A Cistanche Deserticola és rizsborpároló termékeinek neuroendokrin-immun funkciója glükokortikoid-indukált patkánymodellben-Ⅰ

1. Bevezetés

Cistanche deserticolaA "sivatagi ginzeng" egy hagyományos kínai orvoslás, amelyet évszázadok óta használnak jang-tonikus gyógynövényként.élénkíti a vesét és erősíti a jangot[1]. Nyolc faj és egy változataCistanche Herba csak Kínában rögzítettékCistanche deserticolaYC Ma ésCistanche tubulosa(Schenk) A Wight-ot a Kínai Gyógyszerkönyv tartalmazza [2]. A farmakológiai vizsgálatok ezt bizonyítottákCistanches Herbaneuroprotektív [3], immunmoduláló [4], szívvédő [5], fáradtság gátló [6], gyulladáscsökkentő [7], májvédő [8], antioxidáns [9], antibakteriális [10], hashajtó [11] és daganatellenes hatások [12]. E nemzetség biológiai aktivitásainak széles spektruma összetett és változatos fitokémiai összetételének tulajdonítható.Cistanche deserticolafenil-etanol-glikozidokat, iridoidokat, poliszacharidokat [13] stb. tartalmaz. A fenil-etanol-glikozidok tartalma a legmagasabb az eredeti gyógyászati ​​anyagokban [14].

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A VESE FELÉPÍTÉSÉHEZ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

A kínai Materia Medica (CMM) feldolgozása egy hagyományos gyógyszerészeti technika, amely a hagyományos kínai orvoslás elmélete szerint megfelel a kezelés, az adagolás és a készítmények előállításának különböző követelményeinek. Ezeket a feldolgozott termékeket főzetdaraboknak nevezik, amelyeket a klinikákon használnak. A feldolgozás célja a nyers gyógyszerek toxicitásának csökkentésére irányuló hatékonyság fokozása. A 2015-ös Kínai Gyógyszerkönyv feljegyezte, hogy a Cistanche vastag szeleteket (CD) és a rizsborban párolt Cistanche-t (WCD) főzetdarabokként használhatták a klinikán. Kutatócsoportunk kimutatta, hogy a hashajtó hatás enyhült, az öregedésgátló és a vese-jang élénkítő hatása pedig erősödött, miután a Cistanche-t rizsborral párolták [15].

A hypothalamus-hipophysis-mellékvese-csecsemőmirigy (HPAT) tengely működése a vese-yang-hiányszindrómában zavart [16]. A vese-yang-hiányban szenvedő betegek immunrendszeri működési zavarai is kiterjedtek. A HPA tengely diszfunkciója szorosan összefügg az immunhiánnyal. A neuroendokrin-immunhálózat (NEI) elmélete azt mutatja, hogy az immunrendszer és a neuroendokrin rendszer számos ligandumot és receptort tartalmaz [17], és a hipotalamusz a neuroendokrin és az immunrendszer közötti tengelykapcsoló.

Ebben a vizsgálatban modellpatkányokon exogén kortikoszteroid injekcióval replikáltuk a vese-jang-hiányt, és feltártuk a vese-jang-hiány mechanizmusát a Cistanche deserticola különböző feldolgozott termékeire adott válaszként az endokrin-immun funkció szempontjából.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Anyagok és reagensek

A Cistanche deserticolát Alashan Neimenggutól gyűjtötte 2019.5-ben, és Yanjun Zhai professzor (Gyógyszerésziskola, Liaoningi Hagyományos Kínai Orvostudományi Egyetem, Kína) a Cistanche deserticola YC Ma szárított, húsos száraiként azonosította. Az utalványmintákat a Liaoning Processing Engineering Technology Centerben őrizték meg.

Az ajugol standard vegyületeit a Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd.-től (Chengdu, Kína) vásároltuk; cisztanozid F,echinakozid, cisztanozid A és izoakteozida Must Company-tól (Sichuan Kína) vásárolták; Az akteozidot a Dalian Meilun Bio-tól vásárolták. Co., Ltd. (Dalian, Kína). Az MS-minőségű acetonitrilt és a metanolt a Merck KGaA-tól (Darmstadt, Németország) vásároltuk. A HPLC minőségű hangyasavat a Merck KGaA-tól (Darmstadt, Németország) vásároltuk. A rizsbort a Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd.-től (Zhejiang, Kína) vásároltuk.

Kortikoszteron (CAS: 50-22-6, tisztaság > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), chinkuei shin chewan tabletták (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), patkány ACTH, CRH, T, IL{{ A 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 és IL-10 ELISA kimutatási készleteket a Nanjing Jiancheng Co., Ltd.-től vásároltuk. A patkánykortizol ELISA készletet a BOSK Co. biztosította. patkány CD4 antitest, CD8a antitest (561833 és 559976), RBC lizátum (Solarbio, R1010), PBS pufferoldat (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM és -aktin upstream és downstream primerek a Guangzhou Invitrogen Co. Reverse Transcription Kit (NR037A) és a cDNS Synthesis Kit (10000068167) a Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. biztosította. Kloroform, izopropanol, 75%-os etanol és etanol Az oldatok mindegyike analitikailag tiszta volt, és a Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. gyártotta. Az ultratiszta vizet a Milli-Q rendszerrel állítottuk elő (18,2 MΩ, Millipore, MA, USA).

2.2. Kísérleti eszközök

Enzimmarker (Thermo, modell 3530911931), automatikus lemezmosó (HBS- 4009 modell), digitális kijelzős nyomó-húzó erőmérő (VICTOR- 50N modell), nagy sebességű fagyasztó centrifuga (Sigma 3k15 modell) ), ultramikro spektrofotométer (modell B-50Q), génerősítő (modell L96G), valós idejű fluoreszcencia kvantitatív PCR (modell StepOne), áramlási citométer (modell AC66051710132), paraffin mikrotom (modell Laikalympus), mikroszkóp (O , BS-53 modell) és tisztavizes műszert (F7JA36507 modell) használtak.

2.3. Minták előkészítése UPLC-Q-TOF-MS és farmakológiai kísérletekhez

A WCD-t ugyanabból a tételből dolgozták felCistanche deserticolalaboratóriumunkban. WCD készítéséhez száraz CD-darabokat (5 mm vastag) (100 g) rizsborral (30 ml) öntöttünk be, nagy nyomáson (1,25 kPa) pároljuk 4 órán át, majd 55 fokon szárítjuk.

A CD és WCD durva porát 10-szeres 95%-os etanolban 0,5 órán át áztattuk, háromszor 1 órán át visszafolyató hűtő alatt extraháltuk, szűrtük, és a szűrleteket háromszor egyesítettük. Az etanolt csökkentett nyomáson kinyerjük, és az extraktumot beadásra kapjuk. Az extraktumot (1 ml) 50%-os metanolhoz adtuk, a teljes térfogatot 20 ml-re emelve, és 4 fokon tároltuk tartalomelemzés céljából.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A SZEXUÁLIS FUNKCIÓ JAVÍTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. UPLC-QqQ-MS A CD- és WCD-kivonatok elemzésének feltételei

2.4.1. LCThMS analitikai feltételek

Az adatgyűjtéshez és -feldolgozáshoz a MassLynx 4.1 Analyst szoftverrel ellátott UPLC-MSThMS rendszert használtuk. Az analitikai oszlop egy Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) volt, 40 C-os hőmérsékleten. 0,1%-os hangyasav vizes oldata (A) és 0,1% hangyasavat tartalmazó acetonitril (B). Az elúciós gradiens 0.{15}}–1.{17}} perc 3% B-vel, 1,01-2.{22}} perc 3%–11,5% B, 2,01-3.{29 }} perc 12% B-vel, 3,01-4.{34}} perc 15% B-vel, 4,01-5.{39}} perc 20% B-vel, 5,01-6.00 perc 22-vel % B, 6,01-8.{49}} perc 25% B-vel és 8,01-9.{54}} perc 10% B-vel. Az áramlási sebesség 0,3 mLTh perc volt, a befecskendezési térfogat 1,0 μL.

Negatív ion üzemmódban a Waters tripla négyes tömegspektrométert (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA) használtuk elektrospray ionizációs (ESI) forrással. A deszolvatációs gáz nitrogén volt 500 LThh áramlási sebességgel 250 fokos hőmérsékleten. Az összes kimutatott vegyületet többszörös reakciófigyelő (MRM) módban mértük; Az 1. táblázat az energiaparamétereket, a 2. táblázat pedig az elemzett komponensek kalibrációs görbéit mutatja.

2.4.2. Referenciaanyagok elkészítése

Tubulozid A (302 mg), echinakozid (300 mg), 2′-acetil-lakteozid (2,34 mg), akteozid (2,45 mg), izoakteozid (0,61 mg), cisztanozid F ( 2,14 mg, szalidrozidot (3,39 mg), genipozidsavat (2,84 mg), ajugolt (1,58 mg) és katalpolt (2,39 mg) feloldunk metanolban törzsoldat elkészítéséhez. A törzsoldatot metanollal hígítottuk, hogy a munkastandard oldatokhoz megfelelő koncentrációt kapjuk. Minden elkészített oldatot felhasználás előtt 4 fokon tároltunk.

2.5. Állatmodellek készítése és csoportosítása

SD hím patkányokat (180–220 g) a Liaoning Changsheng Biotechnological Co.-tól vásároltunk, állatengedély száma: SCXK (Liao) 2015–0001. Minden patkánynak szabad hozzáférést biztosított az élelemhez és a vízhez 25 fokos hőmérsékleten és 30-50%-os relatív páratartalom mellett. Az állatokat 7 napig tartottuk a kísérletek előtt.

Száz patkányt véletlenszerűen 10 csoportra osztottak: vak kontroll (BC) csoport, modell kontroll (MC) csoport, pozitív kontroll (PC) csoport, rizsbor kontroll (WC) csoport, CD nagy dózisú (CD) -HD) csoport, CD közepes dózisú (CD-MD) csoport, CD alacsony dózisú (CD-LD) csoport, WCD nagy dózisú (WCD-HD) csoport, WCD közepes dózisú (WCD-MD) csoport, és WCD alacsony dózisú (WCD-LD) csoport. A CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD és CD-LDThWCD-LD dózisa 5,48 gTh (kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d), illetve 1,37 gTh (kg ∙ d) volt. A PC-csoport dózisa 1,646 gTh (kg ∙ d), a WC-csoporté pedig 1 mLTh100 g volt 40 napon keresztül. A beadást követő 6. napon a patkányok szubkután kortikoszteron vizes szuszpenziót kaptak (kortikoszteron + 0,1% dimetil-szulfoxid + 0,1% Tween-80 + 0,9% nátrium-klorid), kivéve a BC csoport számára [18]. A kortikoszteron koncentrációja 5 gThL, a dózis 0,1 mLTh100 g volt. A BC csoport patkányai normál sóoldatot + 0,1% dimetil-szulfoxidot + 0,1% Tween- 80 + 0,9% nátrium-kloridot kaptak injekcióban, azonos dózisban.

2.6. HPA tengelyfüggvények meghatározása

2.6.1. Súly, hőmérséklet és tartási erő teszt

Súlytesztet 3 naponta végeztek, 6 naponta hőmérést. a kísérlet során. A 39. napon a hátsó végtag maximális erejét markolatmérővel mérték. A patkányokat sima platformokra helyezték, így hátsó végtagjaik megragadták a rudat. A patkányok ösztönösen megragadnak minden tárgyat, hogy ne mozduljanak hátra, amikor a farkát addig húzzák, amíg a húzóerő meghaladja a fogást. Amikor a patkány elvesztette a tapadást, az előerősítő automatikusan rögzíteni tudta a maximális fogási erőt.

2.6.2. A T, CRH, ACTH, CORT és kortizol szintjének meghatározása a szérumban

Egy órával az utolsó beadás után a patkányokat uretán oldat (20 gTh100 ml) intraperitoneális injekciójával érzéstelenítettük. Ezután a vérmintákat gyűjtöttük, 3500 fordulattal 15 percig centrifugáltuk, hogy megkapjuk a szérumot, és -20 °C-on tároljuk. A T, CRH, ACTH, CORT és kortizol koncentrációját patkány ELISA kittel mértük a gyártó utasításai szerint.

2.6.3. Mikroszkópos megfigyelések

A mellékvese szövetének morfológiai szerkezetét HE festéssel figyeltük meg. A mellékvese szövetét 10%-os paraformaldehidben fixáltuk, etanolban dehidratáltuk, xilololdattal átlátszóvá tettük, hagyományos módszerekkel beágyaztuk, 4 μm vastag szeletekre vágtuk, xilololdattal viaszmentesítettük, etanolos gradienssel hidratáltuk, majd hematoxilinnel és eozinnal festettük. festőoldat. Miután xilollal átlátszóvá tették, a lemezt semleges gumival lezártuk, és mikroszkóp alatt megfigyeltük.

2.6.4. A Bax, Bcl-2, kaszpáz-3, Fas és FasL fehérje expressziójának immunhisztokémiai festése a mellékvesében

A formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott patkány mellékvese metszeteket paraffinmentesítettük és rehidratáltuk, miután 4 μm vastagságúra vágtuk. Az endogén peroxidáz aktivitás blokkolása érdekében a metszeteket hidrogén-peroxid blokkban 1 0 percig előinkubáltuk. A metszeteket 0,01 M citrátba (pH 6,0) mártjuk, és forrásig melegítjük. Az eljárást 5-10 perc múlva megismételjük. Lehűlés után a metszeteket PBS-sel (pH 7,2-7,6) 1-2 alkalommal mostuk, szobahőmérsékleten hagytuk körülbelül 5 percig, majd 2-3 alkalommal mostuk PBS-sel (pH 7,2-7,6). Az 5%-os BSA blokkolóoldatot szobahőmérsékleten adtuk hozzá, és a metszeten lévő felesleges folyadékot 20 perccel később leráztuk. FasTh FasL-re, Bcl-2ThBax-ra és kaszpázra-3 (1:100 arányban PBS-sel hígítva) specifikus, hígított primer antitesteket adtunk, és 37 fokon 1 órán át vagy 4 fokon egy éjszakán át inkubáltuk. A metszeteket 2-3 alkalommal mostuk PBS-sel (pH 7,2-7,6). Ezután biotinilált kecske anti-egér IgG-t adtunk hozzá, és a metszeteket 20-37 fokon 20 percig szárítottuk, majd négyszer 5 percig PBS-sel (pH 7,2-7,6) mostuk. PBS-ben történő alapos mosás után a metszeteket A és B reagensek keverékével 30 percig inkubáltuk, 45 percig PBS-sel inkubáltuk, végül DAB szubsztráttal (DAKO) 30 percig előhívtuk, majd enyhén hematoxilinnal megfestettük, dehidratáltuk. és felszerelve.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA a szexuális érzés fokozására PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Az immunfunkciók meghatározása

2.7.1. Az immunszervi index kiszámítása

Egy órával az utolsó beadás után a patkányokat uretánoldat (20 gTh100 ml) intraperitoneális injekciójával elaltattuk, majd a lépet és a csecsemőmirigyet eltávolítottuk, és steril csuklyában azonnal lemértük. A lép vagy a csecsemőmirigy súlytényezői (%) � lép vagy csecsemőmirigy tömege (mg) Testtömeg (g).

2.7.2. T-limfocita alcsoportok kimutatása perifériás vérben

A lépsejteket és a hemocitákat a monoklonális anti-CD4 (PE) és anti-CD8 (FITC) antitestekkel inkubáltuk 30 percig sötétben. 2 ml eritrocita-lizátumot adunk hozzá, és az oldatot vortex-eléssel összekeverjük. Az oldatot 10 percig sötétben hagyjuk, majd 5 percig centrifugáljuk. A felülúszót elöntöttük, majd az oldatot háromszor mostuk jéghideg PBS-sel, és újraszuszpendáltuk PBS permeabilizáló oldatban. Legalább 10,{11}} sejtet elemeztünk áramlási citometriával minden egyes Mab-festést követő 1 órán belül.

2.7.3. Az IL-10, IL-6, IL-2, TNF- és IFN-c szintjének meghatározása a szérumban

Egy órával az utolsó beadás után a patkányokat uretánoldat (20 gTh100 ml) intraperitoneális injekciójával elaltattuk, és vért vettünk a hasi aortából. A vért 3500 fordulattal 15 percig centrifugáltuk, hogy megkapjuk a szérumot, és -20 °C-on tároljuk. Az IL-10, IL-6, IL-2, TNF- és IFN-c koncentrációit patkány ELISA kittel mutattuk ki a gyártó utasításai szerint.

2.8. CaM expressziója hipotalamuszban és hypophysis szövetekben

A teljes RNS-t a hypothalamus és a hypophysis szöveteiből TRIzol extraháltuk. A reverz transzkripciót 10 μl teljes RNS-en végeztük a gyártó utasításai szerint. Egyenlő mennyiségű cDNS-t elemeztünk qPCR-rel dsDNS-kötő festék (Promega, USA) és a CFX 96 Real-time PCR System (Bio-Rad, USA) jelenlétében, hogy megvizsgáljuk a különböző géneket a kezdeti aktiválás körülményei között. 95 fokon 10 percig, 40 denaturációs ciklus 95 fokon 15 másodpercig, és lágyítási meghosszabbítás 60 fokon 1 percig.

A CaM és -aktin primereket az 1. táblázat tartalmazza, és -aktint használtunk belső kontrollként. Minden mintát normalizáltunk a célgén és -aktin közötti kritikus küszöbértékek (Ct) különbségének felhasználásával. Az eredmény leírására a következő egyenletet használtuk: ΔΔCt � (Ct célgén − Ct -aktin gén) kísérleti csoport − (Ct célgén − Ct -aktin gén) kontrollcsoport. Ezután az egyes minták mRNS-szintjeit összehasonlítottuk a 2- ΔΔCt célgén expressziójával. Az egyes csoportok eredményeit átlagoltuk (3. táblázat).

2.9. Statisztikai elemzés

Az összes adatot SPSS szoftverrel (19.0 verzió, SPSS Institute Inc., Chicago, IL) elemeztük. A csoportok közötti különbségeket egyutas ismételt méréses varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük. Az eredményeket átlag ± szórásban (SD) fejeztük ki a GraphPad Prism szoftverrel (6-os verzió.0, San Diego, CA, USA). A 0,05-nél kisebb P-értékű különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

3. Kísérleti eredmények

3.1. UPLC-QqQ-MSAnalízis

A legjobb elválasztás, csúcsforma és rövid elemzési idő elérése érdekében előzetes kísérletünkben a kromatográfiás körülményeket, köztük az oszlopot, a mozgófázist és a gradiens programot vizsgáltuk. A tipikus kromatogramokat MRM móddal az 1. ábra mutatja be.

A 4. táblázatból látható, hogy WCD-ben a fenil-etanoid-glikozidok tartalma nőtt a CD-hez képest, különösen az echinakozid és az akteozid esetében, míg az iridoidok tartalma WCD-ben csökkent.

3.2. A HPA tengelyfunkció szabályozása

3.2.1. Súly, hőmérséklet és tartási erő teszt

Az MC-csoport patkányai és a kísérleti csoportok kortikoszteron kezelését követően fokozatosan mutatták a vese-jang-hiányos tüneteket. A tünetek, mint a fogyás, hipotermia, hajfény elvesztése, leesett hangulat, a válasz elmaradása, valamint a vízfogyasztás és aktivitás jelentős csökkenése, nagymértékben javultak a CD és WCD csoportban. A 2(a) ábra a súlyváltozásokat mutatja. Mindegyik gyógyszercsoport súlya nőtt, különösen a CDHD és a WCD-HD csoportban. A súlygyarapodás az MC csoportban volt a legalacsonyabb. A 2(b) ábra mutatja a hőmérsékletváltozásokat, amelyek az MC csoportban voltak a legalacsonyabbak, és a hőmérséklet emelkedett a WCD-HD, WCD-MD és WCD-LD csoportokban.

A 2(c) ábra azt mutatja, hogy a tartóerő nőtt a BC csoportban és mindegyik kísérleti csoportban, és a WCD-MD csoportban volt a legmagasabb, ami azt mutatja, hogy a vese-yang hiány okozta gyengeség jelei javultak a beadás után.

3.2.2. A T, CRH, ACTH, CORT és kortizol szintjei

A 3. ábra azt mutatja, hogy a BC csoporthoz képest a T, CRH, ACTH és CORT szintje a patkányszérumban csökkent (P < 0.01) és csökkent a kortizol szintje (P < 0.05) az MC csoportban. Az MC csoporthoz képest a WCD-HD és WCD-MD csoportban a T szint emelkedett (P < 0.01), a CRH szint a WCD-LD-ben, A WCD-MD és WC csoportok javultak (P < 0,01), az ACTH-tartalom nőtt a CD-HD, WCD-MD és WCD-HD csoportokban (P < 0,01), a CORT szint javult a A CD-MD, WCD-MD és WCD-HD csoportok (P < 0,01) és fokozott a CDHD és WCD-LD csoportokban (P < 0,05), és a kortizolszint emelkedett mindegyik gyógyszercsoportban.

3.2.3. A mikroszkópos megfigyelés eredményei

A mellékvese szövete a kérgi rétegre és a velőrétegre osztható. A kérgi rétegek közé tartoznak a gömb alakú, köteges és retikuláris rétegek. A sejtek több lipidet tartalmaznak, és a velőréteg többnyire feokromocitóma sejtekből és kis mennyiségű rostos szövetből áll. A 4. ábrán látható módon azt találtuk, hogy a BC csoportban minden normális volt, míg az MC csoportban a mellékvesekéreg nyilvánvaló hiperpláziával, celluláris atrófiával és növekvő sűrűséggel rendelkezett. A hagymás csík megvastagodott, az áttetsző fascicularis zóna, a keskeny zona reticularis és a kisebb sejtek egyenetlen elszíneződést és kapilláris torlódást mutattak. A PC csoportban a corticalis és a velőhatárok láthatóak voltak. A gömb- és kötegsáv sejtjei egyenletesen helyezkedtek el, a morfológiai szerkezet helyreállt. Ugyanezt a jobb helyreállást figyelték meg a WCD csoportokban, és a WCD-MD csoportban a hatások jobbak voltak, mint a WCD-HD és a WCD-LD csoportoké. A mellékvese morfológiája a CD csoportokban nem volt olyan jó, mint a WCD csoportokban.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A SZEXUÁLIS FUNKCIÓ JAVÍTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%