zöld tea más fajtái [11]. A 3" Me-EGCG antioxidáns és fényvédő hatást fejt ki a keratinocitákon [12]. . Ebben a tanulmányban az nc886 szerepét vizsgáltuk a fibroblasztok replikatív öregedésében, és megállapítottuk, hogy az nc886 expresszióját fokozó, erősen koncentrált zöld tea 3" Me-EGCG készítmény (AbsoluTea Concentrate 2.{21}}) javíthatja-e a sejtek öregedését.

2. Eredmények

2.1. Az AbsoluTea koncentrátum 2.0 (ATC) kémiai profilja

Az AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) kémiai profilja az 1B. ábrán látható. Az eredményeket a Módszer részben leírtak szerint elkészített ATC-re vonatkozó HPLC-vel kaptuk. Az ATC legalább 30 százalékban 3" Me-EGCG-t tartalmazott (1B. ábra). Ismeretes, hogy a zöld tea kivonat nem tartalmaz 3" Me-EGCG-t, vagy 6 százaléknál kisebb koncentrációt mutat [13,14]. Mind az ATC-vel kezelt fiatal, mind az öregedő fibroblasztok nagyobb növekedést mutattak az nc886 expressziójában, mint azok, amelyeket zöld tea 70 százalékos etanolos kivonatával kezeltek (S1A kiegészítő ábra). Ezenkívül az ATC-vel kezelt öregedő fibroblasztokban az SA- -gal expressziós szintje jobban csökkent, mint a zöld tea kivonattal kezelteknél (S1B kiegészítő ábra).

2.2. nc886 Szabályozza a fibroblasztok celluláris öregedését

Az nc886 szerepének megfigyelésére a fibroblasztok sejtes öregedésében replikatív öregedési modellt alkalmaztunk szaporításon és szubkultúrán keresztül. Amint az S2 kiegészítő ábrán látható, az SA- -gal aktivitása és a p16INK4A és p21Waf1/Cip1 öregedő markerek expressziós szintje nőtt, a Lamin B1 expressziója pedig csökkent az öregedő fibroblasztokban a fiatal sejtekhez képest. Számos korábbi tanulmány beszámolt arról, hogy az öregedést az oxidatív stressz okozza. Annak igazolására, hogy az oxidatív stressznek ez a sorozata szerepet játszik-e a sejtek öregedésében, megmértük a fiatal (p3) és az öregedő fibroblasztok (p30) ROS szintjét. Az eredmények azt mutatták, hogy a ROS szintje nőtt az öregedéssel (S2D kiegészítő ábra). Annak érdekében, hogy megfigyeljük az nc886 potenciális hatását a fibroblasztok celluláris öregedésére, meghatároztuk az nc886 gén expressziós szintjét minden egyes passzázsban. Az nc886 expresszió szintje csökkent a passzázs számának növekedésével (2A ábra).

Beszámoltak arról, hogy az nc886 expressziója csökken a CpG-szigetek metilációjával. Annak megállapítására, hogy az öregedő fibroblasztokban az nc886 leszabályozását az nc886 metilációja közvetíti-e, metiláció-specifikus PCR-t végeztünk. Amint a 2A. ábrán látható, az nc886 metilációja nőtt a passzázsok számának növekedésével (2A. ábra). Ez az eredmény azt mutatja, hogy az nc886 csökkent expressziója nagy számú fibroblasztban az nc886 DNS-metiláció növekedésének köszönhető. Az nc886 fibroblaszt öregedésben betöltött szerepének igazolására meghatároztuk az öregedési markerek változásait az nc886 overexpressziós és knock-down modellekben. Az eredmények azt mutatták, hogy az nc886 túlzott expressziót mutató öregedő fibroblasztok csoportja csökkent SA-béta-gal aktivitást, csökkent p16INK4A és p21Waf1/Cip1 expressziós szintet, valamint megnövekedett laminB1 szintet mutatott. Ezenkívül az öregedő fibroblasztokban a ROS növekedését csökkentette az nc886 túlzott expressziója (2B. ábra). Ezzel szemben a fiatal fibroblasztok csoportjában, ahol az nc886 leütött, a sejtek öregedése felgyorsult, és a celluláris öregedési markerek, például a p16INK4A és a p21Waf1/Cip1 expressziós szintje megemelkedett (2C. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az nc886 képes szabályozni a fibroblasztok celluláris öregedését az öregedési markerek expressziójának szabályozásával (2B, C ábra).

2.3. Az ATC csökkenti a sejt öregedését az nc886 expresszió szabályozásával

A fent kapott eredmények azt mutatták, hogy az nc886 expresszió fokozása javíthatja a sejt öregedését az öregedési markerek közvetítésével. Az ATC nc886 expresszióra gyakorolt ​​hatásának megfigyelésére az nc886 expressziós szintjét és metilációját értékeltük öregedő fibroblasztokban, miután ATC-vel kezeltük nem citotoxikus koncentrációban (3A. ábra). Amint a 3B. és C. ábrán látható, az ATC koncentrációfüggő módon jelentősen növelte az nc886 expresszióját és csökkentette az nc886 metilációját. Ez az eredmény azt mutatta, hogy az nc886 expressziójának ATC általi növekedése az nc886 metiláció gátlásán keresztül közvetített. Ezenkívül megfigyeltük, hogy az ATC gátolta a SA- -gal aktivitást, és csökkentette a p16INK4A és p21Waf1/Cip1 öregedő markerek expressziós szintjét öregedő fibroblasztokban (3D, E ábra). Azonban a LaminB1 expressziója, amelyről ismert, hogy az öregedéssel csökkent, megnőtt az ATC-vel kezelt öregedő fibroblasztokban (3E. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ATC csökkentheti a sejt öregedését az nc886 expresszió növelésével.

2.4. Az ATC szabályozza az ECM és a SASP életkorral kapcsolatos változásait

A fibroblasztok öregedésére jellemző, hogy a kollagént lebontó komponens, az MMP-1 aktivitása megnő, míg a kollagénszintézis csökken [15,16]. Az MMP-1 növekedését és a kollagénszint csökkenését igazolták a magas passzázsszámú öregedő fibroblasztokban (4A. ábra). Az ATC azonban elnyomta az MMP{5}} expresszióját, és fokozta a kollagénszintézist öregedő fibroblasztokban. Ez az eredmény azt jelzi, hogy az ATC javíthatja az ECM életkorral összefüggő változásait az MMP-1 expressziójának és a kollagén szintézisének szabályozása révén öregedő fibroblasztokban (4B. ábra). Egy öregedéssel összefüggő szekréciós fenotípusról (SASP), amelyben az öregedő sejtek specifikus gyulladást elősegítő faktorokat, növekedési faktorokat és proteolitikus enzimeket választanak ki, beszámoltak róla, hogy hozzájárul az öregedéssel összefüggő betegségek kialakulásához és progressziójához [17–19]. Megfigyeltük az ATC hatását a SASP-re, különösen a gyulladást elősegítő citokinekre, mint például az IL-1, IL_6 és IL-8. A 4C. ábrán látható módon az ATC leszabályozta az öregedés által kiváltott IL-1, IL-6 és IL-8 expressziós szintjét. Ez arra utal, hogy az ATC öregedésgátló hatást fejthet ki az SASP elnyomásán keresztül.

3. Megbeszélés

Az öregedő sejtek jellegzetes morfológiai változásokon mennek keresztül, amelyek megnagyobbodott és gyakran szabálytalan sejtmag- és kromatin-újrarendeződéssel járnak. Ha az öregedést DNS-károsodás, replikációs kimerülés vagy onkogénexpresszió indukálja, a B1-lamin elsősorban elveszik. Különféle belső vagy külső stresszorok válthatják ki a DNS-károsodási válasz (DDR) útvonalat, hogy aktiválják a p53 és/vagy p16INK4A útvonalat. A p16INK4A inaktiválhatja a Cdk4/6-ot, foszforilált pRb felhalmozódását eredményezheti, megzavarhatja az E2F transzkripciós faktor szabályozását, és sejtciklus leállást vagy öregedést indukálhat [20,21]. A főként diszfunkcionális mitokondriumok által termelt reaktív oxigénfajták (ROS) fokozott termelése a DNS-károsodás és az öregedési jelátviteli útvonalak transzaktivációja révén sejt öregedéshez vezethet, beleértve a p53, p16INK4A és p21Waf1/Cip1 jeleket [22].

Ebben a tanulmányban azt találtuk, hogy az nc886 expressziója csökkent a passzázsok számának növekedésével, és hogy az nc886 expressziójának fokozása mérsékelte a sejt öregedését a LaminB1, p16INK4A, p21Waf1/Cip1 és ROS termelés közvetítésével. Az nc886-ot az RNS polimeráz III (Pol III) írja át, és a CpG DNS hipermetilációja elnémítja számos rosszindulatú daganatban [8]. Megfigyeltük, hogy az nc886 expressziója csökkent a CpG-szigetek metilációjával öregedő fibroblasztokban. Ez az eredmény azt jelzi, hogy a CpG-szigetek hipermetilációja rontja az nc886 funkcionalitását, mint a sejtek öregedésének szuppresszorát.

Az nc886 által érintett specifikus génexpressziós útvonalak nem tisztázottak. Valószínűleg magukban foglalják a korábban más ncRNS-eket is. Az nc886 kritikus szerepet játszhat a sejtek öregedésében azáltal, hogy közvetlenül vagy közvetve közvetíti az öregedés jelátviteli útvonalát a kromatin szerkezete, a transzkripciós faktor aktivitás, a poszttranszkripciós és poszttranszlációs génszabályozás szintjén [23]. Például az nc886 közvetítheti a sejtciklus progressziójának öregedési útvonalát. Beszámoltak arról, hogy az AK156230 mint ncRNS a fibroblasztok replikatív öregedésének indukálásához kapcsolódik az autofágiában és a sejtciklus progressziójában betöltött szerepe révén. Az AK156230 downregulációja a p53 és a p21 aktiválásával öregedési válaszokat indukált a sejtekben, miközben csökkentette a ciklin-dependens kináz 1-et (CDK1) [24]. Az öregedéssel összefüggő ncRNA1 (SAL-RNA1), a MALAT1 és a MIAT a sejt öregedésének negatív szabályozóiként ismert. Az öregedő fibroblasztokban csökkennek. E gének leszabályozása az öregedési markerek, például a SA-gal, p16, p21 és p53 növekedéséhez vezethet [25]. A MALAT1 hatását a sejtek öregedésére a b-Myb/Mybl2 onkogén transzkripciós faktor csökkenésével érték el.

Bár a különböző ncRNS-ek expresszióját befolyásolja az öregedés, csak néhányuk vesz részt funkcionálisan az öregedésben. Mivel az ncRNS-ek lokalizációja fontos a működésben szerepet játszó mechanizmusok megértéséhez, a nukleáris és citoplazmatikus ncRNS-eket külön tárgyaljuk az öregedést befolyásoló molekuláris mechanizmusok leírásánál [26]. A citoplazmában található ncRNS transzlációs szabályozóként működhet a cél-mRNS-sel való bázispárosodás révén [27]. Az ncRNS befolyásolhatja a fehérje expressziós szintjét az mRNS stabilitásának növelésével vagy csökkentésével [28].

Például a RAS által kiváltott öregedés során a citoplazmatikus UCA1 hozzájárul a p16 mRNS stabilizálásához a hnRNPA1 megkötésével [29]. Az nc886 protein kináz RNS-aktivált (PKR) kötőhelyet tartalmaz. A PKR–nc886 kötődés gátolhatja a PKR aktivitását. A PKR-t, a kettős szálú RNS (dsRNS) citoplazmatikus receptorát a szerin/treonin protein kináz szabályozza, amelyet fertőzés, citokinek, oxidatív stressz és besugárzás (beleértve az UV-t is) aktivál, ami gyulladás és apoptózis indukálásához vezet [20] ,21] [30,31]. Az nc886 a dsRNS-hez hasonló affinitással kötődik a PKR-hez, és megakadályozza a PKR aktiválódását. Az nc886 knockdown az eukarióta iniciációs faktor 2 alegységének (eIF2) foszforilációját eredményezi a PKR útvonalon keresztül, ami sejthalált okoz és gátolja a globális sejtfehérje szintézist. Beszámoltak arról, hogy a COX-2, IL-8 és MMP-k TNF- általi termelését a PKR útvonal közvetíti az emberi porcsejtekben [32]. Egy korábbi tanulmányunkban azt is kimutattuk, hogy az UVB által kiváltott gyulladás szabályozható az nc886-PKR-útvonalon keresztül a keratinocitákban [10].

Ezenkívül a PKR összefüggésben áll az újszülött szívizomsejtek oxidatív stressz által kiváltott károsodásával. A PKR gátlása véd a H2O2- által kiváltott sérülésekkel szemben az apoptózis és a gyulladás mérséklésével [33]. A gyulladás és az oxidatív stressz az öregedési folyamatot kiváltó fő tényezők. Így a PKR útvonal közvetítheti a fibroblasztok nc886 kimerülése által kiváltott sejtes öregedését. Az nc886 fibroblasztok sejtes öregedésére kifejtett hatásának részletes szabályozási mechanizmusának tisztázásához további vizsgálatokra van szükség.

A zöld tea kivonat öregedésgátló hatásait széles körben ismertették korábbi tanulmányok. A zöld tea antioxidáns és gyulladáscsökkentő hatása jól ismert mechanizmusok, amelyek hozzájárulnak öregedésgátló hatásához. Egy előzetes teszt során azt találtuk, hogy az ATC szignifikánsan növelte az nc886 expresszióját a zöld tea etanolos kivonatának több mint 70%-ával (kiegészítő S1A ábra). Ez az eredmény azt sugallja, hogy a koncentrált katechinek, beleértve a 3" Me-EGCG-t is, az nc886 expressziójának fokozódásának tulajdoníthatók. Annak megállapítására, hogy az nc886 stimuláló szer képes-e megakadályozni a sejt öregedését, megfigyeltük az ATC öregedő fibroblasztokra gyakorolt ​​hatását. Az ATC növelte az nc886 expresszióját gátolja az nc886 gén metilációjának szintjét öregedő fibroblasztokban (3B. ábra, C. ábra). Az ATC a sejt öregedését is enyhítette azáltal, hogy közvetítette az öregedő biomarkereket, például a SA- -gal aktivitást, a LaminB1-et, a p16INK4A-t és a p21Waf1/Cip1-et (3E. ábra). ).

Ezenkívül az ATC helyreállította a sejtöregedés által kiváltott megnövekedett MMP{0}} és csökkent kollagéntermelést (4B. ábra). A SASP faktorok kis mértékben változnak a sejt típusától és az öregedés által kiváltott stressz típusától függően, általában az NF-κB célgénjeiként ismertek, amelyek szabályozzák a gyulladást elősegítő citokineket, mint például az IL-6 és az IL{{6} }. Ebben a tanulmányban megerősítettük, hogy az IL-1, IL_6 és IL-8 megnövekedett expresszióját az öregedő sejtekben az ATC elnyomta (4C. ábra). Nem zárhatjuk ki annak lehetőségét, hogy a zöld tea sejtöregedést javító hatását többféle mechanizmussal érik el, beleértve az nc886 szabályozást, az antioxidációt és a gyulladást. Eredményeink azonban azt sugallják, hogy az ATC által megnövekedett nc886 kritikus szerepet játszik a sejtek öregedésének elnyomásában, ezt követően pedig befolyásolja a fibroblasztok ECM termelését.

4. Anyagok és módszerek

4.1. ATC előkészítése

A jelen vizsgálathoz használt szárított zöld tealeveleket (Camellia sinensis var. sinensis cv. Jangwon No. 3) a dél-koreai Jeju-ban, Dolsongi teakertben (33◦16023.900 N 126◦28058.300 E) termesztett teanövényekből nyertük. Száraz tealeveleket (170 g) 70%-os (v/v) etanollal extraháltunk szobahőmérsékleten 16 órán át. Az extraktumot ezután liofilizáló berendezéssel (TF10D, TEFIC BIOTECH, Xian, Kína) porítottuk. Az ATC előállításához az EtOH-kivonatot rotációs bepárlóban tízszeresére töményítettük, és egy AB-8 gyantával (belső átmérő: 5 cm, hossza 45 cm) töltött oszlopra töltöttük. Az oszlop oldószeres eluálását 4-szeres ágytérfogattal (BV) hajtottuk végre, 20 %, 30 % és 100 % EtOH (v/v). Ebben a vizsgálatban az oszlopban maradt oldószereket légkompresszorral távolították el az eluálás előtt. A 30%-os etanolos eluátumot hússzorosára töményítettük, és poliamid oszlopra vittük fel (2,5 cm belső átmérő, 40 cm hosszú). A poliamid oszlopot 5-ször BV 10% és 100% EtOH eluáltuk. A 100%-os etanolos eluátumot óvatosan betöményítettük és liofilizáltuk.

4.2. Sejttenyésztés és sejtkezelés ATC-vel

A humán dermális fibroblasztokat (HDF) az ATCC-től (Manassas, VA, USA) vásároltuk. A sejttenyésztést ellenőrzött körülmények között, 37 ◦C-on, 5 százalékos CO2-tartalom mellett végeztük, Dulbecco módosított Eagle-tápközegével (WELGENE, Daegu, Korea), amelyet 10 százalék magzati szarvasmarha-szérummal (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) és 1 százalék penicillinnel egészítettünk ki. -sztreptomicin (WELGENE, Daegu, Korea). A sejteket 6-lyuklemezekre oltottuk 2 × 105 sejt/lemez sűrűséggel. A 60 százalékos összefolyás elérése után 72 órán át kezeltük a jelzett koncentrációjú ATC-vel.

4.3. SA- -Gal festés és áramlási citometria elemzés

A sejteket SPiDER{0}}Gal (Dojindo, Kumamoto, Japán) segítségével festettük meg a gyártó utasításai szerint. A sejteket EVOS® FL Cell Imaging System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) és BD FACS Calibur áramlási citométer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) segítségével elemeztük.

4.4. Intracelluláris ROS mérés

Az intracelluláris ROS termelését C20,70 -diklór-dihidrofluoreszcein-diacetát (H2DCFDA; Molecular Probes), fluoreszcens ROS indikátor segítségével követtük. A sejteket H2DCFDA-val (5 µM) 30 percig 37 °C-on inkubáltuk. A sejtekhez kapcsolódó fluoreszcenciát BD FACS Calibur áramlási citométerrel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) detektáltuk.

4.5. Valós idejű PCR és metilezés-specifikus PCR

A teljes RNS-t TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) alkalmazásával extraháltuk. Az RNS mennyiségi mérését Epoch mikrolemezes spektrofotométerrel (BioTek, Winooski, VT, USA) végeztük. A cDNS-t am-fiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, Barker, TX, USA) alkalmazásával szintetizáltuk. A genomi DNS-t az AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (BIONEER, Daejeon, Korea) segítségével extraháltuk. A biszulfit konverziót az EZ DNS metilációs készlettel (Zymo Research, CA, USA) végeztük. A qRT-PCR végrehajtásához AMPIGENE® cDNS Synthesis Kit-et (Enzo Life Sciences Inc., Farming-dale, NY, USA) és ABI7500 valós idejű PCR rendszert (Ambion Inc, Austin, TX, USA) használtunk. A tanulmányban használt primer szekvenciákat az 1. táblázat írja le.

4.6. Laktát-dehidrogenáz vizsgálat

A citotoxicitás meghatározására LDH-tesztet használtunk a sérült sejtekből felszabaduló laktát-dehidrogenáz (LDH) aktivitás mérésével. A vizsgálatot LDH Cytotoxicity WST Assay kit (Enzo life sciences, Farmingdale, NY, USA) segítségével végeztük a gyártó utasításai szerint.

4.7. DNS-transzfekció az nc886 túlzott expressziójához és siRNS-transzfekció az nc886 Knockdownhoz

Az nc886 sejtekben történő túlzott expressziójához szükséges DNS előállításához a DNS-t AccuPower® PCR PreMix-szel (BIONEER, Daejeon, Korea) amplifikáltuk, templátként HDF-ek genomiális DNS-ét és a 2. táblázatban leírt következő primereket használva.

4.8. Western Blotting

A sejtlizátumokat PRO-PREP™ Protein Extraction Solution oldattal (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi do, Korea) állítottuk elő. Az összes fehérjét NuPAGE elektroforézis rendszerrel (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) választottuk el, és polivinilidén-difluorid (PVDF) membránokra vittük át. Az immunoblotot p16INK4A, p21Waf1/Cip1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), MMP1, Col1A2 és -aktin (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA) elleni primer antitesttel végeztük. A sávok pásztázó denzitometriás értékeit az ImageJ 1.52a szoftververziójával elemeztük (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.9. Enzim-kapcsolt immunszorbens vizsgálat

A jelzett inkubáció után a tenyészet felülúszójában a kollagént (Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japán) és az MMP-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) enzim-kapcsolt immunszorbens vizsgálati módszerrel mértük. (ELISA) készletet a gyártó utasításait követve.

4.10. Statisztikai analízis

Az összes eredményt átlag ± standard eltérésként (SD) adjuk meg. A két csoport közötti különbségeket t-próbával vagy varianciaanalízissel (ANOVA) értékeltük ki GraphPad Prism segítségével. A statisztikai szignifikancia értéke p < 0.05 vagy p < 0,01.

5. Következtetések

Összefoglalva, az nc886 expressziójának szabályozása a fibroblasztok sejtöregedésének potenciális célpontja lehet, az ATC pedig egy erős epigenetikus öregedésgátló összetevő lehet.

A szerző hozzájárulásai:

Koncepció, YK, KH és EJ; módszertan YK, HJ, N.-HP és K.-SL; adatkezelés, YK, HJ és EC; vizsgálat, YK, HJ, EC, K.-SL, N.-HP és EJ; projekt adminisztráció, WP, DP és EJ; források, WP és DP; felügyelet, DP és EJ; írás – eredeti tervezet, YK; írás – áttekintés és szerkesztés, N.-HP, KH, WP, DP és EJ Minden szerző elolvasta és elfogadta a kézirat közzétett változatát.

Finanszírozás:

Ez a kutatás nem kapott külső támogatást.

Az intézményi felülvizsgálati bizottság nyilatkozata:

Nem alkalmazható

Tájékozott beleegyező nyilatkozat:

Nem alkalmazható.

Adatelérhetőségi nyilatkozat:

Az adatokat kérésre rendelkezésre bocsátjuk.

Összeférhetetlenség:

A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.

Hivatkozások

1. Campisi, J.; d'Adda di Fagagna, F. Celluláris öregedés: Amikor rossz dolgok történnek a jó sejtekkel. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007, 8, 729–740. [CrossRef] [PubMed]

2. Kapoor, VK; Dureja, J. Aging: Approaches to its control. Drug Discov. Ma Ther. Stratégia. 2010, 7, 43–44. [CrossRef]

3. Fisher, GJ; Kang, S.; Varani, J.; Bata-Csorgo, Z.; Wan, Y.; Datta, S.; Voorhees, JJ A fotoöregedés és a bőr időrendi öregedésének mechanizmusai. Boltív. Bőr. 2002, 138, 1462–1470. [CrossRef]

4. Tigges, J.; Krutmann, J.; Fritsche, E.; Haendeler, J.; Schaal, H.; Fischer, JW; Kalfalah, F.; Reinke, H.; Reifenberger, G.; Stuhler, K.; et al. A fibroblasztok öregedésének jellemzői. Mech. Aging Dev. 2014, 138, 26–44. [CrossRef]

5. Brunet, A.; Berger, SL Az öregedés és az öregedéssel összefüggő betegségek epigenetikája. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S17–S20. [CrossRef] [PubMed]

6. Moszkalev, AA; Aliper, AM; Smit-McBride, Z.; Buzdin, A.; Zhavoronkov, A. Az öregedés és a hosszú élettartam genetikája és epigenetikája. Cell Cycle 2014, 13, 1063–1077. [CrossRef] 7. Lee, K.; Kunkeaw, N.; Jeon, SH; Lee, I.; Johnson, BH; Kang, GY; Bang, JY; Park, HS; Leelayuwat, C.; Lee, YS Precursor miR-886, egy új, nem kódoló RNS, amelyet rákban elnyomnak, társul a PKR-hez, és modulálja annak aktivitását. RNA 2011, 17, 1076–1089. [CrossRef] [PubMed]

8. Park, JL; Lee, YS; Song, MJ; Hong, SH; Ahn, JH; Seo, EH; Shin, SP; Lee, SJ; Johnson, BH; Stampfer, MR; et al. Az RNS polimeráz III transzkripcióinak epigenetikai szabályozása a korai emlőtumorigenezisben. Oncogene 2017, 36, 6793–6804. [CrossRef] [PubMed]

9. Lee, KS; Shin, S.; Cho, E.; Im, WK; Jeon, SH; Kim, Y.; Park, D.; Frechet, M.; Chajra, H.; Jung, E. nc886, egy nem kódoló RNS, gátolja az UVB által kiváltott MMP-9 és COX-2 expressziót a PKR útvonalon keresztül humán keratinocitákban. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2019, 512, 647–652. [CrossRef] [PubMed]

10. Lee, KS; Cho, E.; Weon, JB; Park, D.; Frechet, M.; Chajra, H.; Jung, E. Az UVB által kiváltott gyulladás gátlása Laminaria japonica kivonattal az nc886-PKR útvonal szabályozásán keresztül. Nutrients 2020, 12, 1958. [CrossRef]

11. Ji, HG; Lee, YR; Lee, MS; Hwang, KH; Kim, EH; Park, JS; Hong, YS Epigallocatechin-3-O-(3-Omethyl)-gallate (EGCG300Me) és aminosavprofilok azonosítása különböző tea (Camellia sinensis L.) fajtákban. Adatok rövid. 2017, 14, 607–611. [CrossRef]

12. Kim, E.; Han, SY; Hwang, K.; Kim, D.; Kim, EM; Hossain, MA; Kim, JH; Cho, JY A (-)-epigallokatechin-3-(300-O-metil)-gallát antioxidáns és citoprotektív hatásai. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3993. [CrossRef]

13. Huang, LH; Liu, CY; Wang, LY; Huang, CJ; Hsu, CH A zöld tea kivonat hatása túlsúlyos és elhízott nőkre, akiknek magas az alacsony sűrűségű lipoprotein-koleszterin (LDL-C) szintje: Randomizált, kettős vak és keresztezett, placebo-kontrollos klinikai vizsgálat. BMC kiegészítés. Altern. Med. 2018, 18, 294. [CrossRef] [PubMed]

14. Soares, S.; Soares, S.; Brandao, E.; Guerreiro, C.; Mateus, N.; de Freitas, V. Orális kölcsönhatások a zöld tea flavanol kivonat és a vörösbor antocianin kivonat között egy új sejtalapú modell segítségével: Insights on the effect of different oral epithelia. Sci. Rep. 2020, 10, 12638. [CrossRef] [PubMed]

15. Levi, N.; Papismadov, N.; Solomonov, I.; Sagi, I.; Krizhanovsky, V. Az öregedés ECM-útja az öregedésben: Komponensek és módosítók. FEBS J. 2020, 287, 2636–2646. [CrossRef] [PubMed]

16. Pitozzi, V.; Mocali, A.; Laurenzana, A.; Giannoni, E.; Cifola, I.; Battaglia, C.; Chiarugi, P.; Dolara, P.; Giovannelli, L. A krónikus resveratrol-kezelés javítja a sejtadhéziót és enyhíti a gyulladásos fenotípust öregedő humán fibroblasztokban. J. Gerontol. Ser. 2013, 68, 371–381. [CrossRef] [PubMed]

17. Coppe, JP; Patil, CK; Rodier, F.; Sun, Y.; Munoz, DP; Goldstein, J.; Nelson, PS; Desprez, PY; Campisi, J. Az öregedéssel összefüggő szekréciós fenotípusok az onkogén RAS és a p53 tumorszuppresszor sejt-nem autonóm funkcióit tárják fel. PLoS Biol. 2008, 6, 2853–2868. [CrossRef]

18. Tchkonia, T.; Zhu, Y.; van Deursen, J.; Campisi, J.; Kirkland, JL A sejtes öregedés és az öregedő szekréciós fenotípus: Terápiás lehetőségek. J. Clin. Investig. 2013, 123, 966–972. [CrossRef] [PubMed]

19. Munoz-Espin, D.; Serrano, M. Celluláris öregedés: A fiziológiától a patológiáig. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2014, 15, 482–496. [CrossRef]

20. Lagger, G.; O'Carroll, D.; Rembold, M.; Khier, H.; Tischler, J.; Weitzer, G.; Schuettengruber, B.; Hauser, C.; Brunmeir, R.; Jenuwein, T.; et al. A hiszton-dezacetiláz 1 alapvető funkciója a proliferáció szabályozásában és a CDK-gátló represszióban. EMBO J. 2002, 21, 2672–2681. [CrossRef] [PubMed]

21. Freitas-Rodriguez, S.; Folgueras, AR; Lopez-Otin, C. A mátrix metalloproteinázok szerepe az öregedésben: Tissue remodeling and within. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res. 2017, 1864, 2015–2025. [CrossRef]

22. Victorelli, S.; Passos, JF Reaktív oxigénfajok kimutatása öregedő sejtekben. Módszerek Mol. Biol 2019, 1896, 21–29. [PubMed]

23. Puvvula, PK LncRNAs Regulatory Networks in Cellular Senescence. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 2615. [CrossRef] [PubMed]

24. Chen, YN; Cai, MY; Xu, S.; Meng, M.; Ren, X.; Yang, JW; Dong, YQ; Liu, X.; Yang, JM; Xiong, XD Az lncRNS, AK156230 azonosítása, mint a sejtek öregedésének új szabályozója egérembrionális fibroblasztokban. Oncotarget 2016, 7, 52673–52684. [CrossRef] [PubMed]

25. Abdelmohsen, K.; Panda, A.; Kang, MJ; Xu, J.; Szelimjan, R.; Yoon, JH; Martindale, JL; De, S.; Fa, WH, 3.; Becker, KG; et al. Senescence-asszociált lncRNS-ek: öregedéssel kapcsolatos hosszú, nem kódoló RNS-ek. Aging Cell 2013, 12, 890–900. [CrossRef]

26. Montes, M.; Lund, AH. Az lncRNS-ek feltörekvő szerepei az öregedésben. FEBS J. 2016, 283, 2414–2426. [CrossRef] [PubMed]

27. Carrieri, C.; Cimatti, L.; Biagioli, M.; Beugnet, A.; Zucchelli, S.; Fedele, S.; Pesce, E.; Ferrer, I.; Collavin, L.; Santoro, C.; et al. A hosszú, nem kódoló antiszensz RNS szabályozza az Uchl1 transzlációját egy beágyazott SINEB2 ismétlődésen keresztül. Természet 2012, 491, 454–457. [CrossRef]

28. Kretz, M.; Siprashvili, Z.; Chu, C.; Webster, DE; Zehnder, A.; Qu, K.; Lee, CS; Flockhart, RJ; Groff, AF; Chow, J.; et al. A szomatikus szövetek differenciálódásának szabályozása a hosszú, nem kódoló RNS TINCR segítségével. Természet 2013, 493, 231–235. [CrossRef] [PubMed]

29. Kumar, PP; Emechebe, U.; Smith, R.; Franklin, S.; Moore, B.; Yandell, M.; Lessnick, SL; Moon, AM Az öregedés koordinált szabályozása lncRNS-sel és egy új T-box3 társrepresszor komplexszel. Elife 2014, 3, e02805. [CrossRef]

30. Freund, A.; Laberge, RM; Demaria, M.; Campisi, J. A Lamin B1 elvesztése egy öregedéssel kapcsolatos biomarker. Mol. Biol. Cell 2012, 23, 2066–2075. [CrossRef]

31. Gal-Ben-Ari, S.; Barrera, I.; Ehrlich, M.; Rosenblum, K. PKR: Emlékezetes kináz. Elülső. Mol. Neurosci. 2018, 11, 480. [CrossRef] [PubMed]

32. Ma, CH; Wu, CH; Jou, IM; Tu, YK; Hung, CH; Hsieh, PL; Tsai, KL A PKR aktiválása gyulladást és MMP{1}} szekréciót okoz emberi degenerált ízületi porcsejtekben. Redox Biol. 2018, 14, 72–81. [CrossRef] [PubMed]

33. Wang, Y.; Men, M.; Xie, B.; Shan, J.; Wang, C.; Liu, J.; Zheng, H.; Yang, W.; Xue, S.; Guo, C. A PKR gátlása az apoptózis és a gyulladás mérséklésével véd az újszülöttkori szívizomsejtek H2O2 - által kiváltott károsodásától. Sci. Rep. 2016, 6, 38753–38763. [CrossRef] [PubMed]Yuna Kim 1, Hyanggi Ji 1, Eunae Cho 1, Nok-Hyun Park 2, Kyeonghwan Hwang 2, Wonseok Park 2, Kwang-Soo Lee 1, Deokhoon Park 1 és Eunsun Jung 1.

For more information:1950477648nn@gmail.com