Az oxidatív stressz a különféle anyagcsere-betegségek egyik jelentős előfutára 2. rész

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

3. Megbeszélés

A szabad gyökök megtámadhatják a fehérjéket, lipideket vagy DNS-t, hogy elektront szerezzenek, ami különféle egészségügyi problémákhoz vezethet. Emiatt elengedhetetlen a szervezet antioxidáns rendszerének és az oxidáció során keletkező szabad gyökök egyensúlyának megteremtése. Ennek az egyensúlynak a megromlása esetén oxidatív stressz lép fel [29]. Az oxidatív stressz az egyik fő tényező, amely különféle krónikus betegségeket, például rákot, cukorbetegséget, szív- és érrendszeri betegségeket, Alzheimer-kórt stb. eredményez. Míg az emberi szervezetben léteznek ön-antioxidáns rendszerek a szövetek és szervek oxidatív károsodásának leküzdésére, ezek a védekezések A rendszerek veszíthetnek hatékonyságukból különböző körülmények miatt, mint például a túlzott alkoholfogyasztás, dohányzás, stressz, krónikus droghasználat, sugárzás stb. [30]. Különböző tudományos jelentések kimutatták, hogy a másodlagos növényi metabolitok jelentős szerepet játszanak az oxidatív stressz és annak káros hatásainak megelőzésében [13,14,31] Noha a biológiai hozzáférhetőség fontos paraméter, amely befolyásolja ezen vegyületek bioaktivitását, ezt nem vették figyelembe a vizsgálatban. a legtöbb tanulmány. Jól ismert azonban, hogy a másodlagos metabolitok szerkezeti átalakulásoknak vannak kitéve a különböző pH-viszonyok, enzimaktivitás és testhőmérséklet miatt a gyomor-bélrendszerben. Ezenkívül a másodlagos metabolitok kémiai jellemzői, mint például a molekulatömeg, a polaritás és a növényi mátrixban lévő makromolekulákhoz való kötődés mértéke szintén jelentős tényezők, amelyek befolyásolják biológiai hozzáférhetőségüket [13]. Ennek megfelelően a vegyületek vagy metabolitjaik felszívódása a véráramba, miután lenyelték, elengedhetetlen a szisztémás élettani hatások kifejtéséhez. Az in vitro emésztést szimulációs modellek bizonyítékkal szolgálhatnak az anyagok lehetséges biológiai hozzáférhetőségi jellemzőinek értékeléséhez. Míg bármely funkcionális tulajdonság állítása érdekében humán kísérletekben megerősítésre van szükség, az in vitro szimulációs modelleket széles körben használják az in vivo vizsgálatok vagy a humán kísérletek alternatívájaként, amelyek etikailag gyakran vitathatóak, erőforrás-igényesek, költségesek és időigényesek [32].

További információért kattintson ide

Számos kutató vizsgálta a Cistus fajok különböző szerveiből készített kivonatok antioxidáns potenciálját is. A szakirodalmi felmérés szerint ez az első tanulmány a Cistus fajokon a fenolos anyagok biológiai hozzáférhetőségéről és az antioxidáns aktivitásra gyakorolt ​​hatásáról in vitro emésztési szimulációs modell alkalmazásával. Karas et al. [33] azt javasolta, hogy a polifenolos komponensek 10 százaléka emésztetlenül marad a növényi mátrixban, és 90 százalékuk emésztésre kerül a gyomor- vagy bélfázisban (körülbelül 48 százalék, illetve 52 százalék). Mint korábban említettük, az in vitro humán emésztési szimulációs eljárás a vizes kivonatokban lévő összes fenolos mennyiséget negatívan befolyásolta. Így az összes kivonat biológiailag hozzáférhető mintáinak fenoltartalmában jelentős veszteségek mutatkoztak. Ezenkívül az IN minták összes proantocianidinkoncentrációja minden vizes kivonatban a kimutatási határ alatt volt. Különböző tanulmányok is felvetik az emésztési eljárás negatív hatását a növényi kivonatokban lévő fenolos vegyületekre és ezzel a kapcsolódó bioaktivitásokra. Például közöltük a Salvia virgata Jacq teljes fenoltartalmát. előző vizsgálatunkban az emésztési eljárás is hátrányosan befolyásolta. Ezenkívül a kivonat fő metabolitjainak, azaz a rutinnak és a rozmarinsavnak a mennyisége csökkenni kezdett [13]. Ezzel szemben számos tanulmány egymásnak ellentmondó eredményekről számolt be. Celeb et al. [34] megfigyelték az összes fenolsav, flavonoid és fenol mennyiségének növekedését a Hypericum perfoliatum L-ből származó metanolos kivonat biológiailag hozzáférhető mintáiban. Valójában a fő metabolitok, a kvercitrin, a klorogén és a galluszsav biológiai hozzáférhetőségi aránya 100 felett volt. százalék . Ezek a vizsgálatok kimutatták, hogy az emésztési eljárás hatásai a növényi anyagoktól függően változhatnak. E különbségek tisztázása érdekében elengedhetetlen az emésztőrendszer fenolos anyagokra gyakorolt ​​hatásmechanizmusának átgondolása. (a bioflavonoidok előnyei) Serra et al.[35] azt sugallta, hogy a fenolos vegyületek főként glikozidokban, polimerekben és észter formákban találhatók meg a növényi mátrixban, és felszívódás előtt az emésztőrendszerben hidrolizálódnak. Különféle tényezők befolyásolhatják a fenolos vegyületek szerkezeti átalakulását a gyomor-bél traktusban. Például a nagyobb molekulatömegű vegyületeket, mint például a proantocianidinek vagy procianidinek, hidrolizálni kell a bélben való felszívódás előtt. A növényi mátrix szerkezete is kiemelkedő tényező a fenolok biológiai hozzáférhetőségében; (vegyél cistanche-tA fenolos vegyületek kötődhetnek a növényi mátrixban lévő makromolekulákhoz, például rostokhoz, fehérjékhez és lipidmolekulákhoz. Így csak a mátrixból felszabaduló fenolos komponensek válhatnak felszívódóvá a gyomor-bél traktusból. Ezen túlmenően a fenolos vegyületek kémiai szerkezetének átalakulását befolyásoló egyéb döntő tényezők közé tartozik az eltérő pH-érték és a bélmikrobióta enzimatikus hatása [36]. Ezen adatok tükrében feltételezhetjük, hogy a hasonló típusú kísérleti vizsgálatok során kapott eltérő eredmények az emésztőrendszer összetettségéből és a növényi mátrix összetételéből fakadhatnak. A 3. táblázat szerint a Cistus kivonat biológiailag hozzáférhető mintái alacsonyabb fenoltartalmuk miatt gyengébb antioxidáns aktivitást mutattak, mint a nem emésztett és a gyomor utáni társaiké.

Cistanchetudjavítja az immunitást

Ezenkívül a C. salufolius mindkét kivonata jobb antioxidáns aktivitást mutatott a DPPH, CUPRAC, FRAP és TOAC vizsgálatokban, mint más fajok. Emellett a C. paroiforus mindkét kivonata magasabb DMPD gyökfogó aktivitást mutatott, mint más fajok kivonata. Amint az 1. táblázatban látható, az összes fenol, flavonoid,cistanche bienfaitsés a C. salviifolius fenolsav tartalma magasabb volt, mint a többi mintában. Így a C. salviifolius kivonat magasabb antioxidáns potenciálja összefüggésbe hozható a fenoltartalmával.

Ezenkívül a biológiailag hozzáférhető minták antioxidáns potenciáljának csökkenése, a szénhidrátokkal kapcsolatos enzimek gátló hatása és AGE-ja összefüggésbe hozható a marker flavonoid glikozidok csökkenésével. A Cistus-kivonatok azonban más fenolos anyagokat is tartalmaztak, amint azt az 1. ábra mutatja. Ezért a kivonatok részletes kromatográfiás elemzése szükséges az emésztés biológiai aktivitásra gyakorolt ​​hatásának nyomon követéséhez.

A növényi kivonatok emésztőenzimekre gyakorolt ​​gátló hatása a közelmúltban nagyobb figyelmet kapott a szintetikus inhibitorok biztonsági aggályai miatt. Ezért a növényi kivonatok gátló hatását számos tanulmányban meghatározták, és ezt a hatást általában fenolos anyagokkal, például flavonoidokkal, fenolos savakkal, proantocianidinekekkel stb. társították. Sun et al. [37] azt javasolta, hogy a polifenol vegyületek úgy fejtik ki gátló hatásukat, hogy hidrofób erők és nem kovalens kötések segítségével kötődnek a fent említett enzimekhez. Ezért az o-amiláz és a-glükozidáz enzimaktivitás polifenolok általi gátlása a molekulaszerkezetükhöz kapcsolódik. Míg ezt a kölcsönhatási mechanizmust különböző technikákkal, például gátlási kinetikával, molekuláris dokkolással, fluoreszcencia kioltással stb. tanulmányozták, még nem született biztos következtetés [38]. Számos tanulmány számolt be azonban arról, hogy a növényi kivonatok emésztőenzim-gátlása közvetlenül összefügg azok fenoltartalmával. A Cistus fajok enzimgátló aktivitásáról korábban is beszámoltak hasonló tanulmányokról. Sayah et al. [39] a C. monspeliensis és C. saluifolius 8{{10}} százalékos metanolos és vizes kivonatainak -amiláz és -glükozidáz gátló hatását vizsgálta. Eredményeik összhangban voltak a jelen vizsgálattal, és azt mutatják, hogy a C. salvifolius vizes kivonata magasabb o-glükozidázt (ICso ug/mL:0.95±0.14) és -amilázt (IC5{) mutatott. {55}} ug/mL: 217,1±0,15) gátló aktivitás, mint a C. monspeliensis vizes kivonat (IC50 ug/mL∶ 14,58±1,26), illetve （IC50 4g/mL:886,10±0,10). Mindkét vizes kivonat gátlási aránya ezen enzimeken magasabb volt, mint a referenciavegyület akarbózé (ICso ug/mL:18,01±2.00) A mi vizsgálatunkhoz hasonlóan korrelációt találtak az enzimgátlási arányokkal és az összértékkel. fenol és flavonoid mennyiségben. A C. saloijfolius vizes kivonat összes fenol- és flavonoidtartalma (408,43±1,09 mg GAE és 140.{39}}±1,15 RE) magasabb volt, mint a C.monspeliensis vizes kivonat (261,76±1,9 mg GAE és GAE) 78.00±1,15 RE). Orhan et al. [40] a C.laurifolius leveleiből származó 80 százalékos vizes és etanolos kivonatok emésztőenzim-gátló képességét is vizsgálta. Eredményeik szerint a 80 százalékos etanolos kivonat (71,7 százalék ±0,6) erős amiláz-gátló aktivitást mutatott a vizes kivonathoz (39,3 százalék ±2,2) képest 1 mg/ml koncentrációban. Azt javasolták, hogy a fenolos vegyületek, különösen a flavonoidok közvetlenül befolyásolják az inzulinszekréciót azáltal, hogy megakadályozzák a béta-sejtek apoptózisát és támogatják az antidiabetikus aktivitást. Ez a hipotézis, amely korrelál az eredményeinkkel, azt jelzi, hogy a C. salviifolius vizes kivonatainak ND mintája mutatta a legmagasabb összes flavonoid- és fenoltartalmat, valamint a legnagyobb -amiláz és o-glükozidáz gátló hatást. A 4. táblázat szerint a C. salviifolius vizes kivonata jobb emésztőenzim-gátló hatást mutatott, mint a többi kivonat. Ezenkívülcistanche koleszterinA vizes kivonatok IN mintái alacsonyabb fenol- és flavonoidmennyiséget tartalmaztak, mint az ND minták, így jelen munkában alacsonyabb enzimgátló aktivitást mutattak ki. Míg a kivonatok fenoltartalmát az emésztési eljárás negatívan befolyásolta, mégis jelentős emésztőenzim-gátló aktivitást mutattak. Számos tanulmány szerint a flavonoid glikozidok a növényi kivonatok fő metabolitjai, amelyek erős -amiláz és -glükozidáz gátló potenciállal rendelkeznek[41-43] Míg a fenolos vegyületek emésztőenzimekre gyakorolt ​​gátló mechanizmusa még nem derült ki, szerkezete aktivitás-kapcsolati vizsgálatokat végeztek néhány fenolos komponensen, például flavonoidokon, fenolosavakon, proantocianidineken és tanninokon. A flavonoidokkal kapcsolatos szerkezet-aktivitás kapcsolati vizsgálatok kimutatták, hogy a C-gyűrű C2=C3 kettős kötése fokozza az ilyen vegyületek emésztőenzim-gátló potenciálját. Mivel ez a kötés növeli az elektronsűrűséget, megnő a flavonoid és az enzim közötti kölcsönhatás erőssége [44]. Ezenkívül a C-5 és C-7 hidroxilcsoportjai elősegítik a flavonoidok -amiláz gátló potenciálját. Azt is javasolták, hogy a flavonoidok vázának hidroxilezése pozitívan befolyásolja az a-amiláz és -glükozidáz enzim gátló potenciálját[45]. Amint azt korábban jeleztük, a jelen vizsgálatban szereplő összes flavonoid marker olyan flavonol-glikozid volt, amely megfelel a fent leírt szerkezeti követelményeknek. Azonban az in vitro emésztési eljárást követően a kapcsolódó aktivitásuk jelentősen csökkent a vizes kivonat biológiailag hozzáférhető mintáiban.

Általánosságban elmondható, hogy a növényi kivonatok AGE-re gyakorolt ​​gátló képessége több tényezővel is összefügg, pl. fenoltartalmukkal, antioxidáns potenciállal, fémkelátképző képességgel, fehérjekölcsönhatásokkal és AGE receptor blokkoló aktivitásukkal [13]. A 4. táblázat szerint a vizes kivonatok biológiailag hozzáférhető mintái alacsonyabb AGE gátló aktivitást mutattak az ND mintákhoz képest, mivel az in vitro emésztési eljárás hátrányosan befolyásolta a kivonatok fenoltartalmát. A jelenlegi vizsgálati eredmények szerint a C. vizes kivonatának ND mintája (cistanche és tongkat ali reddit) saluifolius rendelkezett a legmagasabb AGE-gátló aktivitással, valamint összes fenol- és flavonoidtartalommal. Összehasonlításképpen a C. monspeliensis vizes kivonatának IN mintája mutatta a leggyengébb AGE gátlási potenciált, ami a legalacsonyabb összes flavonoid és fenol tartalmának tulajdonítható. Mivel a flavonoidok széles körben elterjedtek a növényi kivonatokban, gyümölcsökben, zöldségekben és italokban, számos tanulmány felerősítette a flavonoidoknak az AGE képződményeket gátló potenciálját. Ugyanazokat a flavonoidokat, amelyeket ebben a vizsgálatban marker fenolokként jelöltek meg, más vizsgálatokban is jelentették markervegyületekként[46-48].

Az emésztőenzim-gátláshoz hasonlóan a flavonoidok AGE gátló aktivitását a C2=C3 kettős kötés, valamint az A és C gyűrűk hidroxilációja serkentette. Azonban a cukornak a flavonoid vázhoz való kötődése csökkent gátló aktivitáshoz vezet [49]. Másrészt Cervantes-Lauren és társai.[50] azt sugallta, hogy a glikozidok flavon{5}} nagyobb AGE-gátló potenciállal rendelkezik, mint a többi flavonoid glikozid. Ez a hipotézis magyarázata lehet a biológiailag hozzáférhető minták csökkent AGE gátlásának. Például a kvercitrin és a hiperozid nem volt kimutatható a C. monspeliensis vizes kivonatának biológiailag hozzáférhető mintáiban, ami az oka annak, hogy a C. monspeliensis IN mintái alacsonyabb aktivitást mutatnak más fajok kivonataihoz képest. Annak ellenére, hogy a C. saloifolius vizes kivonatában a kvercitrin nem volt kimutatható, szignifikánsan nagyobb mennyiségű hiperozid és salidrozid lehet az oka annak magas AGE-gátló aktivitásának. Általánosságban elmondható, hogy pozitív korrelációt figyeltek meg a minták marker flavonoid tartalma és azok AGE-kon való gátló potenciálja között.

4. Anyag és módszer

4.1.Vegyi anyagok

A kísérletekben használt összes referenciaanyagot, enzimet és vegyszert a Sigma Chemical Co.-tól (St. Louis, MO, USA) szereztük be. A kísérletekhez analitikai minőségű anyagokat használtunk.

4.2. Növényminták

A C.creticus és C.saloifolius légi részeit a Yeditepe Egyetem campusáról (Kayisdagi, Isztambul) gyűjtötték be 2018 áprilisának utolsó hetében. A C.mon-speliensis és C. paroiflorus légi részeit az Alacant Kutlu Aktas közeléből gyűjtötték össze. Balaji, Cesme, Izmir 2018. május második hetében. A C. laurifolius légi részeit a Kemer-Doganhisar úton, Konyában gyűjtöttük be 2018. június első hetében. Prof. Dr. Erdem Yesilada hitelesítette a növényi anyagokat. A C. creticus (YEF18013), a C. Lauri folium (YEF18017), a C.monspeliensis (YEF18015), a C.paroiflorus (YEF18016) és a C.salvifolius (YEF18014) utalványmintákat a Pharmacognoy Department of Pharmacognoy Herbariumában tárolták. Gyógyszerész, Yeditepe Egyetem, Isztambul, Törökország. 4.3.Kivonási eljárás

A vizes extrakciót választották, mivel a hagyományos gyógyászatban előállítási technikaként használják. A Cistus fajok levegőn durván szárított és porított részeit (100 g) forró desztillált vízzel (80 fok, 1,5 L) rázóberendezéssel 15 percig extraháltuk. Ezután a vizes extraktumokat szűrőpapíron átszűrjük, és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A liofilizálási eljárás befejezése után a kivonatokat desztillált vízben feloldottuk további feldolgozás céljából (nem emésztett minta: ND) (a kivonatok hozama: C.creticus esetében 13,04%, C.laurifolus esetében 15,7%, C. monspeliensis esetében 12,8%. 14,94 százalék a C. parviflorus esetében, 14,74 százalék a C. salvifolius esetében). 4.4. In vitro emberi emésztés szimulációs módszer

A humán emésztési szimulációs modellt Cistus mintákra in vitro alkalmaztuk Celeb és munkatársai által korábban részletezett módszert követve.[34] Először 1 g NaCl-t és 1,6 g pepszint oldottunk fel 500 ml desztillált vízben, hogy szimulált gyomornedv-oldatot (SGF) kapjunk. Később az SGF-oldat pH-ját 2-re állítottuk be HCl-lel (5 M); ebből az oldatból 17,5 ml 2,5 ml növényi mintával kevertük össze, és ezt a keveréket 37 fokos rázóvízfürdőbe helyeztük 2 órára, hogy utánozzuk az emésztőrendszer perisztaltikus mozgásait. 2 óra elteltével a mintákat jeges fürdőbe helyeztük az enzimreakciók inaktiválására; a mintákból 2 ml-t félretettünk gyomor utáni (PG) mintaként további kísérletekhez. A hideg mintaoldatokban megfelelő mennyiségű NaHCO3-mal (1 M, pH 7) töltött cellulóz dialízis membránt helyeztünk el; így a gyomor-bélrendszeri felszívódást utánozták. Ezután 4,5 ml epesav/pankreatin oldatot adtunk az oldatokhoz, és az elegyet további 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Végül a dialízis membránon belüli folyadékot „biológiailag hozzáférhető” mintaként (IN) vettük fel. Az eljárás befejezése után az összes mintát -20 fokon megőriztük további kísérletekhez. 4.5. A fenolos profil in vitro becslése 4.5.1. Összes fenoltartalom vizsgálat A minták teljes fenoltartalmának spektrofotometriás meghatározását egy 96-lyuklemez-sablonban végezték el Barak és munkatársai által korábban részletezett módszer szerint【32】; 75 uL NagCO3 (20 százalék H2O-ban). ) 20 μl frissen készített mintához és referenciaoldathoz adtuk. Ezután 100 μl Folin-Ciocalteu reagenst kevertünk össze a keverékkel. Szobahőmérsékleten, sötétben 30 perces inkubálás után az abszorbanciát 690 nm-en mértük. Referenciaoldatként gallusavat használtunk különböző koncentrációkban a kalibrációs görbe felállításához, és a teljes fenoltartalmat galluszsav-ekvivalensben (GAE) fejeztük ki. 4.5.2. Total Flavonoid Content Assay A minták teljes flavonoid tartalmának spektrofotometriás meghatározását egy 96-lyuklemez sablonon végezték el Bardakci és munkatársai által korábban kifejtett módszer szerint. 【51】; 150 µl 75 százalékos etanolt, 10 µl alumínium-kloridot és 10 µl 1 M nátrium-acetát-trihidrátot külön-külön 50 µl mintával és referenciaoldattal kombináltunk. Ezután ezeket a keverékeket sötét szobahőmérsékleten 30 percig inkubáltuk. Az inkubációs periódus után az abszorbanciát 405 nm-en számítottuk ki. A kvercetint referenciaoldatként különböző koncentrációkban alkalmaztuk a kalibrációs görbe felállításához, és a teljes flavonoid tartalmat kvercetin ekvivalensként (QE) ábrázoltuk.

4.5.3. Összes fenolsavtartalom vizsgálat

A minták összes fenolsavtartalmát spektrofotometriásan mértük a korábban Barak és mtsai. [52]. Először is megfelelő mennyiségű nátrium-nitritet és nátrium-molibdátot oldottunk fel desztillált vízben, hogy megkapjuk az Arnow-reagenst. Ezután a minták 1 ml-ét 1 ml Arnow-reagenssel, 1 ml 0,1 M HCl-lel és 1 ml 1 M NaOH-val külön-külön egyesítjük. Ezt követően a keverék térfogatát desztillált vízzel 10 ml-re állítottuk be, és az abszorbanciát azonnal leolvastuk 490 nm-en. Kávésavat használtunk referenciaoldatként különböző koncentrációkban a kalibrációs görbe elkészítéséhez, az összes fenolsav-tartalmat pedig kávésav-ekvivalensként (CAE) adtuk meg.

4.5.4. Teljes proantocianidintartalom vizsgálata

A minták teljes proantocianidintartalmának spektrofotometriás meghatározását egy 96-lyuklemez-sablonban végeztük Barak et al. [11]. Röviden, a mintaoldatokból 25 ul-t összekevertünk 150 ul 4 százalékos vanillin és 75 ul HCl oldattal (32 százalék). Sötétszoba-hőmérsékleten 15 perces inkubálási idő után az abszorbanciát 492 nm-re állítottuk be. A katechin-hidrátot referenciaoldatként használtuk különböző koncentrációkban a kalibrációs görbe elkészítéséhez. Kontroll oldatként metanolt alkalmaztunk. A minták teljes proantocianidintartalmát katechin ekvivalensként (CE) adtuk meg.

4.6. Szabad gyökfogó aktivitási vizsgálatok 4.6.1. DPPH gyökfogó aktivitási vizsgálat

A minták DPPH gyökfogó aktivitását egy 96-lyuklemez templátban határoztuk meg Celeb és munkatársai által módosított módszer szerint.[53]. Először 150 uM DPPH-oldatot készítettek frissen. Ezután 200 µl DPPH oldatot kevertünk össze 25 µl mintaoldattal. Ezután ezt a keveréket sötét szobahőmérsékleten 50 percig inkubáltuk. Az abszorbanciát 540 nm-en számítottuk. Referenciaoldatként butilezett hidroxitoluolt (BHT) használtunk különböző koncentrációkban. Kontroll oldatként metanolt használtunk. A minták aktivitását EC50-ként adtuk meg, ami megfelel az 50 százalékos aktivitást mutató koncentrációnak.

4.6.2. DMPD gyökfogó aktivitási vizsgálat

A minták DMPD* (N,N-dimetil-p-fenilén-diamin) gyökfogó aktivitását 96-lyuklemez templátban végeztük Inan és mtsai. által korábban leírt módszer szerint. [13]. Először 10{{10}} mM DMPD plusz oldat, 0,05 M FeCl; 6H2O oldatot és 0,01 M acetát puffert frissen készítettünk. Ezután 1 ml DMPD-oldatot, 100 ml acetát-puffert és 0,2 ml FeCl3-6H2O-oldatot kevertünk össze, majd később 15 µl mintaoldatot 210 µl keverékkel kevertünk össze. Sötét szobahőmérsékleten 50 percig végzett inkubálás után az abszorbanciát 492 nm-en mértük. A Troloxot referenciaoldatként használtuk különböző koncentrációkban a kalibrációs görbe elkészítéséhez. A mintaoldatok koncentrációja 1 mg/ml volt. A minták DMPD gyökfogó aktivitását Trolox-ekvivalensként (TE) adtuk meg. 4.7. Fémredukáló aktivitási vizsgálatok

4.7.1. Vascsökkentő antioxidáns teljesítmény vizsgálat (FRAP)

A minták FRAP-aktivitásának meghatározását egy 96 lyukú lemez templátban végeztük el Bardakci és munkatársai által korábban ismertetett eljárást követve.[54] A kísérlet elején a FRAP reagenst acetát puffer, vas-tripiridil-triazin és FeCl;6H2O oldatok összekeverésével alakítottuk ki. Ezt követően a FRAP reagenst a 37 fokos sütőbe helyeztük 30 percre. Ezután a mintaoldatokból 10 ul-t 30 µl desztillált vízzel, illetve 260 µl FRAP reagenssel kombináltunk. 37 °C-on 30 percig végzett inkubálás után az abszorbanciát 593 nm-re állítottuk be. Az eredmények értékeléséhez egy standard görbét állítottunk fel különböző molaritású vas-szulfát (025-2 mM) oldat alkalmazásával. BHT-t használtunk referenciaoldatként különböző koncentrációkban. A minták FRAP aktivitását mM FeSO4-ként mutattuk be 1 g száraz kivonatban.

4.7.2. Rézcsökkentő antioxidáns kapacitás vizsgálat (CUPRAC)

A minták CUPRAC-aktivitását egy 96-lyuklemez-sablonban határoztuk meg Celeb és munkatársai által módosított módszer szerint. 【31】; 85 μl CuSO4 (10 mM), neokuprain és ammónium-acetát oldatot és 51 uL desztillált vizet adtunk 43 ul mintaoldathoz külön-külön. Vízfürdőben 50 fokos inkubációs periódus (20 perc) után az abszorbanciát 450 nm-en mértük. A kalibrációs görbe elkészítéséhez referenciaoldatként aszkorbinsavat használtunk különböző koncentrációkban. A minták CUPRAC aktivitását aszkorbinsav ekvivalensként (AAE) mutattuk be. 4.8. Teljes antioxidáns aktivitás vizsgálat (TOAC)

A minták teljes antioxidáns aktivitásának meghatározását 96-lyuklemez-sablonban végezték el Celeb és munkatársai eljárása szerint. [55]. Először bizonyos mennyiségű egybázisú nátrium-foszfátot, ammónium-molibdát-tetrahidrátot és kénsavat kevertek össze, hogy megkapják a TOAC-oldatot. Ezután 300 µl TOAC oldatot adtunk 30 µl mintaoldathoz. Vízfürdőben 95 fokon 90 percig végzett inkubálás után az abszorbanciát 690 nm-en határoztuk meg. A kalibrációs görbe elkészítéséhez referenciaoldatként aszkorbinsavat használtunk különböző koncentrációkban. A minták TOAC-aktivitását aszkorbinsav-ekvivalensként (AAE) ábrázoltuk. 4.9.A biohasznosulási index becslése

A biohasznosulási indexet (BAvI) az Inan és munkatársai által leírt elméleti egyenlet alapján számítottuk ki.[13]

BAVI=CIN/CND A „biológiai hozzáférhetőségi indexet” (BAvI) a biológiailag hozzáférhető mintában (IN) lévő fenolok számának arányaként írták le a nem emésztett mintában (ND). 4.10. Marker flavonoidok mennyiségi meghatározása HPTLC-vel

A Cistus fajokból származó vizes kivonat összes szimulációs mintájában (ND, PG, IN) a szalidrozid, hiperozid és kvercitrin koncentrációjának kvantitatív meghatározását nagy teljesítményű vékonyréteg-kromatográfiával (HPILC) (CAMAG, Muttenz, Svájc) végeztük. Guzelmeric és munkatársai által validált módszert követve. [16]. A hiperozidot, a szalidrozidot és a kvercitrint 25,50 és 10{{30}} ug/ml koncentrációban állítottuk elő, és a frissen készített mintaoldatok koncentrációját a megfelelőre állítottuk be. 10 mg/ml. Ezeket az oldatokat normál fázisú, üveghátú szilikagél lemezekre (20 cm × 10 cm, Merck, Darmstadt, Németország) vittük fel bizonyos térfogatokkal (1-5 μL standard oldattal és 5 μL mintaoldattal) 100 μl-es fecskendővel. Hamilton, Bonaduz, Svájc) Az alkalmazási eljárást Linomat 5 mintafelhordóval végeztük. A kifejlesztési folyamat automatizált fejlesztőkamrában (ADC 2) és etil-acetát: diklór-metán, ecetsav, hangyasav: víz (10:25:10) elegyében történt. :10:10:10 me) volt mozgófázisként, majd a lemezeket Natural Product Reagent (NPR) (1 g difenil-bórsav 2-amino-etil-észter 200 ml etil-acetátban) származékká alakítottuk a merítőkészülékben (CAMAG). Míg a hiperozidot és a kvercitrint spektrofotometriásan elemeztük 260 nm-en, addig a szalidrozid mennyiségét 330 nm-en mértük UV-szkennerrel. A standardok Rf-értékeit hiperozid (≈0,35), kvercitrin (c0,45) értékként határoztuk meg. 0,65）. A korrelációs együtthatók (r²) x0,98 a marker flavonoidok mennyiségi meghatározásához.

4.11. A cukorbetegséggel kapcsolatos enzimek gátló hatása 4.11.1. - Glükozidáz gátló aktivitás

A Cistus fajok vizes kivonataiból nyert nem emésztett és biológiailag hasznosítható minták glükozidáz gátló aktivitását a Balan és mtsai által korábban ismertetett módszer szerint vizsgáltuk. [56]. Először megfelelő mennyiségű mononátrium-foszfátot és dinátrium-foszfátot kevertünk össze 100 mM foszfátpufferrel (pH7). ac glükozidáz enzimet foszfát pufferben oldottunk, hogy megkapjuk a -glükozidáz oldatot (0,2 U/mL). Ezután 170 uL foszfátpuffert, 20 μl -glukozidáz oldatot és 20 μL mintaoldatot egyesítettünk, és 37 fokos sütőben 15 percig inkubáltuk. Ezt követően 20 ul 2,5 mM p-nitrofenil- -D-glükopiranozid 100 mM kálium-foszfát pufferben (pH7.0) készült oldatát adtuk az elegyhez, majd újabb inkubációs periódust folytattunk 37 fokon 15 percig. Ezután 80 μl 0,2 M nátrium-karbonát oldatot adtunk az elegyhez a reakció leállítására. Az abszorbanciát 405 nm-en mértük. Referenciaként különböző koncentrációjú kvercetin oldatot használtunk. Az eredményeket a Cistus fajok vizes kivonatainak ND és IN mintáiban 1 mg/ml és 0,5 mg/ml koncentrációjú gátló aktivitás százalékában becsültük meg.

4.11.2. - Amiláz gátló aktivitás

A Cistus fajok vizes kivonataiból nyert nem emésztett és biológiailag hasznosítható minták -amiláz gátló aktivitását Balan és mtsai által korábban részletezett eljárás szerint határoztuk meg.[56]. A minták a-amiláz gátló aktivitásának spektrofotometriás meghatározását DNS (3,5-dinitroszalicilsav) reagenssel végeztük. A módszer szerint a keményítő átalakulásából maltóz képződik, és a lúgos DNS sárga színe a keményítőből előállított maláta hatására narancsvörös színűvé válik. Így 96 mM DNS-oldatot készítettek nátrium-kálium-tartarát oldat (2 M NaOH-ban oldva) és bizonyos mennyiségű DNS (desztillált vízben oldva) keverékéből. Ezután 20mM nátrium-foszfát puffert állítottunk elő 6,7 mM NaCl-dal (a-amiláz enzim kofaktora) 20 fokon (pH:6,9). az a-amiláz enzimet (1 U/ml) és a keményítőt (10 mg/ml) feloldottuk ebben a pufferben. Ezt követően 50 μl nátrium-foszfát puffert és 10 μl a-amiláz enzim oldatot kevertünk össze 20 μl mintaoldattal. Ezt a keveréket 37 °C-on 45 percig inkubáltuk. Az inkubációs periódus után 20 μl keményítőoldatot adtunk a keverékhez. Újabb inkubációs periódus indult 37 fokon 45 percig. Ugyanezt az eljárást alkalmaztuk a mintákra o-amiláz enzimoldat hozzáadása nélkül, amelyet "minta háttérnek" neveztek. A kontrollcsoportot ugyanezzel az eljárással vizsgáltuk, mintaoldatok hiányában. Az abszorbanciát 540 nm-en mértük. Referenciaoldatként akarbózt használtunk különböző koncentrációkban. Az eredményeket a Cistus fajok vizes kivonataiból származó 1 mg/ml és 0,5 mg/ml koncentrációjú ND és IN minták gátló aktivitásának százalékában adtuk meg. 4.11.3.KOR gátló tevékenység

A Cistus fajok vizes kivonataiból származó nem emésztett és biológiailag hozzáférhető minták AGE-gátló aktivitását a Starow-icz és munkatársai által leírt módszer szerint határoztuk meg. [57]. Bármilyen eljárás előtt 1 mg/ml és 0,5 mg/ml koncentrációjú ND és IN mintákat készítettünk frissen. Ezután 1 ml 10 mg/ml koncentrációjú marha szérumalbumin (BSA) oldatot adtunk 1 ml ND és IN mintaoldathoz. A kontrollmintákat ND és IN mintaoldatok hozzáadása nélkül, a vakmintákat pedig 0,5 M glükóz hozzáadása nélkül készítettük el. Ezután az összes előkészített mintát 40 órán át 55 fokos rázó vízfürdőben inkubáltuk. Az inkubációs periódus lejárta után a Thermo ScientificTM VarioskanTMLUXmultimode mikrolemez-leolvasót a 370 nm gerjesztési/440 nm emissziós tartományban használták a fluoreszcencia intenzitás kiszámításához. Referenciaoldatként a kvercetint használtuk különböző koncentrációkban.

5. Következtetések

Jelen tanulmányban a török ​​flórában feljegyzett összes Cistus faj vizes kivonatát vizsgáltuk fenolos profiljuk és in vitro antioxidáns és antidiabetikus potenciáljuk szempontjából. Mivel a hagyományos gyógyászatban a főzet vagy az infúzió elterjedt formája, a kísérleti vizsgálatok során különösen fontos a vizes kivonatok felhasználása az aktivitás értékelésére. Másrészt a vizes kivonat hidrofil összetevői a gyomor-bélrendszerben egy sor metabolikus átalakuláson mennek keresztül, miután lenyelték. Ezért a hagyományos készítmények aktivitásának helyes értékeléséhez a biológiailag hozzáférhető metabolitok aktivitását is meg kell vizsgálni.

Ez az első olyan tanulmány, amely az in vitro humán emésztési szimulációs módszer következményeit vizsgálja török ​​Cistus fajokon. Ezenkívül ebben a tanulmányban először tanulmányozták a Turkish Cistus fajok AGE-kra kifejtett gátlási potenciálját. Továbbá a salidrozidot, a hiperozidot és a kvercitrint marker flavonoidoknak jelöltük ki, és koncentrációjuk változását az in vitro emésztési eljárás során követtük. Míg a kivonatok fenoltartalmát, valamint antidiabetikus és antioxidáns hatását negatívan befolyásolták a gyomor-bélrendszeri emésztési eljárások, mégis jelentős bioaktivitást mutattak. Az eredmények szerint a C. salviifolius kivonat fenoltartalma, valamint antioxidáns és antidiabetikus hatása alapján a legerősebb növény. Összefoglalva, a török ​​Cistus fajok légi részei gazdag fenoltartalommal és potenciális antioxidáns és antidiabetikus hatással rendelkeznek. Míg az in vitro emésztés szimulációs módszert alkalmazták a biológiai hozzáférhetőség értékelésére, előfordulhat, hogy nem utánozza teljes mértékben a szervezetben előforduló anyagcsere-utakat. Ezért további in vivo és klinikai vizsgálatokra van szükség a fenolos vegyületek biológiai hozzáférhetőségének és a jelentett farmakológiai hatásokhoz való hozzájárulásuk részletes értékeléséhez.

A szerző hozzájárulásai:Fogalomalkotás, YI, EC, EY; módszertan, YI, SA, IK, EC formális elemzés, YI, IK.-C., SA; vizsgálat, YI, IK.-C, SA; források, YI, IK.SA, EC és EY; adatkezelés, YI, IK-C., SA; írás - YI, írás - áttekintés és szerkesztés, YI, EC, EY; vizualizáció, YI; felügyelet, ECés EYMinden szerző elolvasta és elfogadta a kézirat közzétett változatát.

Finanszírozás:Ez a kutatás nem kapott külső támogatást. Az intézményi felülvizsgálati bizottság nyilatkozata: Nem alkalmazható. Tájékozott hozzájárulási nyilatkozat: Nem alkalmazható.

Adatelérhetőségi nyilatkozat:A jelen tanulmányban bemutatott adatok a megfelelő szerzőtől kérésre rendelkezésre állnak.

Összeférhetetlenség:A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.

Minta elérhetősége:A vegyületek mintái nem állnak rendelkezésre a szerzőktől.

Ez a cikk a Molecules 2021, 26, 5322-ből származik. https://doi.org/10.3390/molecules26175322 https://www.mdpi.com/journal/molecules