A gyakorlatok és a MitoQ neuroprotektív előnyei a memóriafunkcióra, a mitokondriális dinamikára, az oxidatív stresszre és az ideggyulladásra D-galaktóz által kiváltott öregedő patkányok esetében 2. rész

2.6. Szövet előkészítés

A 8 hetes TE és memória viselkedési tesztek befejezése után az összes patkányt CO2 belélegzéssel elaltattuk, és az agyszöveteket 7 állattól gyűjtöttük be minden kezelési csoportban.

A memória viselkedési tesztje hatékony eszköz a memória értékelésére. A növekvő társadalmi és munkahelyi nyomás következtében az emberek emlékezete egyre fontosabbá válik. Ezért a memória viselkedési tesztje segíthet megérteni memóriaszintünket, és hatékony intézkedéseket hozni a memória javítására és fenntartására a teszt eredményei alapján.

Konkrétabban, a memória viselkedési tesztjei értékelhetik az emberek információfogadási, -feldolgozási, -tárolási és -lekérési képességét. A különböző típusú információk, például nyelv, számok, képek stb. tesztelésével az emberek memóriája teljes mértékben tesztelhető. A teszteredmények különböző pontszámokat adnak, amelyek segítenek megérteni gyengeségeinket és erősségeinket, és hogyan erősíthetjük memóriánkat.

A gyakorlatban számos memóriaviselkedés-teszt szakmai tippeket és javaslatokat is ad. Például a jó alvás, a kiegyensúlyozott étrend, a megfelelő testmozgás és a rendszeres agytorna mind jótékony hatással van az emberek memóriájára. Ezekkel a módszerekkel javíthatjuk memóriamegtartási időnket, memória-reprodukciós képességünket és más szempontokat, hogy jobban alkalmazkodjunk a mindennapi élethez vagy a munkahelyi szükségletekhez.

Röviden, a memória viselkedési teszt nagyon hasznos a memória megértéséhez, értékeléséhez és fejlesztéséhez. Megfelelő módszereket is alkalmaznunk kell emlékezetünk aktuális helyzetünknek megfelelően erősítésére, hogy szilárd alapot teremtsünk egy teljesebb és gazdagabb élethez. Látható, hogy javítanunk kell a memórián, a Cistanche pedig jelentősen javíthatja a memóriát, mert a Cistanche egy hagyományos kínai gyógyászati ​​anyag, számos egyedi hatással, amelyek közül az egyik a memória javítása. A Cistanche hatása a benne található különféle hatóanyagokból ered, beleértve a csersavat, poliszacharidokat, flavonoid glikozidokat stb. Ezek az összetevők különféle módon elősegíthetik az agy egészségét.

Kattintson a Ismerje meg a rövid távú memória javításának módját

Az agykéreg és a hippokampusz szétválasztása után az agyszövetet folyékony nitrogénben gyorsfagyasztottuk és -80 ◦C-on tároltuk az elemzésig. A fennmaradó 5 állatot immunhisztokémiai (IHC) analízishez használtuk.

A mellüreg kinyitása után 50 mM foszfáttal pufferolt sóoldatot (PBS) engedtünk át a bal kamrán 10 percig, majd az állatot 4%-os paraformaldehiddel (PFA) perfundáltuk 100 mM PBS-ben.

A perfúziós rögzítés után az agyat begyűjtöttük, 4%-os PFA-ba helyeztük, és 4 órán át 4 ◦C-on fixáltuk. A rögzített agyszövetet 2 napra 30%-os szacharózoldatba merítettük, majd kriosztát segítségével 40 µm vastag szeletekre vágtuk ( Leica Microsystems, Nussloch, Németország).

2.7. Mitokondriumok izolálása

A mitokondriumok izolálásához Mitochondria Extraction Kit-et (IMGENEX Corporation, San Diego, CA, USA) használtunk a gyártó utasításai szerint. Minden 100 mg hippocampális szövethez 1 ml homogenizáló puffert adtunk.

Homogenizálás után a szövetet 900×g-vel 10 percig 4°C-on centrifugáltuk, majd a felülúszót összegyűjtöttük, és ismét centrifugáltuk 15,000×g-vel 30 percig 4°C-on.

A centrifugált citoszolfrakciót felvéve a citoszolt elválasztottuk, és a maradék pelletet alaposan összekevertük 1 ml szuszpenziós pufferben, majd 15,{2}}×g-vel, 10 percig 4 ◦C-on centrifugáltuk.

A felülúszót eltávolítottuk, és további 1 ml szuszpenziós puffert adtunk hozzá, mielőtt alaposan összekevertük, majd ismét centrifugáltuk 15, 000 × g-vel 10 percig 4 °C-on.

A felülúszót eltávolítottuk, és a maradék pelletet feloldottuk 1 ml teljes mitokondriális lízis pufferben 30 percig 4 °C-on. A mitokondriális kivonatot ezután 15,000 × g-vel centrifugáltuk 5 percig 4 °C-on, és a felülúszót (mitokondriális frakciót) összegyűjtöttük.

2.8. Western blottolás
A mitokondriális izolálással nyert összfehérjét Bradford módszerrel határoztuk meg. Egyenlő mennyiségű mitokondriális fehérjét (30 µg sávonként) töltöttünk nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézisbe (SDS-PAGE) (8% vagy 12%).

Elektroforézis után a fehérjéket polivinilidén-fluorid (PVDF) membránra (Millipore, Boston, MA, USA) vittük át.

A blokkolást 1 órán át szobahőmérsékleten 1×Tris-pufferolt sóoldattal, 5% BSA-t tartalmazó Tween-20 (TBS-T) oldattal végeztük, majd a membránt egy éjszakán át 4 ◦C-on reagáltattuk primer antitestekkel.

A következő elsődleges antitesteket használtuk: Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p22 phox, p47 phox, gp91phox, SOD-2, kataláz és -aktin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, hígítás:1 :1000); és TNF- (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság, hígítás: 1:1000).

A membránokat ezután mosópufferrel (PBS 0,1% Tween 20-at tartalmazó PBS-sel) mostuk, majd torma-peroxidázzal (HRP) konjugált kecske anti-nyúl másodlagos antitestekkel inkubáltuk őket forp22 phox, gp91 phox és TNF ellen. - (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, hígítás: 1:5000).

HRP-konjugált kecske anti-egér szekunder antitesteket használtunk Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p47 phox, SOD-2, kataláz és -aktin (Santa Cruz Biotechnology, hígítás: 1:5000) ellen.

A fehérje expressziós szinteket az ECL Western blotting detektáló rendszer (Santa Cruz Biotechnology) segítségével detektáltuk. A kialakult fehérjesávok sűrűségét a ChemiDoc XRS gél képalkotó rendszerrel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) elemeztük.

2.9. Immunhisztokémia (IHC)
Az IHC analízishez a szabadon lebegő módszert alkalmaztuk a kiválasztott szövetre minden egyes kezelési csoportban. Miután a szövetet háromszor 10 percig, egyenként 0,01 M PBS-ben mostuk, a szövetet 80 ◦C-on 60 percig inkubáltuk 0,01 M nátrium-citrátot tartalmazó főzőpohárban, majd blokkoltuk 10%-os oldatban. normál szamárszérum (Millipore Sigma, Burlington, MA, USA).

A szövetmintát ezután a p22 phox elleni primer antitestekkel (Santa Cruz Biotechnology, hígítás: 1:500) és az anti-glial fibrilláris savas fehérjével (GFAP) (Abcam, hígítás: 1:500) reagáltattuk 12-ig. h 4 ◦C-on. A következő napon a szövetet háromszor 5 percig mostuk 0,01 M PBS-ben, majd szobahőmérsékleten 2 órán át reagáltattuk HRP-konjugált kecske anti-egér szekunder antitesttel (Santa Cruz Biotechnology, hígítás: 1:5000).

Végül a szövetet szobahőmérsékleten inkubáltuk Vectastain-Elite ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) oldattal, és az eredményeket a DABPeroxidase Substrate Kit (Vector Laboratories) segítségével tettük láthatóvá.

Mindegyik szövetszeletet tárgylemezre helyeztük rögzítőközeg (Vector Laboratories) segítségével, és fénymikroszkóppal (Leica Microsystems) ellenőriztük.

2.10. Statisztikai elemzések

Az adatokat az SPSS for Windows 18-as verziójával elemeztük.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Minden értéket átlag ± SEM-ben fejeztünk ki. A statisztikai szignifikanciát egyutas ANOVA-val határoztuk meg. A többszörös összehasonlításhoz Bonferroni post hoc teszteket használtunk. A különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük p < 0,05 értéknél.

3. Eredmények

3.1. A futópad gyakorlat és a MitoQ hatása a mitokondriális dinamikával kapcsolatos fehérjék expressziójára a D-Gal által kiváltott öregedő patkányok hippokampuszában

Igazoltuk, hogy a TE és a MitoQ befolyásolta a mitokondriális fúzióval kapcsolatos faktorokat (Mfn1, Mfn2, Opa1) és a hasadáshoz kapcsolódó faktorokat (Drp1, Fis1) öregedő patkányok hippocampusában (1. ábra).

A mitokondriális fúzióval kapcsolatos faktorok expressziós szintjei szignifikánsan különböztek a kezelési csoportok között (Mfn1, F4, 34=134.750, p < 0.001; Mfn2, F4, 34=80). 816, p < 0,001; Opa1, F4, 34=51.456, p=0,001).

A mitokondriális hasadáshoz kapcsolódó faktorok expressziós szintjei szintén szignifikánsan különböztek a kezelési csoportok között (Drp1, F4, 34=53.448, p < 0.001; Fis1, F4,34=116 0,313, p < 0,001). A post hoc tesztek eredményeit az 1. ábra mutatja.

Az Y-CON csoporthoz képest a mitokondriális fúzióval kapcsolatos faktorok expressziója csökkent a D-CON csoportban, és növekvő tendenciát mutatott a D-TE, D-MI és D-COMBI csoportokban.

Másrészt a mitokondriális hasadáshoz kapcsolódó Drp1 faktor expressziója megnőtt a D-CON csoportban az Y-CON csoporthoz képest. Míg a mitokondriális hasadási jelek csökkentek a TE-vel kombinált kezelés hatására, a MitoQ kezelés önmagában nem okozott jelentős változást.

A másik mitokondriális hasadáshoz kapcsolódó faktor, a Fis1 ugyanazt a csökkenő tendenciát mutatott, mint a Drp1, de önmagában a MitoQ kezelés is csökkentette.

1. ábra: A futópad gyakorlat és a mitokinon (MitoQ) hatása a mitokondriális dinamikával kapcsolatos fehérjék expressziójára D-galaktóz (D-gal) által indukált öregedő patkányok hippocampusában. (A) Reprezentatív Western blot mitokondriális fúziós és hasadási eredetű fehérjékről. (B-F) A Western-blot sávok denzitometriás analízise -Actinra normalizálva. A Western-blotban bemutatott adatok hét patkányagy átlagai.

- Az aktint belső kontrollként vizsgálták. Bonferroni post hoc tesztet használtunk az ANOVA után. Az értékek átlagok ± SEM.

a Statisztikai különbséget jelöl a fiatal kontrollcsoporthoz (Y-CON) képest. b Statisztikai különbséget jelöl a D-galaktóz csoport (D-CON) csoporthoz képest. c Statisztikai különbséget jelöl a D-galaktóz plusz futópad gyakorlat (D-TE) csoporthoz képest.

d Statisztikai különbséget jelöl a D-galaktóz plusz MitoQ (D-MI) csoporthoz képest (p < 0,05). D-COMBI; D-galaktóz plusz TE és MitoQ csoport.

3.2. A futópad gyakorlat és a MitoQ hatása a NADPH-oxidáz alegységek expressziójára a D-Gal-indukált öregedő patkányok agykéregében és hippokampuszában

Szignifikáns különbségeket figyeltünk meg a kezelt csoportok között a p22 phox immunreaktivitásában öregedő patkányok agykéregében és hippokampuszában (2. ábra) (CA3,F4, 24=18.786, p < 0).{11 }}01; kéreg, F4, 24=12.662, p < 0,001).

A kéregben a D-CON csoportok fokozott p22 phox immunreaktivitást mutattak az Y-CON csoporthoz képest, ami szignifikánsan csökkent a D-TE, D-MI és D-COMBI csoportokban.

CA3-ban a p22 phox fokozott immunreaktivitása csökkent a D-TE és a D-COMBI csoportban a D-CON-hoz képest. A p22 phox, gp91 phox és p47phox NOX alegységeinek fehérje expressziós szintjei szignifikánsan különböztek a csoportok között (p22 phox, F4, {{10}}.513, p < 0).{24} }01; gp91 phox,34=57.282, p < 0,001, F4, 34=69.249, p < 0,001).

A post hoctest eredményei azt mutatták, hogy a D-CON NOX alegységszintje jelentősen megnőtt az Y-CON-hoz képest. A NOX alegység szintje azonban minden beavatkozási csoportban alacsonyabb volt, mint a D-CON csoportban.

Különösen a p22 phox és a gq91 phox expressziója csökkent szignifikánsan a D-TE-ben a D-MI csoporthoz képest. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az edzés és a MitoQ külön-külön megakadályozza az öregedés által kiváltott oxidatív stresszt az agyban, de kombinációjuknak nincs további hatása.

2. ábra: A futószalagos gyakorlat és a MitoQ hatása a NADPH-oxidáz alegységek expressziójára D-gal indukálta öregedő patkányok agykéregében és hippokampuszában. (A1) Fényképek, amelyek a NAPDH p22 phox immunreaktivitását mutatják a D-gal-indukált öregedő állatok agykéregében és hippokampuszában minden csoportban. A fekete téglalapok az A1-ben a képek f–i és p–t szerinti részét jelzik. (A2, A3) A NADPH p22 phox festődés optikai sűrűségének kvantitatív meghatározása az agykéregben és a hippocampusban.

Bonferroni post hoc teszt ANOVA után. Az értékek átlag ± SEM.(n=5 állat). (a–e és k–o) Skálasáv=100 µm, (f–j és p–t) Skálasáv=50 µm. (B) Reprezentatív Western blot képek NADPH-oxidáz alegységekre a hippocampusban.

(C-E) A NADPH oxidáz alegységeinek mennyiségi meghatározása a hippocampusban. A Western-blotban bemutatott adatok hét patkányagy átlagai voltak. - Az aktint belső kontrollként vizsgálták. Bonferroni post hoc tesztet alkalmaztunk az ANOVA után. Az értékek átlagok ± SEM.

a Statisztikai különbséget jelöl az Y-CON csoporthoz képest. b Statisztikai különbséget jelez a D-CON csoporthoz képest. c Statisztikai különbséget jelöl a D-TE csoporthoz képest. (p < 0,05).

3.3. A futópad gyakorlat és a MitoQ hatása a GFAP-expresszióra a D-Gal-indukált öregedő patkányok agykérgében és a hippocampális fogazatban

Szignifikáns különbségeket figyeltünk meg a kezelési csoportok között a GFAP immunreaktivitásban idősödő patkányok agykéregében és hippocampalis dentate gyrusában (DG) (3. ábra) (Cortex, F4, 24=13.524, p < 0.001) ; DG, F4, 24=30.364).

A post hoc teszt eredményei azt mutatták, hogy a D-gal kezelés szignifikánsan növelte a GFAP immunreaktivitást mind a kéregben, mind a DGG-ben.

A D-CON csoporthoz képest a kéreg GFAP szintje minden intervenciós csoportban, a DG GFAP szintje pedig a D-TE és D-COMBI csoportban csökkent, míg a D-MI csoport csak a GFAP immunreaktivitásban mutatott különbséget. a kéregrégióban.

Így, bár a TE vagy a MitoQ kezelés csökkentette a D-gal által kiváltott ideggyulladást a kéregben, csak a TE beavatkozás okozott pozitív hatást a DG-ben.

For more information:1950477648nn@gmail.com