Jelen tanulmányban a galaktán exopoliszacharid (EPS) származóCistancheA KR780676-ot a potenciálja miatt értékeltékenyhíti az oxidatív stressztin vitro vizsgálatok és in vivo vizsgálatok segítségével a saccharomyces cerevisiae (vad típusú) és annakantioxidáns(sod14, sod24, tsa14, cta2 és ctt12)anti-apoptotikus(pep4 és fs14) ésöregedésgátló(sod24, tsa1 és ctt12)) izogén géndeléciós mutánsok. A Galaktán erős DPPH-t ésnitrogén-monoxid-megkötő tevékenységlCso értékkel 450, illetve 138 ug/ml. Az élesztő mutáns modellben a H,0 által generált oxidatív stresszt a tápközegben lévő galaktán nagymértékben megköti, amit spot tesztekkel, majd fluoreszcens DCF-DA festéssel és mikroszkópos vizsgálatokkal igazoltak. A galaktán kezelés az élesztő mutáns sejtekben generált ROS csökkenését eredményezte, amit a csökkent fluoreszcencia intenzitás mutat. Ezenkívül a galaktán védelmet mutatott az oxidatív károsodás ellen a H,O, -indukált apoptózis gátlása révén az élesztőmutáns törzsekben (pep4 és fs1), ami az oxidatív stressz semlegesítésével megnövelte a túlélési arányt. A kronológiai élettartam-tesztben a galactanEPS-sel kezelt WT-sejtek életképessége 8 százalékkal, míg a sod2 mutáns 10-15 százalékos növekedést mutatott, ami kifejezett öregedésgátló hatást jelez. A W. confuse KR780676-ból származó galaktán hatalmas potenciállal rendelkezik ahhoz, hogy természetes antioxidánsként használják táplálkozási, gyógyszerészeti és élelmiszer-technológiai alkalmazásokban. Tudomásunk szerint ez az első jelentés az abakteriális EPS in vivo antioxidáns tulajdonságainak mélyreható értékeléséről egy élesztő deléciós modellrendszerben.

Kattintson a Cistanche gazdagodásához az EPS-ben

Az oxidáció elengedhetetlen folyamat a biológiai folyamatok fenntartásához és az energiatermeléshez is minden élő szervezetben. A reaktív oxigéngyökök (ROS) és a reaktív nitrogénfajták (RNS) gyökök az oxigén-, illetve a nitrogénmolekulák normál katabolizmusából keletkeznek. A súlyos oxidatív stressz különféle degeneratív állapotokhoz vezet, mint például a DNS-károsodás, a sejtdegeneráció és a karcinogenezis. Ezek számos egészségkárosodást okozhatnak, mint plöregedés, szív-és érrendszeri betegségek, rák, cirrózis, érelmeszesedés, cukorbetegségés rheumatoid arthritis2-6, az antioxidánsok azok a molekulák, amelyek megkötik az élelmiszerekben vagy az élő rendszerben keletkező szabad gyököket, és megelőzik az oxidatív károsodással összefüggő egészségügyi állapotokat-9. Bár sok szintetikus antioxidáns erős gyökfogóként kapható, némelyikük összefüggésbe hozható nemkívánatos mellékhatással. Ennek fényében megnőtt az érdeklődés és az igény a természetes antioxidánsok iránt az élelmiszer- és gyógyszeriparban. A legtöbb növényi és gombaalapú poliszacharid jelentős védőanyag a ROS11–21 ellen. Különféle mikrobiális exopoliszacharidokról (EPS), köztük tejsavbaktériumokból (LAB) származó jelentős antioxidáns tulajdonságaik miatt is beszámoltak. Ezeket a szintetikus alternatívák biztonságosabb alternatíváinak tekintik. Az elmúlt években számos LAB-ból származó EPS-t tanulmányoztak antioxidáns potenciálja és az oxidatív károsodás megelőzésére vonatkozóan22,23. A Weissella EPS antioxidáns potenciáljáról és védő szerepéről is beszámoltak számos Weissella törzsből izolált EPS-ről, például Cistanche EPSWWC, W. confusa OF126, W. cibaria GA44, W. cibaria YB-1, W. confusa W4 és W. cibaria SJ1424–29. Az in vivo antioxidáns tulajdonságokat különféle modellrendszerekkel lehet tanulmányozni, például sejtvonalak30, C. elegans31, élesztő32 és egerek33 segítségével. Korábban különféle vegyületeket vizsgáltak potenciális antioxidáns tulajdonságaikra a Saccharomyces cerevisiae élesztőgén-deléciós mutáns modellrendszerrel32, 34–37.

Ez a tanulmány arra összpontosítA galaktán EPS antioxidáns potenciáljaa Cistanche KR780676 probiotikus törzs állítja elő egy hagyományos indiai fermentált élelmiszerből (Idli tészta)38,39. Ebben a cikkben a galaktán EPS-t in vitro antioxidáns potenciálra szűrik DPPH, nitrogén-oxid és hidroxil gyökfogó tesztek és in vivo antioxidáns segítségével,anti-apoptotikusésöregedésgátló tulajdonságokkalélesztő géndeléciós mutáns modellrendszer segítségével.

Anyagok és metódusok

Az összes vegyszert, beleértve a tápanyag-kiegészítőket is, a Hi-Media Laboratories Pvt.-től szereztük be. Ltd. (India) és a DCF-DA (2,7-diklór-dihidro-fluoreszcein-diacetát) a Sigmától.

Mikrobatenyésztés.CistancheEbben a tanulmányban egy indiai savas fermentált élelmiszerből (Idli tészta) izolált KR780676-ot használtak, amelyről számoltak be, hogy galaktán-EPS-t termel 38.

EPS-termelés kimutatása. A W. confusa EPS-termelését kolóniaszintről figyeltük meg. Röviden, a törzset MRS agaron tenyésztjük (2% szacharózzal kiegészítve). 48 óra elteltével 30 fokon nyálkás/nyálkás telepek megjelenését figyelték meg. A galaktán EPS termelését pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) analízissel tovább igazoltuk.

Az EPS kinyerése. Az EPS extrakciós eljárást a Kavitake et al.38 által leírt módszer szerint végeztük. Friss W. confusa oltóanyagot (10%) adtunk 2%-os szacharózzal javított MRS táptalajhoz 30 °C-on 48 órán át, statikus körülmények között. A szuszpenziót ily módon centrifugáltuk (12, 000 x g 15 percig), hogy izoláljuk a biomasszát, és triklórsavval tovább kezeljük a fehérjerészek eltávolítására. A galaktán-EPS-t jéghideg etanollal (háromszoros térfogat) kicsaptuk, centrifugáltuk (19 200 x g 15 percig), és a kapott EPS-t Milli-Q vízben oldottuk. A nyers EPS-t 12-14 kDa (48 óra, 4 fok) mellett dializáltuk, és liofilizálással fagyasztva szárítottuk 48 órán keresztül.

A galaktán EPS in vitro antioxidáns tulajdonságai. A galaktánra vonatkozó DPPH-tesztet Ye és munkatársai 9 korábbi jelentése szerint végeztük, és a százalékos tisztítóaktivitást (százalék) a következő egyenlettel számítottuk ki.

ahol Ao és As a kontroll (vak, EPS nélkül) és minta abszorbanciája. A galaktán nitrogén-oxid (NO) gyökfogó vizsgálatát Sreejayan és munkatársai 40 szerint végeztük, és a következő egyenlet szerint számítottuk ki:

ahol Ao a kontroll abszorbanciája (vak, EPS nélkül), és As az EPS jelenlétében mért abszorbancia. Csökkentő teljesítményaktivitást mértek a galaktán EPS-re, amint azt Ye és munkatársai 9. Az abszorbanciát 700 nm-en olvastuk le, és a reduktív potenciált a reakcióelegy nagy abszorpciós kapacitása jelzi. Pozitív kontrollként aszkorbinsavat (Vc) használtunk. A galaktán-EPS hidroxilgyökfogó aktivitását Yang és munkatársai 41 szerint értékelték. Az abszorbanciát 536 nm-en olvastuk le, és a szennyeződési százalékot a következőképpen számítottuk ki:

ahol A minta a minta abszorbanciája, A vakpróba a minta és H2O2-oldat hiányában mért abszorbancia, és A kontroll a minta hiányában mért abszorbancia

A galaktán EPS in vivo antioxidáns tulajdonságai élesztőmutáns törzsekben.

Az Yeast, S. cerevisiae, BY4741 vad típusú (WT) (MATa his3∆:leu2∆:met15∆:ura3∆) és géndeléciós mutáns törzseket a Thermo Fisher Scientific, USA-tól szereztük be. Az élesztőtörzseket élesztő pepton-dextróz (YPD) tápközegben tenyésztettük, 200 µg/ml Geneticinnel (G418-szulfát) vagy anélkül kiegészítve a mutánsok szelekciója céljából. Az YPD szilárd táptalajt úgy állítottuk elő, hogy 2% Bacto agart adtunk az YPD folyékony táptalajhoz42.

Az EPS hatása az élesztő növekedésére. Exponenciálisan növekvő vad típusú (WT) élesztőtenyészetet (körülbelül 1×1{2}}4 sejt) különböző koncentrációjú (0-400 ug/ml) EPS-sel kezeltünk egy mikrolyukú lemezen, és a végső térfogatot 200-ra feltöltöttük. μL YPD húslevessel. A tenyészetet 18 órán át 30 fokon inkubáltuk, majd sorozathígítást végeztünk, és YPD agarlemezeken szétterítettük. A lemezeket 30 fokon 2 napig inkubáltuk, és megszámoltuk a kolóniaképző egységeket (CFU), és az életképességet CFU43 százalékban fejeztük ki.

Az oxidatív stressz biomarkereinek mérése. Az exponenciálisan növekvő élesztő WT sejteket 300 ug/ml EPS-sel vagy anélkül előkezeltük 2 órán keresztül. Tíz esetben a sejteket 1 órán át 30 fokos rázóinkubátorban 1 mM H2O2 hatásának tettük ki, és feldolgoztuk az SOD aktivitás és a lipidperoxidációs szintek mérésére a korábbi jelentésekben leírt módszer szerint44–46.

Az EPS antioxidáns tulajdonsága S. cerevisiae géndeléciós mutánsokban.

Az élesztő WT és antioxidáns-hiányos mutáns törzsek (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆, ctt1∆, glr1∆ és yhb1∆) exponenciálisan növekvő tenyészeteit 300 ug/mL EPS-sel kezeltük 1 mM H2O2 1 órán át. A sorozatban hígított sejteket YPD agarlemezekre terítettük, 2 napig 30 °C-on inkubáltuk, és kiszámítottuk az életképességet. A foltvizsgálathoz a tenyészeteket sorozatosan hígítottuk 10-redőben, amelyből 4 μL-t YPD agarlemezekre foltoztunk, és 30 fokon 2 napig inkubáltuk, majd lefényképeztük43,47. ROS kimutatása és mérése. Az exponenciálisan növekvő WT és antioxidáns-hiányos mutáns törzseket (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆ és ctt1∆) EPS-sel vagy anélkül 2 órán át előkezeltük, majd 1 mM H2O2-nak tesszük ki 1 órán át 30 fokon. A sejtpelleteket 5000 rpm-en 5 percig centrifugáltuk, kétszer mostuk PBS pufferrel, 200 µl PBS-ben újraszuszpendáltuk, és 20 µM DCF-DA-val inkubáltuk sötétben 15-20 percig szobahőmérsékleten. Közvetlenül az inkubáció után a sejteket kétszer mostuk PBS-sel, felhelyeztük a tárgylemezekre, és Olympus Ix71 fluoreszcens mikroszkóp alatt, 40-szeres objektívvel, kék szűrő használatával megfigyeltük. A ROS mennyiségi meghatározásához a DCF DA festett sejteket 200 μl PBS-ben újraszuszpendáltuk mosás után, és spektrofluorométerrel mértük a DCF fluoreszcencia intenzitását 495/529 nm gerjesztési maximumon és emissziós hullámhosszon. A fluoreszcencia egységeket minden kezelt és kezeletlen tenyészethez képest ábrázoltuk, és összehasonlítottuk48,49.

A galaktán anti-apoptotikus aktivitása.

Spot és CFU vizsgálatok. Az exponenciálisan tenyésztett WT és anti-apop totic-deficiens mutáns (pep4∆ és fs1∆) sejteket EPS-sel előkezeltük, és a megfelelő kezeletlen kontrollokkal együtt 2 órán át inkubáltuk. A CFU-számláláshoz a tenyészeteket EPS-sel kezeltük vagy nem kezeltük 2 órán át, majd 1 órán át inkubáltuk 0,5 mM H2O2-vel. Mindegyik sorozathígítású tenyészetet YPD agarlemezekre terítettük, és 30 °C-on 2 napig inkubáltuk, és a sejtek életképességét a CFU százalékában fejeztük ki. A foltvizsgálathoz a tenyészeteket sorozathígításra hagytuk, majd YPD agarlemezekre 1 mM H2O2-val vagy anélkül. A lemezeket 30 fokon 2 napig inkubáltuk, és lefényképeztük47.

Az EPS anti-apoptotikus markerének kimutatása

élesztő mutáns törzsek felhasználásával. Az EPS élesztősejtekre kifejtett mentőhatásának további igazolására a hidrogén-peroxid által kiváltott apoptotikus sejthaláltól élesztőben, WT és anti-apoptotikus deficiens mutáns törzsek (pep4∆ és fs1∆) apoptózis markereit vizsgáltuk. Az exponenciálisan növekvő WT, pep4∆ és fs1∆ sejteket 300 µg/mL EPS-sel kezeltük vagy nem kezeltük 2 órán át, majd 1 órán át 1 mM H2O2-nak tettük ki. Mind a kezelt, mind a kezeletlen sejteket akridinnarancssárgával és etidium-bromiddal (AO/EB) festettük, és fluoreszcens mikroszkóp alatt megfigyeltük a kromatin kondenzációját50,51. A DAPI festéshez a kezelt és kezeletlen sejteket 4 százalékos paraformaldehiddel fixáltuk, és 1 ug/ml DAPI-val inkubáltuk 5-10 percig sötétben, szobahőmérsékleten. A sejteket PBS-sel történő mosás után a tárgylemezekre helyeztük, és Olympus IX71 fluoreszcens mikroszkóp alatt (UV-szűrő, 40-szeres objektív) megfigyeltük a nukleáris fragmentációt52,53.

Az EPS öregedésgátló hatása kronológiai élettartam-vizsgálattal.

Élesztő vad típusú és antioxidáns hiányos mutáns (sod2∆, tsa1∆ és ctt1∆) tenyészeteket tenyésztettünk, hogy elérjük a stacionárius fázist, és EPS-sel vagy anélkül inkubáljuk a kronológiai élettartam (CLS) vizsgálathoz. Minden törzs túlélőképességét 0 és 30 nap között különböző időintervallumokban számítottuk ki. A sejtek életképességét százalékos CFU-ban fejeztük ki mind a kezelt, mind a kezeletlen tenyészeteknél54, 55. Statisztikai analízis. Minden kísérletet három párhuzamosban (±SD) végeztünk, és statisztikailag elemeztük az IBM SPSS 20 szoftverrel egyutas ANOVA modellben. Tukey HSD összehasonlító tesztje (o<0.05) was used to measure the significance level. 

Eredmények és megbeszélés A fermentált élelmiszerekből izolált tejsavbaktériumok (LAB) az elmúlt néhány évben az élelmiszer-technológusok óriási figyelmét keltették fel bizonyított probiotikus tulajdonságaik miatt. Az indiai fermentált élelmiszerekből izolált baktériumok közé tartozik a Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp. és a kevésbé feltárt Weisella spp. A többi jótékony LAB-hoz hasonlóan a laboratóriumunkban fermentált idli tésztából izolált Cistanche KR780676 törzs potenciális probiotikum-jelöltként működik39. Korábbi jelentések szerint ezt a galaktánt lineáris homopoliszacharidként jellemezték, és fizikai-kémiai, funkcionális és emulgeáló tulajdonságaira is szűrték38,56–58. Arról is beszámoltunk, hogy a W. confusa KR780676 sejtjei és sejtfelülúszói erős antioxidáns aktivitást mutattak39. A W. confusa KR780676 EPS-termelését 2 százalék szacharózzal dúsított MRS agarlemezen figyelték meg, 48 órán át inkubálva (1A-i. ábra), amely a Weissella nyálkás telepeket tárta fel, és ezt a SEM-képen is megerősítették (a Weissella telepről). a galaktán EPS jelenlétét mutatja a sejtekkel együtt (1A-ii. ábra). Az EPS gyártás lépésről lépésre áttekintése az 1B. ábra képi ábrázolásával történik.

A galaktán EPS in vitro antioxidáns tulajdonságai. Amint az a 2A. ábrán látható, a DPPH megkötő aktivitása koncentrációfüggőnek bizonyult, a befogó aktivitás a galaktán koncentrációjával nőtt. Az aszkorbinsav fele-maximális hatásos koncentrációja (IC50) 8,8 µg/ml, míg a galaktán EPS 450 µg/ml volt. 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) egy stabil szabad gyök, amely delokalizálja a párosítatlan elektronokat a molekula egészével szemben, így megakadályozza a molekulák dimerizációját, és mélylila színt eredményez59. Ha DPPH-oldatot adunk különböző koncentrációjú (50-500 µg/ml) galaktánhoz, a koncentráció növekedésével az ibolyaszín csökken. Antioxidánsok, amikor a DPPH elektronjával reagálnak, a DPPH mélylila színe világoslila színűvé válik; a szín intenzitása pedig a szubsztrát antioxidáns aktivitásától függ60. A galaktán 60 százalékos DPPH-megkötő képességet mutatott, ami magasabb, mint a Paenibacillus polymyxa EJS endofita baktériumból származó EPS-3 (<45.40%)33.

A nitrogén-oxid akkor keletkezik, amikor a nátrium-nitroprusszidot vizes oldatban 7,2-es pH-n bomlik le. A nitrát és a nitrit aerob körülmények között keletkezik, amikor a nitrogén-monoxid oxigénnel kötődik61. Amint a 2B. ábrán látható, a galaktán képes csökkenteni a nátrium-nitroprusszidból származó nitrogén-monoxid képződését, mivel a fél maximális effektív koncentráció (IC50) 138 µg/ml, míg a standard aszkorbinsav 11 µg/ml. Amint a 2C. ábrán látható, az EPS redukáló teljesítménye pozitívan korrelál a koncentrációjával növekvő sorrendben. A standard (aszkorbinsav) nagyobb redukálóképességet mutatott, mint a galaktán EPS, ami megegyezett Ye és munkatársaival9. A galaktán redukálóképessége a potenciális antioxidáns aktivitásra utal. Ha kálium-ferricianidot [K3Fe (CN)6] adunk a galaktán EPS-hez, a benne lévő antioxidánsok kálium-ferricianiddá [K4Fe(CN)6] redukálódnak.

2. ábra. A galaktán in vitro antioxidáns tulajdonságai. (A) DPPH gyökfogó aktivitás, (B) nitrogén-oxid vizsgálat, (C) redukáló teljesítmény vizsgálat és (D) galaktán EPS hidroxil gyökfogó aktivitása.

A galaktán hidroxil gyökfogó aktivitása a 2D. ábrán látható. A galaktán 41,93 százalékot mutatott a legmagasabb aktivitásnak, míg a standard szerint 58,10 százalékot azonos koncentrációban (1 mg/ml). Az eredmények tendenciája megegyezik a Lactobacillus plantarum C88 (85,21 százalék az EPS 4 mg/ml-es koncentrációja esetén)62 és a Paenibacillus polymyxa EJS-3 (68,55 százalék az 1 mg/ml EPS-koncentráció esetén)63 EPS-re vonatkozó korábbi jelentésekkel. A standardokhoz képest a galaktán 72,16 százalékos, míg a Lactobacillus plantarum C8862 és a Paenibacillus polymyxa EJS{19}} EPS 95,19 és 68,55 százalékos hatékonyságot mutatott.

A galaktán EPS in vivo antioxidáns tulajdonságai élesztőmodellben. Korábbi jelentések a LAB64-ből származó EPS különböző egészségjavító biológiai tulajdonságait mutatták ki, például antiproliferatív, fekélyellenes, koleszterinszint-csökkentő, antioxidáns, gyulladásgátló és immunmoduláló hatásokat. Ebből a szempontból fontossá válik az EPS antioxidáns hatásának részletes értékelése, amely támogathatja prebiotikus és/vagy probiotikus potenciáljukat, főként a bél homeosztázisának fenntartásában az oxidatív stressz enyhítésével. A celluláris antioxidáns gépezet kritikus szerepet játszik a kulcsfontosságú celluláris metabolikus útvonalakon generált elkerülhetetlen ROS enyhítésében. A sejt veleszületett antioxidáns védelme és a keletkezett ROS közötti egyensúlyhiány nagyon káros lehet a sejtek számára. A súlyos oxidatív stressz potenciálisan károsítja a sejtes létfontosságú komponenseket, fehérjéket, nukleinsavakat és lipidmolekulákat, ami viszont számos lényeges jelátviteli útvonalat érint, és apoptózist indukál. Kimutatták, hogy az antioxidánsok étrendi bevitele csökkenti a sejtkárosodás markereinek, például a ROS-szintek, a ROS által közvetített DNS-károsodás, az apoptózis és a sejttranszformáció gyakoriságát, ami tovább csökkenti az életkorral összefüggő rendellenességek előfordulását. antioxidáns aktivitást mutattak ki in vitro vizsgálatokban (DPPH és hidroxilgyök vizsgálatok)5, illetve humán gyomorráksejtek BGC-823 ellen66. Korábban, ebben a tanulmányban értékeltük a W. confusa KR780676-ból izolált galaktán EPS antioxidáns, antiapoptotikus és öregedésgátló hatásait, Saccharomyces cerevisiae BY4741 élesztőt használva modellszervezetként.

Az EPS hatása az élesztő növekedésére. A különböző koncentrációjú EPS-sel kezelt vad típusú élesztősejtek nem mutattak növekedési rendellenességet, ami megerősítette, hogy a galaktán nem váltott ki citotoxicitást vagy növekedési rendellenességeket a 0 és 400 ug/ml közötti koncentrációk egyikében sem (3A. ábra). ). A 300 ug/ml vagy magasabb koncentrációjú galaktánnal kezelt sejtek szignifikánsan nagyobb növekedést mutattak, ami azt jelzi, hogy a galaktán élesztőnövekedést serkentő aktivitással rendelkezik.

Az élesztőtörzsekkel végzett további kísérletekhez 300 ug/ml galaktán-koncentrációt használunk. A galaktán csökkenti az SOD enzimaktivitást. A galaktán EPS által mutatott erős in vitro antioxidáns aktivitást követően tovább vizsgáltuk az élesztő WT-sejtek SOD-aktivitására gyakorolt ​​hatását. Eredményeink (3B. ábra) azt mutatják, hogy a H2O2-kezelés által kiváltott oxidatív stressz a H2O2-kezelt WT-sejtek SOD-aktivitásának éles növekedését okozta a kezeletlen sejtekhez képest. Ezzel szemben a WT-sejtek galaktános előkezelése, majd H2O2-nak való expozíciója az SOD-aktivitás kétszeres csökkenését eredményezte a H2O2-vel önmagában kezelt sejtekhez képest, ami azt jelzi, hogy a galaktán segít az élesztősejteknek a szuperoxidgyök által kiváltott oxidatív kezelésben. stressz47,67.

Oxidatív stresszperoxidos kezelés hatására aktiválódik a szuperoxid enzim, és az SOD aktivitás szintjének változása a celluláris oxidatív stressz szintjének közvetlen mértéke. Ebben a vizsgálatban az NBT redukciós módszert alkalmaztuk, ahol az NBT a szuperoxidgyök képződés indikátora. Az NBT redukció gátlása az SOD közvetlen mértéke. Mivel az SOD verseng az NBT-vel a szuperoxid gyökökért, amelyek a riboflavin látható fénynek való kitétele révén keletkeznek oxigén és metionin jelenlétében, amely elektrondonor. A szuperoxid az NBT-t kék színű termékké, a formazánná redukálja, amely 560 nm-en kolorimetriásan mérhető.

Korábbi jelentések azt mutatják, hogy a LAB EPS koncentrációfüggő módon antioxidáns hatást fejtett ki in vitro vizsgálatokban, vastagbélrák sejtvonalakban és in vivo modellekben. Az EPS azon képessége, hogy megköszörülje a ROS-t, különféle kémiai csoportjainak tulajdonítható68. A Bacillus amyl cseppfolyósítóból származó EPS-ek (500 µg/ml) más részeiről kimutatták, hogy nagymértékben befolyásolja az SOD aktivitást, és megvédi a HepG2 sejteket a H2O2 68 által kiváltott oxidatív stressztől. Hasonlóképpen, az L. plantarumból származó EPS koncentrációfüggő hatást mutatott a Caco2-sejtek SOD-aktivitására a H2O{9}}indukált oxidatív stressz ellen69. Eredményeink, összhangban ezekkel a jelentésekkel, azt mutatják, hogy a galaktán EPS előkezelés megköti a H2O2 kezelés által indukált szuperoxid gyököket élesztő WT sejtekben.

Az EPS csökkenti a sejtek lipidperoxidációját. A malondialdehid (MDA) a legtöbbet tanulmányozott celluláris lipid-peroxidációs biomarker, amely az oxidatív stressz szintjét jelzi. Az MDA egy kémiailag stabil, nagyon reaktív dialdehid, amely könnyen kötődhet fehérjékhez, nukleinsavakhoz és lipoproteinekhez. Erősen mutagén, és nagymértékben befolyásolhatja ezen biomolekulák biokémiai tulajdonságait, ami káros a különböző jelátviteli útvonalakra70. Az MDA-szint emelkedése a ROS által kiváltott szövetkárosodás indikátora, és ennek megnövekedett szintje számos humán patológiában kimutatható46. Ebben a tanulmányban annak vizsgálatára, hogy az EPS előkezelés hogyan befolyásolja a H2O2 által kiváltott lipidperoxidációt élesztő WT sejtekben, MDA szinteket becsültünk meg. Az eredmények körülbelül 1.{7}}-szeres csökkenést mutattak az MDA-szintben az EPS-sel előkezelt sejtekben, összehasonlítva azokkal, amelyek csak H2O2-nak voltak kitéve, amint az a 3C. ábrán látható.

Korábban kimutatták, hogy az L. plantarum C88-ból származó EPS dózisfüggő módon (50-200 ug/ml) csökkenti a H2O2-kezelés által kiváltott MDA-szintet a Caco2 sejtekben, ami arra utal, hogy a peroxid által kiváltott membránsérülés a bélsejtekben enyhíthető az EPS69 kiegészítésével (zhang 2013). Továbbá a B. amyloliquefaciens-ből származó 500 ug/ml EPS szignifikánsan csökkentette a H2O2-indukált MDA-t a HepG2 sejtekben71. Az élesztősejtek H2O2-indukálta MDA-szintjére és annak jelentős csökkenésére vonatkozó eredményeink a sejtek galaktán-EPS-sel történő előkezelését követően azt mutatják, hogy a galaktán-EPS-sel végzett kezelés csökkenti a sejtes ROS által kiváltott lipidperoxidációt, és védheti a sejteket. a peroxid gyökök által okozott szövetkárosodástól, és segít a sejtek integritásának megőrzésében

kísérletek. *P-t képviseli<0.0001 a signifcant increase/decrease in EPS+ H2O2 treated samples compared to those treated with H2O2 alone.

A galaktán megvédi az élesztő antioxidáns génmutánsait az oxidatív stressz alatt. A galaktán antioxidáns képességének értékelése érdekében különböző antioxidáns génhiányos élesztőmutánsokat (amelyek nem tartalmaznak különféle oxidatív stresszválasz géneket) galaktánnal kezeltek, majd szubletális H2O2 42 dózisnak tettek ki. SOD (sod1∆ és sod2∆), kataláz (cta1∆ és ctt1∆), tioredoxin-peroxidáz (tsa1∆), glutation-reduktáz (glr1∆) és nitrogén-monoxid-oxidoreduktáz (yhb1∆) mutánsok H2O2-val kezelve. alacsony túlélést mutatott (sod1∆ 10,8 százalék , sod2∆ 13,17 százalék , tsa1∆ 13,55 százalék , cta1∆ 15,34 százalék , ctt1∆ 17,06 százalék , glr1∆ 27,37 százalék ellen W.7.318 százalék , glr1∆ 27,37 százalék yhb∆ Ezzel szemben a galaktán előkezeléssel az összes antioxidáns génhiányos mutánsnál nőtt az oxidatív stresszel szembeni tolerancia, és szignifikánsan nőtt az életképességük (sod1∆ 78,43 százalék, sod2∆ 59,96 százalék, cta1∆ 87 százalék, ctt1∆ 817 százalék). ∆ 72,73 százalék, glr1∆ 75,26 százalék és yhb1∆ 82,41 százalék), amint az a 4A. ábrán látható. Az eredmények azt sugallják, hogy a galaktán hatékonyan képes megkötni a H2O2 által indukált szabad gyököket olyan mutánsokban, amelyek nem rendelkeznek specifikus oxidatív stresszválasz génekkel, és megvédi a sejteket az oxidatív stressztől. Hasonló védelmet figyeltek meg a spot vizsgálatban, ahol a galaktán megmentette a mutánsokat az oxidatív stressztől, és növelte az életképességet, amint az a 4B. ábrán látható.

A sejteket enzimatikus antioxidáns védelmi rendszerekkel fejlesztik ki, hogy ellenálljanak a különböző fiziológiai reakciók során keletkező ROS által okozott endogén oxidatív stressznek, amely egyébként káros hatással lenne a sejt jólétére. Korábbi jelentések és ebben a tanulmányban elért eredményeink arra utalnak, hogy az EPS képes megkötni a ROS-t és javítani a sejtek életképességét. Élesztő oxidatív stresszválasz mutáns törzsekkel végzett eredményeink arra utalnak, hogy a galaktán EPS kezelés a H2O2 kezelés által kiváltott citoszol és mitokondriális szuperoxid gyököket is megköti, amit az élesztő sod1∆ és sod2∆ mutáns törzsek életképességének növekedése bizonyít. Az SOD-ok elsődleges enzimatikus antioxidáns védelmet jelentenek a sejtekben az endogén és exogén oxidatív stressz ellen, és ezeknek a géneknek a mutációi szerepet játszanak a rákban és a degeneratív rendellenességekben. Hasonlóképpen, a cta1∆ és ctt1∆ (kataláz mutánsok) antioxidáns megmentése EPS-kezeléssel azt jelzi, hogy a galaktán-EPS-kezelés védelmet nyújt a H2O2 által kiváltott peroxiszómális és citoszolos oxidatív stressz ellen. A kataláz felelős a hidrogén-peroxid sejtszintű méregtelenítéséért, hiánya pedig az életkorral összefüggő rendellenességek kialakulásához kapcsolódik. A TSA1, a tioredoxin-peroxidáz egy riboszómális asszociált és szabad citoplazmatikus fehérje, amely megszabadítja a sejteket a hidrogén-peroxid stressztől. A jelentések arra utalnak, hogy a TSA1 szerepet játszik az oxidatív DNS-károsodás helyreállításában is. Eredményeink arra utalnak, hogy az EPS kezelés megmenti az élesztő tsa1∆ sejteket a peroxid által kiváltott stressztől. Az emlősök peroxiredoxinjai pozitív hatással vannak a sejtnövekedésre, az anyagcserére és az immunfunkciókra. Hiányuk megnövekedett celluláris oxidatív stresszt eredményez, amely befolyásolja a kulcsfontosságú jelátviteli útvonalakat, és szerepet játszik neurodegeneratív rendellenességekben, rosszindulatú daganatokban és gyulladásos betegségekben 72. A glutation antioxidáns mechanizmus egy másik első vonalbeli enzimatikus antioxidáns védelmi rendszer, amely a sejtekben jelen van az oxidatív stressz leküzdésére. A GLR1 az emlős glutation-reduktáz élesztő homológja, amely mind a citoszolban, mind a mitokondriumban lokalizálódik73. A Glr az oxidált glutationt (GSSH) redukált glutationná (GSH) redukálja, és szerepet játszik a GSH szintjének fenntartásában a sejtekben, ami viszont méregteleníti a szuperoxid- és hidroxid gyököket, így védi a sejteket az oxidatív stressztől74. Eredményeink azt mutatják, hogy az élesztő glr1∆ nagy érzékenysége H2O2-ra, amit a galaktán EPS-sel végzett előkezelés enyhített, ami arra utal, hogy a galaktán EPS megvédheti a GLR1 hiányos sejteket az oxidatív stressztől. Érdekes módon a glutation-reduktáz hiánya szerepet játszik az öregedésben és az életkorral összefüggő anyagcsere-, degeneratív és kardiovaszkuláris rendellenességekben75,76. Amint az a 4A. ábrán látható, az yhb1∆-t galaktán EPS is védte a H2O2 stressz ellen, ami arra utal, hogy a galaktán EPS megvédi az YHB1 hiányos sejteket az oxidatív stressztől. Az YHB1 élesztő egy kedvenc hemoglobin, amelyről a jelentések szerint megvédi a sejteket a nitrogén-monoxid-stressztől77 és az oxidatív stressztől78. A bizonyítékok arra utalnak, hogy az YHB1 humán homológja megmenti a sejteket az alfa-synuclein toxicitástól, amely a Parkinson-kór biomarkere79. Ezek a korábbi megállapítások és eredményeink arra utalnak, hogy az EPS elősegítheti a sejtek túlélését a degeneratív rendellenességek kialakulásával szemben.

A galaktán jelenlétét és hiányát tartalmazó élesztőmutánsok ROS szintjének meghatározásához H2O2 stressz alatt az élesztősejteket fluoreszcens mikroszkóp alatt figyeltük meg, és az intracelluláris oxidációs szintet spektrofluorométerrel számítottuk ki47,48. A csak H2O2-val kezelt élesztőmutánsok több zöld fluoreszcens sejtet mutattak a galaktánnal előkezeltekhez képest. (4C. ábra). A DCF fluoreszcencia intenzitása hozzávetőleg 60 százalékkal nőtt, míg a galaktán előkezeléssel körülbelül 30 százalékra csökkent a H2O2--kezelt élesztőmutánsokban a WT-hez és a megfelelő kontrollhoz képest (4D. ábra). Mind a mikroszkópos, mind a spektrofotometriás eredmények a ROS megnövekedett szintjét jelzik azokban a sejtekben, amelyekben hiányoznak a specifikus antioxidáns gének a megfelelő kontrollokhoz képest. A galaktánnal előkezelt, majd H2O2-nak kitett tenyészetek csökkent fluoreszcenciát mutattak a galaktán előkezelés nélküliekhez képest, ami arra utal, hogy a galaktán csökkentette a ROS indukciós H2O2 expozíciót élesztő mutáns sejtekben, és elősegíti a sejtek túlélését. A fenti kísérletek mindegyikében, amikor a sejteket H2O2 hozzáadása előtt megmostuk, nem mutatkozott jelentős megmentés (kiegészítő adatok), ami arra utal, hogy a galaktán ROS-megkötése a tápközegben történő közvetlen megkötésnek köszönhető, nem pedig az intracelluláris hatásnak.