1. RÉSZ: A Cistanche kivonatok javítják a hidrogén-peroxid által kiváltott neurotoxicitást az új mutáns DJ-1-vel transzfektált neuroblasztóma sejtmodellekben

Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com

1. BEMUTATKOZÁS

A fő neurodegeneratív betegségek közé tartozikAlzheimer-kórbetegség, Parkinson-kór (PD), Huntington-kór és mások. Ezen rendellenességek közül a PD előfordulási arányaParkinson kór) a második a világon, és 1–2 százalékot ér el a 60 év felettieknél (Burke és O'Malley, 2013; Mullard, 2017; Shen és Ji, 2013). A PD fő neurológiai jellemzőjeként a substantia nigra pars compacta dopaminerg neuronjai progresszív degeneratívak (Glizer & MacDonald, 2016), amihez a Lewy testeknek nevezett szinuklein zárványok (Zhang, An, Zhang és Pu) megjelenése társul. , 2010). A PD patogenezisében a nyugalmi remegés, a merevség, a bradykinesia és a testtartási rendellenességek a PD fő tüneteit diagnosztizálják a klinikán. Bár a dopaminerg neuronok pontos progresszív degeneratív mechanizmusa nem érthető, vagy a környezeti okok, beleértve a rovarirtó szerek, neurotoxikus szerek és nehézfémek expozícióját, vagy olyan genetikai okok, mint a Parkin (Kitada et al., 1998), a szinuklein (Polymeropoulos et al.) mutációi. al., 1997), és a DJ‐1 (Biosa és mtsai, 2017; Bonifati és mtsai, 2003), úgy vélik, hogy a PD előfordulásához vezetnek. A mai napig a DJ‐1 génmutációk által okozott missense mutációk, frameshift mutációk és nagy fragmentum deléciók száma meghaladja a 10-et (Andres‐Mateos et al., 2007; Bonifati et al., 2003; Hague et al., 2003). A DJ-1 fehérjén belül a Leucin166Proline (L166P) szubsztitúciója kiemelkedően fontos. Ezenkívül azt is kimutatták, hogy oxidatív stressz fordul elő PD-ben (Dexter és mtsai, 1989, 1994; Nikam, Nikam, Ahaley és Sontakke, 2009), és részt vesz a patogenezisében (Hague et al., 2003).

A nyolc exont tartalmazó DJ-1 gén, amely 24 kb-on elosztva, az 1p36 kromoszómán helyezkedik el emberben (Bonifati et al., 2003), és egy 189 aminosavat tartalmazó, erősen konzervált fehérjét kódol. A fehérje a ThiJ/PfpI családba tartozott, homodimer formában létezik. A kéregben és a substantia nigrában és a striatumban található gliasejtek a főbbek a DJ-1 fehérje területein (Olzmann et al., 2007). Ezekben a sejtekben a DJ‐1 a következő szerepeket tölti be, mint például az onkogén (Nagakubo és mtsai, 1997), a transzkripció szabályozása (Kim és mtsai, 2005; Niki, Takahashi‐ Niki, Taira, Iguchi‐Ariga és Agria, 2003) ), antioxidatív stressz (Taira és mtsai, 2004; Zhou és Freed, 2005), chaperon (Shendelman, Jonason, Marlinat, Leete és Abeliovich, 2004; Zhou, Zhu, Wioson, Petsko és Fink, 2006) és proteáz (Abou-Sleiman, Healy, Quinn, Lees és Wood, 2003).

Neurodegeneratív betegségek kezelése: cisztanche kivonat

Cistanchehagyományos kínai orvoslás, és elsősorban andrológiai betegségek kezelésére használták az idők során. A fő hatóanyagok aCistanchefenil-glikozidok, köztük 34 vegyület, például akteozid, echinakozid stb.Cistanche kivonatokide tartozik a szexuális funkció javítása, az öregedésgátlás, a tanulási és memóriaképesség növelése, a neuroprotekció, az immunmoduláció, a fáradtság elleni küzdelem, az anti-ischaemiás és a májvédelem (Tu et al., 2011). A kávésav a Cistanche egyik fő metabolitja (Yan, 2018).

A PD általánosan használt sejtmodelljei közé tartoznak az 1-metil-4-fenil-piridinium-ion-indukált PC12-sejtek (Abou-Sleiman et al., 2003) és a hidrogén-peroxid (H2O2)-indukált neuroblasztóma (SH-SY5Y) sejtek (Zhang5Y) ., 2009). A PD tipikus patológiás jellemzői azonban nem jelennek meg ezekben a modellekben. A PD fiziológiailag relevánsabb sejtmodelljének kidolgozása érdekében ebben a vizsgálatban H2O2-indukált L166P és C106S DJ-1-transzfektált SH-SY5Y sejteket hoztunk létre, és vizsgáltuk aCistanche kivonatokés kulcsfontosságú bioaktív vegyületek, beleértve az akteozidot, echinakozidot, kávésavat ésCistanche összglikozidokezen a két modellen, először.

Cistanche kivonat anti-neurodegeneratív betegségek

2. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

2.1|Plazmidok, gyógyszerek, vegyszerek és sejtek

A FLAG-L166P DJ-1, FLAG-C106S DJ-1 plazmidokat és az anti-DJ-1 poliklonális antitesteket Dr. Hiroyoshi Ariga, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University biztosította. A dehidratált minimális esszenciális táptalajt (MEM) és az F‐12 táptalajt a Gibco-tól vásároltuk. A Lipofectin az Invitrogentől származott. A FastDigest Xho I és a FastDigest EcoR I a Fermentastól származott. Az endotoxin-mentes plazmid-előkészítő készlet a Biotech cégtől származott. Az SH-SY5Y sejtvonal a Kínai Orvostudományi Akadémia sejtbankjából származott. A BCA fehérje vizsgálati reagenskészlet a Pierce-től származott. A PVDF membránok a Millipore cégtől származtak. Az anti-FLAG poliklonális antitest a GeneTex-től származott.Cistanche kivonatok, beleértve az akteozidot, az echinakozidot, a kávésavat és a Cistanche összglikozidokat, a Pekingi Egyetem Gyógyszertudományi Iskola Természetgyógyászati ​​Tanszéke szállította.

2.2|Plazmidok amplifikációja, extrakciója és tisztítása

Az Escherichia coli JM109 sejteket LB folyékony tápközegben OD600=0,5-ig tenyésztjük, majd a kompetens sejteket kalcium-kloridos módszerrel preparáltuk. A kompetens E. coli-t ezután hősokk módszerrel plazmid DNS-sel transzformáltuk, majd a transzformánsokat ampicillint tartalmazó LB lemezeken tenyésztettük 16-24 órán át 37 °C-on. Ezután egy sikeresen transzformált monoklonális telepet szelektáltunk, és 50 ug/ml ampicillint tartalmazó LB folyékony tápközegben tenyésztettük további 12 órán át 37 °C-on. A plazmidokat endotoxin-mentes plazmidkészítő készlettel extraháltuk és tisztítottuk a gyártó utasításai szerint.

2,3|Plazmid azonosítás

Az extrahált plazmidokat enzimatikus emésztésnek vetettük alá, majd a plazmidokat és az emésztett fragmentumokat 1%-os agaróz gélelektroforézissel vizsgáltuk. A kapott gélt EB-oldatban festettük 20-25 percig szobahőmérsékleten, és fényképeztük.

2,4|Plazmid transzfekció SH-SY5Y sejtekbe

A tisztított plazmid DNS-t MEM/F-12 tápközegben tenyésztett SH-SY5Y sejtekbe transzfektáltuk, amely 10% magzati szarvasmarha szérumot tartalmazott. A transzfektált sejteket ezután 400 ug/ml G418-at tartalmazó tápközegben szelektáltuk, majd 200 ug/ml G418-at használtunk a stabilan transzfektált sejtvonal fenntartására.

2,5|A transzfektált sejtek azonosítása Western blottal

A transzfektált SH-SY5Y sejteket RIPA pufferben lizáltuk. A lizátum centrifugálása után a felülúszó teljes fehérjekoncentrációját BCA fehérje vizsgálati reagenskészlettel határoztuk meg. Ezután azonos mennyiségű fehérjekivonatot 12,5%-os SDS-poliakrilamid gélelektroforézisnek vetünk alá, és PVDF membránra vittük át. A PVDF membránt TBST-oldatban 5% zsírmentes száraz tejjel blokkoltuk, és immundetektálás céljából feldolgoztuk. Elsődleges antitestként az anti-FLAG-ot és az anti-DJ-1-et használták, a HRP-vel konjugált IgG pedig a másodlagos antitest volt. Fokozott kemilumineszcenciás detektáló rendszert alkalmaztunk a célfehérjék kimutatására.

2,6|A transzfektált sejtek immuncitokémiai azonosítása

A transzfektált SH-SY5Y sejteket 4 százalékos paraformaldehid oldattal fixáltuk, 0,3 százalékos Triton X-100 oldattal permeabilizáltuk, és 10 százalékos kecskeszérummal blokkoltuk. A blokkolt sejteket ezután először anti-FLAG és anti-DJ-1 poliklonális antitesttel, majd FITC-konjugált kecske antinyúl szekunder antitesttel inkubáltuk. A sejtmagokat Hoechst 33342-vel megfestettük, és a sejteket fordított fluoreszcens mikroszkóp alatt (IX-71, Olympus) tettük láthatóvá.

2,7| Sejtéletképességi vizsgálat

A nem transzfektált és transzfektált SH-SY5Y sejteket 96-os kivonatba szélesztettük, beleértve az akteozidot, az echinakozidot, a kávésavat és a Cistanche összglikozidokat (mindegyik 10, 20 és 40 ug/ml), és hozzáadtuk a A sejteket 6 órán át inkubáltuk, majd további 1 órán át 0,2 mM H2O2-val kezeltük. A táptalajt eldobtuk, és a sejtek életképességét MTT-vel vizsgáltuk a fent leírtak szerint.

2,8|A Cistanche kivonatok hatása a sejtek életképességére

kivonatokat, köztük akteozidot, echinakozidot, kávésavat és Cistanche összglikozidokat (mindegyik 10, 20 és 40 ug/ml) adtunk hozzá, és a sejteket 6 órán át inkubáltuk, mielőtt 0,2 mM H2O2-val kezeltük volna. további 1 óráig. A táptalajt eldobtuk, és a sejtek életképességét MTT-vel vizsgáltuk a fent leírtak szerint.

2,9|Statisztikai analízis

Az adatokat három független kísérlet átlaga ± SD értékében fejezzük ki. A csoportok közötti különbségeket egyutas ANOVA és LSD módszerrel, SPSS 22.{1}} szoftverrel elemeztük. A p < 0,05="" értékeket="" tekintettük="">

Cistanchenövény

3|EREDMÉNYEK

3.1|A plazmidokat sikeresen transzformáltuk és tisztítottuk. Az E. coli JM109-ben történő külön expressziót követően a plazmidokat extraháltuk, és 1%-os agaróz gélelektroforézissel megvizsgáltuk, miután restrikciós enzimmel emésztettük (1. ábra). A 6,2 kb-os plazmidokat 5,4 és 0,8 kb-os lineáris DNS-fragmensekre hasították, ami megerősítette, hogy az L166P és C106S DJ-1 plazmidok egyaránt sikeresen expresszálódnak és tisztítottak.

3.2|A transzfektált sejtek azonosítása Western blottal. A 2. ábrán látható módon a FLAG-L166P DJ-1 és FLAG-C106S DJ-1 sávokat körülbelül 70 kDa-nál észleltük. A FLAG-jelölt fehérje magas szintje a transzfektált SH-SY5Y sejtekben azt jelzi, hogy az L166P és C106S DJ-1 mutánsok erősen expresszálódnak a megfelelő transzfektánsaikban.

3,3|A transzfektált sejtek immuncitokémiai azonosítása. A transzfektált SH-SY5Y sejtekből származó erős fluoreszcens jeleket mutatja az anti-DJ-1 vagy anti-FLAG antitestekkel végzett inkubáció után. Ez megerősíti a transzfektánsokban kifejezett L166P és C106S DJ‐1 magas szintjét.

3.4|A transzfektált sejtek érzékenyebbek voltak a H2O2-ra, mint a nem transzfektált sejtek. 1 órás inkubálás után fokozatos koncentrációjú H2O2 (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, {{15}) jelenlétében },5, illetve 1 mM), az L166P-vel vagy C106S DJ-1-gyel transzfektált SH-SY5Y sejtek életképessége dózisfüggően csökkent a nem transzfektált sejtekhez képest

3,5|A Cistanche kivonatok gátolták a H2O2 által kiváltott csökkenést Az SH-SY5Y sejtek életképességét dózisfüggően gátolta a kezelésCistanche kivonatok, beleértve az akteozidot, az echinakozidot, a kávésavat és a Cistanche összglikozidokat (mind 10, 20 és 40 ug/ml).

Cistanche