1. RÉSZ A Cistanche Deserticola poliszacharid gátolja az OVX által kiváltott csontvesztést egerekben és a RANKL által kiváltott osteoclastogenezist
Mar 02, 2022
Bevezetés
A csontritkulás – egy olyan betegség, amelyet csökkent csonttömeg, rendellenes csontszövet mikrostruktúra, fokozott csonttörékenység és törések jellemeznek (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli és Ginaldi, 2006) – jelenleg több mint 200 millió embert érint világszerte, és jelentős egészségügyi és társadalmi-gazdasági teher a modern társadalomra (Strom et al., 2011). Az oszteoporózis klinikai kezelése főként hormonpótló, biszfoszfonát- vagy denosumab terápiára összpontosít. Ezek a módszerek hatékonyak, de hosszú távú mellékhatásokkal járnak, mint például az emlőrák és az atipikus combcsonttörések potenciális kockázata (Black, Bauer, Schwartz, Cummings és Rosen, 2012; Rachner, Khosla és Hof-Bauer, 2011). Ezért sürgős szükség van olyan gyógyszerek feltárására, amelyek nemcsak gátolhatjákcsontritkulásde kevesebb nemkívánatos mellékhatással is rendelkezik.
Cistanche deserticolaA (CD) Kínában széles körben használt tonizáló és gyógyhatású táplálék, a "sivatagi ginzeng" néven ismert a szárított, zamatos szár pikkelylevelével.C. deserticolaYC Ma (Gu, Yang és Huang, 2016), változatos és hatékonyfarmakológiaitevékenységek, mint például az immunszabályozás, az antioxidáció és az anti-csontritkulástulajdonságai (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). A csontritkulás kezelésében a CD hatóanyagaival kapcsolatos korábbi tanulmányok főként afeniletanoidglikozidok(Li, Jiang és Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao és Ma, 2017). A CD azonban más hatékony összetevőket is tartalmaz, mint például iridoidokat, lignánokat,poliszacharidok(Wang, Zhang és Xie, 2012). A hagyományos kínai orvoslás (TCM) klinikai alkalmazása főként a víz főzése.Poliszacharidokvízben oldódó komponensek, és nagy valószínűséggel a TCM fő farmakodinámiás komponensei. A TCM-ből kivont poliszacharidokról vad jelentések szerint anti-csontritkuláshatás és néhány nemkívánatos mellékhatás, amelyeket általában a klinikákon alkalmaznak (pl. Epimedium brevicornumból (Zheng, He, Wu, Cai és Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang és Yan, 2018) és Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Ezért azt feltételeztükCistanche deserticolapoliszacharidA CD-ből kivont (CDP) potenciálisan biztonságos gyógyszer lehet a csontritkulás kezelésére.
A csontreszorpció és a csontképződés jellemzően fenntartja a dinamikus egyensúlyt a csontremodelláció során, koordinálva többféle sejttípussal, beleértve az oszteoklasztokat, oszteoblasztokat, csontbélelő sejteket és oszteocitákat (Kular, Tickner, Chim és Xu, 2012). Ennek az egyensúlynak a felbomlása számos csontanyagcsere-betegséget eredményezhet, mint plcsontritkulás(Zhu és mtsai, 2018) és az oszteoszklerózis (Ihde et al., 2011). Az oszteoklasztok, mint a mononukleáris/makrofág vonalból származó végdifferenciált sejtek, az egyetlen csontreszorpciós funkcióval rendelkező sejtek (Teitelbaum, 2000). Két kulcsfontosságú citokin vesz részt az oszteoklasztok differenciálódásában és érésében (Koga és mtsai, 2004): a makrofág telep-stimuláló faktor (M-CSF) és a nukleáris faktor κB (NF-κB) ligandum receptor aktivátora (RANKL). Az M-CSF közvetíti a hematopoietikus őssejtek oszteoklaszt progenitorokká történő differenciálódását, és elősegíti az oszteoklasztok differenciálódását a RANK receptor expressziójának fokozásával (Takayanagi, 2007). A RANKL és RANK kötődése az oszteoklaszt sejtfelszínen a következőket eredményezi: (1) jelátviteli adaptermolekulák, például TNF-receptor-asszociált 6-os faktor (TRAF6) toborzása; (2) több downstream célpont aktiválása, beleértve az NF-κB-t és a mitogén által aktivált protein kinázokat (MAPK-kat); és (3) az aktivált T-sejtek nukleáris faktora, a citoplazmatikus 1 (NFATc1) expressziós szintjének felszabályozása (Liu és mtsai, 2019; Yamashita és mtsai, 2007). Ezen jelátviteli útvonalak aktiválása közvetlenül szabályozza az oszteoklaszt gének expresszióját, beleértve a savas foszfatáz 5 (Acp5) [tartarát-rezisztens savas foszfatázt (TRAcP) kódoló], a mátrix metalloproteináz 9 (MMP9) és a katepszin K (CTSK) (Boyle, Simonet) expresszióját. és Lacey, 2003). Ezért a RANKL által kiváltott oszteoklaszt-differenciálódáshoz kapcsolódó jelátviteli utak gátlása potenciális terápiás módszer a csontritkulás kezelésére.
Ebben a vizsgálatban azt a célt tűztük ki, hogy meghatározzuk a CDP-kezelés hatását a petefészek eltávolítása (OVX) által kiváltott betegekre.csontritkulásegérmodell in vivo és a RANKL-indukált oszteoklasztaktivitás in vitro, középpontjában az oszteoklaszt-specifikus gének expressziója és az NFATc1, valamint az NF-κB és MAPK jelátviteli útvonalak aktiválása. Eredményeink új betekintést nyújthatnak a CDP-ben, mint biztonságos és hatékony gyógyszerként a csontritkulás kezelésében.
További információért forduljon:Joanna.jia@wecistanche.com
2. Anyagok és módszerek
2.1. Vegyszerek és mintagyűjtés
A CD-t (180801. sz.) az Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd.-től (Anhui, Kína) vásároltuk, és Haibo Huang professzor azonosította, a Guangzhou Kínai Orvostudományi Egyetem Gyógyszertudományi Iskolájából, Guangzhou, Kína. Az ösztradiol-valerát tablettákat a Bayertől (Leverkusen, Észak-Rajna-Vesztfália, Németország) vásároltuk. Alfa-módosított minimális esszenciális közeg
(-MEM) és magzati szarvasmarha-szérumot (FBS) a Gibco-tól (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) szereztük be. A penicillin/sztreptomicin és a TRAcP festőkészlet a Solarbio-tól (Peking, Kína) származott. A rekombináns egér M-CSF-et és a rekombináns egér RANKL-t az R&D Systemstől (Minneapolis, MN, USA) szereztük be. A hidroxiapatittal bevont lemezeket a Corning Life Sciences-től (St. Lowell, MA, USA) vásároltuk. Az NFATc1 és CTSK elsődleges antitestei (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK és P-JNK (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); és -aktint (CWBIO, Peking, Kína) is kaptunk. A vizsgálatban használt többi reagens analitikai minőségű volt, és a vizet Milli-Q víztisztító rendszerrel (Millipore, Bedford, MA, USA) tisztították.
2.2. CDP extrakció
A CD-t finom porrá őrölték, és petroléterrel háromszor keverték, hogy legyőzzék. A szilárd maradékot szűréssel összegyűjtjük, majd szobahőmérsékleten szárítjuk. AzpoliszacharidokAz előkezelt mintákból háromszor 2 órán át vízzel extraháltuk, betöményítettük, vízmentes etanol hozzáadásával 80 térfogatszázalékos végső koncentrációig kicsaptuk, és 4 ◦C-on 24 órán át tároltuk. A csapadékot centrifugálással 3000 rpm-en 20 percig összegyűjtöttük, desztillált vízben feloldottuk, és Sevag módszerrel (Zhao és mtsai, 2019) tisztítottuk (a szabad fehérjék eltávolítása). A felépültpoliszacharidokdializáltuk, szárítottuk és további felhasználásig tároltuk. Továbbá a kémiai összetétel eredményei azt mutatták, hogy a CDP összes cukor-, uronsav-, szulfát- és fehérjetartalma 67.63 0.98 százalék , 21.05 0.49 százalék , 1.{{7 }},24 százalék és 8.{10}},36 százalék .
A CDP monoszacharid összetételét és Fourier-transzformációs infravörös analízisét az 1. és 2. kiegészítő ábra mutatja.
2.3. OVX-indukált csontritkulás egérmodell
Minden állatkísérletet jóváhagyott a Guangzhou Kínai Orvostudományi Egyetem Állat-etikai Bizottsága (jóváhagyta: SYXK 2019-0202). Harminc 6-hetes nőstény C57BL/6 egeret szállított a Guangzhou Kínai Orvostudományi Egyetem Kísérleti Állatközpontja. Egy hetes akklimatizáció után az egerek egy csoportját álműtétnek vetettük alá (Sham csoport), míg a többi egeret petefészekeltávolításnak vetettük alá (OVX csoport). A műtét után az egereket 1-hétig hagyták felépülni. Ezután a sikeresen modellezett egereket véletlenszerűen 5 csoportra osztották, csoportonként 6 egérrel:
(1) Ál csoport: desztillált vízzel kezelt, (2) OVX csoport: desztillált vízzel kezelt, (3) OVX E2 csoport (E2): 0.13 mg/kg ösztradiol-valerát tablettával kezelve, (4) ) OVX CDP alacsony dózisú csoport (CDP-L): 300 mg/kg CDP-vel kezelték, (5) OVX CDP nagy dózisú csoport (CDP-H): 600 mg/kg CDP-vel kezelték. Desztillált vizet, E2-t vagy CDP-t szondán keresztül adtunk be naponta egyszer. Az összes egeret leöltük a 12- hetes kezelési időszak után (1A. ábra). A méheket összegyűjtöttük és lemértük, a bal sípcsontot pedig összegyűjtöttük a további vizsgálatokhoz. Teljes vérmintákat vettünk, és 5000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk
15 perc 4 ◦C-on. A szérum felülúszót leszívtuk és tároltuk
-80 ◦C a további elemzésig.
2.4. Mikro-számítógépes tomográfia (mikro-CT) elemzés és csont hisztomorfometria
A bal sípcsontot 4 százalékos paraformaldehiddel rögzítettük 48 órán át, majd normál sóoldatot tartalmazó centrifugacsövekbe helyeztük. A rögzített mintákat Skyscan 1172 mikro-CT műszerrel (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgium) szkenneltük a következő beállításokkal: feszültség, 80 kV; forrásáram, 100 μA; Al, 0,5 mm-es szűrő; pixel
méret, 9,76 μm; és forgatási lépés, 0.6◦. Számos paraméter a
A trabekuláris csontot, beleértve a csont ásványi sűrűségét (BMD), a csonttérfogat-frakciót (BV/TV), a teljes térfogatra eső csontfelszínt (BS/TV), a trabekuláris számot (Tb. N) és a trabekuláris távolságot (Tb. Sp) mértük. CT- Analyser® szoftver (Bruker micro-CT, Skyscan). A háromdimenziós képeket CTVol szoftverrel (Bruker micro-CT. Skyscan) állítottuk elő.
A mikro-CT analízist követően a bal sípcsontot 14%-os EDTA-oldatban vízkőtelenítettük, majd metszéshez paraffinba ágyaztuk. A mintákat 5 µm-es metszetekre vágtuk mikrotom segítségével a hematoxilin és eozin (H&E) és TRAcP festési kísérletek előtt. A megfestett metszeteket Olympus CX 31 mikroszkóppal (Olympus Optical Co., Ltd., Tokió, Japán) vizsgáltuk és dokumentáltuk.
Cistanchenövelheti a csontsűrűséget és enyhítheti a csontritkulást
2.5. Szérumelemzés
A kalcium (Ca) és foszfor (P) koncentrációját a Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kína) által kidolgozott kit utasítások szerint határoztuk meg. A szérum TRAcP-5b és RANKL szintjét TRAcP-5b ELISA készlettel (CUSABIO, Wuhan, Kína) és RANKL ELISA kittel (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Kína) elemeztük.
2.6. In vitro osteoclastogenesis vizsgálat
A BMM-eket 6-hetes nőstény C57BL/6 egerek sípcsontjából és combcsontjából izoláltuk. Az izolált sejteket 25 ng/ml M-CSF-et, 10% FBS-t és 1% penicillint/sztreptomicint tartalmazó -MEM tápközegben tenyésztettük. Az összefolyás elérésekor a BMM-eket (1 104 sejt/lyuk) 96-lyukú lemezekre oltottuk, és CDP-vel kezeltük 50 ng/ml RANKL jelenlétében. A táptalajt és a CDP-t 2 naponta cseréltük. 7 nap elteltével a sejteket 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk, és TRAcP jelenlétére festettük. A három vagy több maggal rendelkező TRAcP-pozitív sejtként meghatározott oszteoklasztok számát fénymikroszkóppal megszámoltuk és dokumentáltuk.
2.7. Sejtproliferációs vizsgálat
A BMM-eket (1 × 104 sejt/lyuk) egy 96-lyukú lemezre oltottuk, és egy éjszakán át inkubáltuk. Ezt követően a sejteket különböző koncentrációjú CDP-vel (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 és 40 µg/ml) kezeltük 48 órán keresztül. A sejtösszefolyást az IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA), egy hosszú távú, valós idejű dinamikus élő sejt képalkotó rendszer segítségével detektáltuk és elemeztük.
2.8. Hidroxiapatit reszorpciós vizsgálat
A BMM-eket ({0}} sejt/lyuk) hidroxiapatittal bevont lemezre oltottuk, CDP-vel kezeltük a jelzett koncentrációkban (0, 5 és 10 µg/ml), és teljes -MEM-ben tenyésztettük. 25 ng/ml M-CSF-et és 50 ng/ml RANKL-t tartalmaz. 7 nap elteltével a sejteket 10%-os fehérítőoldattal mostuk, hogy eltávolítsuk a sejtkomponenseket. A hidroxiapatit reszorpciós területek képeit IncuCyte ZOOM® segítségével rögzítettük, és ImageJ szoftverrel (NIH, Bethesda, MD, USA) elemeztük (Abramoff, Magelhaes és Ram, 2003).
2.9. RNS izolálás és valós idejű reverz transzkripciós-kvantitatív PCR (RT-qPCR) elemzés
A BMM-eket ({{0}} sejt/lyuk) egy 6-lyukú lemezre oltottuk, és RANKL-lel és M-CSF-fel stimuláltuk CDP jelenlétében, különböző koncentrációkban (0, 5 és 10). µg/ml) 5 napig. Az egerek sejtjéből vagy csontszövetéből TRIzol reagens (Sigma-Aldrich) segítségével teljes RNS-t izoláltunk. Komplementer DNS-t szintetizáltunk 2 µg teljes RNS-ből reverz transzkriptáz kit (TransGen Biotech, Peking, Kína) segítségével. Az RT-qPCR reakciókat PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) segítségével állítottuk elő, és ABI 7500 rendszerrel detektáltuk (Applied
Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). A PCR ciklus paramétereit a következőképpen állítottuk be: 95 ◦ C 5 percig, majd 40 ciklus 95 ◦ C 15 másodpercig, és 60 ◦ C 30 másodpercig. Az alkalmazott specifikus primereket az 1. táblázat mutatja be, és az egyes célgének mennyiségét GAPDH-ra (belső kontroll) normalizáltuk.
2.10. Western blot analízis
A BMM-eket ({{0}} sejt/lyuk) egy 6-lyukú lemezre oltottuk. A rövid időtartamú kísérletekhez a sejteket a különböző koncentrációjú CDP-vel (0, 5 és 10 µg/ml) előinkubáltuk 1 órán át, majd 50 ng/ml RANKL-lel kezeltük 30 percig. . A sejteket hosszú ideig 50 ng/ml RANKL-lel stimulálták a 3., 5. és 7. napon CDP (0, 5 és 10 µg/ml) jelenlétében. Az összes fehérjét RIPA lízispufferrel (CWBIO) extraháltuk. A fehérjéket 10%-os SDS-PAGE-val választottuk el, és PVDF membránokra vittük át. A membránokat 5%-os sovány tejjel blokkoltuk szobahőmérsékleten 2 órán át, majd az elsődlegesvel inkubáltuk
antitestek egy éjszakán át 4 ◦C-on, majd a megfelelő másodlagos
antitestek 1,5 órán keresztül. A membránokat ECL reagensekkel (Millipore Corp., Billerica, MA, USA), a képeket Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Shanghai, Kína) segítségével készítettük.
Cistanchenövelheti a csontsűrűséget
2.11. NFATc1 transzlokáció kimutatása immunfluoreszcencia teszttel
A BMM-eket {{0}}lyuk fedőlemezekre oltottuk, RANKL-lel és M-CSF-fel stimuláltuk, és 5 napon keresztül 10 µg/ml CDP-vel kezeltük. A sejteket 4 százalékos paraformaldehiddel fixáltuk 15 percig, háromszor mostuk PBS-sel, és 0,1 százalékos Triton X{8}}-dal 10 percig permeabilizáltuk. A sejteket 10 százalékos kecskeszérummal (CWBIO) kevertük, és 2 órán át inkubáltuk. Ezt követően a sejteket az elsődleges antitesttel egy éjszakán át 4 °C-on, majd az Alexa Fluor 488 kecske anti-egér szekunder antitesttel (Abcam, Cambridge, MA, USA) sötétben 1 órán át inkubáltuk. A fedőlemezeket PBS-sel mostuk, Prolong Gold Antifade Reagentbe szereltük 4′, 6-diamidino-2-phenyl in-doll (DAPI) (Solar), és
Zeiss LSM 800 készülékkel, Airyscan konfokális mikroszkóppal (Carl Zeiss, Oberkochen, Németország) vizsgáltuk.
2.12. Statisztikai analízis
Minden kísérleti adatot SPSS 25.{1}} statisztikai szoftverrel elemeztünk (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Az állat- és sejtvizsgálatok adatait átlag ± SEM, illetve átlag ± SD értékben fejezzük ki. Az eredmények egyirányú varianciaanalízist vagy Student-féle t-tesztet használnak. A p < 0,05="" értékeket="" tekintettük="" statisztikailag="">
Cistanchecsökkenthetiapoptózisés fokozza a csontozatotsűrűség
