1. RÉSZ Az echinakozid gátolja a glutamát felszabadulását azáltal, hogy elnyomja a feszültségfüggő Ca2+ belépést és a protein kináz C-t patkány cerebrokortikális idegvégződéseiben

Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 és Su Jane Wang 3,*

1 Aneszteziológiai Tanszék, Távol-Keleti Emlékkórház, Pan-Chiao kerület, Új-Tajpej város 22060, Tajvan; drluchengwei@gmail.com (C.W.L.); drlin1971@gmail.com (T.Y.L.);nskh9450n@yahoo.com.tw (S.K.H.)

2 Gépészmérnöki Tanszék, Yuan Ze Egyetem, Taoyuan 32003, Tajvan

3 Orvostudományi Iskola, Fu Jen Katolikus Egyetem, No. 510, Zhongzheng Rd., Xinzhuang Dist., New Taipei 24205, Tajvan.

Elvont:A glutamaterg rendszer részt vehet a neuroprotektor terápiák hatásaiban. Echinacoside, egy fenil-etánoid glikozid, amelyet a kínai gyógynövényből vontak kiHerba Cistanche,neuroprotektív hatása van. Ez a tanulmány az echinacozid hatását vizsgálta a 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulásra patkány cerebrokortikális idegvégződésekben (szinaptosszómák). Az echinacoside gátolta a Ca-t²⁺-függő, de nem Ca²⁺-független, 4-aminopiridin-kiváltott glutamát felszabadulás koncentrációfüggő módon. Az echinacoside csökkentette a citoplazmatikus szabad Ca 4-aminopiridin által kiváltott növekedését is²⁺koncentrációban, de nem változtatta meg a szinaptoszomális membránpotenciált. Az echinacozid 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulására gyakorolt gátló hatását megakadályozta a cu-conotoxin MVIIC, a Cav2.2 (N-típus) és a Cav2.1 (P/Q-típusú) csatornák széles spektrumú blokkolója, de érzéketlen volt az intracelluláris Ca-ra²⁺a dantrolen és a 7-klór-5-(2-klórfenil)-1,5-dihidro-4,1-benzodiazepin-2(3H)-on (CGP37157) felszabadulásgátlók. Ezenkívül az echinacoside csökkentette a protein kináz C fehérje 4-aminopiridin által kiváltott foszforilációját, és a protein kináz C inhibitorok eltörölték az echinakozid hatását a glutamát felszabadulására. Ezen eredmények alapján azt javasoljuk, hogy az echinacozid gátló hatása az idézett glutamát felszabadulásra csökkent feszültségfüggő Ca-val jár²⁺a protein kináz C aktivitás belépése és az azt követő elnyomása.

Kulcsszavak:echinacoside; glutamát felszabadulás; cerebrokortikális idegvégződések; feszültségfüggő Ca²+ csatornák; fehérje-kináz C Parkinson-kór, Alzheimer-kór és középső agyi artéria elzáródás[9-12]. Azonban az a mechanizmus, amelyen keresztül az echinacoside neuroprotekciót indukál, nem teljesen ismert.

További információért kérjük, vegye fel a kapcsolatot:Joanna.jia@wecistanche.com

Echinacosidea cistanche-ban sok funkcióval rendelkezik

1. Bevezetés

Echinacosideegy jelentős fenil-etánoid-glikozid, amely aHerba Cistanche, egy jól ismert hagyományos kínai gyógyszert, amelyet a feledékenység, az impotencia és a krónikus székrekedés kezelésére használnak [1].Echinacosidekülönféle bioaktivitásokkal rendelkezik, mint például az antioxidáció, a gyulladáscsökkentő, a rákellenes szerek, a hepatoprotekció és az immunmoduláció [2–4]. Különösenechinacosideneuroprotektív hatása van; például védelmet nyújthat az oxidatív stressz- vagy neurotoxin által kiváltott neurotoxicitás ellen primer patkánykortikális neuronokban, humán neuroblasztóma SH-SY5Y sejtekben és pheochromocytoma (PC12) sejtekben [5–8]. Továbbáechinacosidecsillapítja az agykárosodást és javítja a kognitív funkciókat a Parkinson-kór, az Alzheimer-kór és a középső agyi artéria elzáródásának állatmodelljeiben [9–12]. Azonban az a mechanizmus, amelyen keresztülechinacosidea neuroprotekciót indukálja, nem teljesen ismert.

A neuroprotekció az idegsejtek szerkezetének és működésének megőrzésének összetett folyamata mérgező sértések esetén. A glutamát excitotoxicitásának csökkentését az agyi neuroprotekcióban részt vevő lehetséges mechanizmusnak tekintik. A glutamát, egy gerjesztő aminosav-neurotranszmitter, döntő szerepet játszik számos agyi funkcióban [13]. A glutamát receptorok túlaktiválódása azonban magas glutamát koncentrációk mellett intracelluláris Ca2+ túlterhelést, mitokondriális diszfunkciót, szabadgyök-termelést és neuronális halált okoz [14,15]. Ez a kóros folyamat számos agyi rendellenességben érintett, beleértve az agyi ischaemiát, a traumás agysérülést, az epilepsziát és a neurodegeneratív betegséget [16,17]. Ezért a patofiziológiai glutamaterg átvitelt blokkoló inhibitorokat potenciális neuroprotektív gyógyszereknek tekintik. Ezekre figyelemre méltó példák a glutamát receptor antagonisták [18,19]; ezeknek a gyógyszereknek a klinikai vizsgálatai azonban kudarcot vallottak a kisebb hatásosság és a nem kívánt, vagy akár citotoxikus mellékhatások miatt [20,21]. A közvetlen glutamát receptor blokád mellett a glutamát felszabadulás gátlása hatékony stratégia lehet a neuroprotekcióban. Számos neuroprotektor (pl. memantin és riluzol) csökkentheti a glutamát felszabadulását patkány agyszöveteiben [22–24].

Figyelembe véve a glutamát szerepét az excitotoxicitásban és a neuroprotektív profilbanechinacoside, a jelenlegi vizsgálat a patkány agykéregből megtisztított izolált idegvégződéseket (szinaptoszómákat) használt aechinacosidea glutamát felszabadulásáról és a lehetséges mechanizmusok további feltárásáról. Az izolált idegvégződési készítmény jól bevált modell a neurotranszmitter gyógyszerek általi felszabadulásának preszinaptikus szabályozásának tanulmányozására posztszinaptikus hatások hiányában [25]. Ezzel a modellel értékeltük aechinacosideglutamát felszabadulás, membránpotenciál, preszinaptikus Ca2+ beáramlás és protein kináz C aktivitás. A szakirodalom áttekintése szerint ez az első olyan jelentés, amely dokumentálja azt a mechanizmust, amelyen keresztülechinacosidegátolja az endogén glutamát felszabadulását preszinaptikus szinten.

Az echinacozid antioxidáns lehet

2. Eredmények

2.1.EchinacosideGátolja a 4-aminopiridinnel kiváltott glutamát felszabadulását a patkány cerebrokortikális idegvégződésekből a vezikuláris exocitózis csökkentésével

Az 1. ábra szemlélteti aechinacoside4-aminopiridin-kiváltott glutamát felszabaduláson a tisztított patkány cerebrokortikális szinaptos szinaptosszómákból. Az 1 mM CaCl2-vel inkubált szinaptoszómákban az 1 mM 4-aminopiridin 7,4 ̆ 0,1 nmol/mg/5 perc glutamát felszabadulást váltott ki, amelyet 1, 5, 10, 30 és 50 μM-mel csökkentettekechinacoside6,5 ̆ 0,2, 5,8 ̆ 0,3, 4,8 ̆ 0,2, 4,1 ̆ 0,1 vagy 2,3 ̆ 0,4 nmol/mg/5 perc (F(5,24) = 67,1, p = 0,000). Az IC50 értéke a következőhöz:echinacoside-a dózis-válasz görbéből származó 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulás mediált gátlása 24 μM volt. Ezenkívül az 1 mM 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulás egy extracelluláris Ca2+-mentes oldatban, amely 300 μM etilénglikol-bisz-t (β-aminoetil-étert) tartalmaz-N,N,N1,N1-tetraacetsav (EGTA) 2,1 ̆ 0,2 nmol/mg/5 perc (F(2,12) = 310,65, p = 0,000), és a 4-amino-piridin által kiváltott glutamát felszabadulásának ezt a Ca2+-független komponensét 20 μM-mel nem befolyásoltukechinacoside(1,8 ̆ 0,2 nmol/mg/5 perc; p = 0,58; 1. ábra). A 0,1 μM bafifilomycin A1-gyel kezelt szinaptoszómákban, egy hólyagos transzporter inhibitorban [26] a 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulás szignifikánsan csökkent (2,2 ̆ 0,2 nmol/mg/5 perc; F (2,12) = 249,518, p = 0,000). Bafifilomicin A1 jelenlétében a 20 μM echinacozid nem tudta számottevően gátolni a glutamát felszabadulását (2,1 ̆ 0,2 nmol/mg/5 perc; p = 0,94; p = 0,94; 1. ábra). Ezzel szemben 10 μM DL-treo-béta-benzil-oxiaszpartát (DL-TBOA, glutamát újrafelvétel-gátló) [27], növelte a 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulását 11,8 ̆ 0,4 nmol/mg/5 percre (t(8) = '11,31, p = 0,000). Még DL-TBOA jelenlétében is, 20 μMechinacosidegátolt 4-aminopiridin-kiváltott glutamát felszabadulás jelentős mértékben (7,7 ̆ 0,2 nmol/mg/5 perc; F(2,12) = 87,23, p = 0,000; 1. ábra)

2.2. EchinacosideCsökkenti a citoszolikus ca-t²+Koncentráció, de nem változtatja meg a szinapszomális

Mem brane potenciál

Az 1 mM 4-aminopiridin által okozott szinaptos depolarizáció a Ca-val²+ koncentráció(p= 0,000; 1. táblázat). 20 |vM alkalmazásaechinacosidenem befolyásolta jelentősen a baral Ca-t²+ koncentráció (t(8) = 0,06,p= 0,95), de jelentősen csökkentette a 4-aminopiridin által kiváltott növekedést iia Ca²+ koncentráció (t(10)= 6,16,p =0,000). Ezenkívül 1 mM 4-aminopiridin 3',3',3'-dipropil-diadikarbocianin-jodidban [DiSC₃(5)] fluoreszcencia (p= 0,000). Az o összeadás⁽20 fdM echinakozid nem változtatta meg a nyugalmi membránpotenciált (t(8) = 0,976,p= 0,36) vagy jelentősen megváltoztatja a DiSC 4-aminopiridin által közvetített növekedését₃(5) fluoreszcencia (t(8) = –0,014,p= 0,99; 1. táblázat).

Cistancheechinacosideképes kezelni a vesebetegséget

2.3.Csökkentett CO-érték2+A Cav2.2 (N-type) és a Cav2.1 (P/Q-Type) csatornákon keresztül történő beáramlás a 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulás gátlásával járhatEchinacoside

Szám2azt mutatja, hogy 2 cu-conotoxin MVIIC, egy N-és P / Q-típusú Ca²+ csatorna blokkoló,

csökkent 4-amino-piridin által kiváltott glutamát felszabadulás 7,4 土 0,2-ről 2,0 土 0,1 nmol/mg/5 percre (t(9) = 25,35,p= 0,000). Cu-konotoxin MVIIC jelenlétében a 20 pM echinakozid hatása a 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulásra nem volt szignifikáns (1,8 土 0,2 nmol/mg/5 perc;t(8) = 1,06,p= 0,32). Dantrolene (10 ^M), az intracelluláris Ca inhibitora²+ engedje el Crom az endoplazmatikus retikulumot [28], csökkent 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulást (5,6 土 0,3 nmol/mg/5 perc; F(2,14) = 104,95,p= 0,000). Dantrolen jelenlétében azonban 20 pJMechinacosidemég mindig gátolhatja a glutamát felszabadulását szignifikánsan (3,3 土 0,2 nmol/mg/5 perc;p= 0,000). Hasonló eredményeket figyeltek meg 100 pM 7-klór-5-(2-klórfenia)-1,5-dihidro-4,1-benzotiazzepin-2(3H)-on (CGP37157), a mitokondriális Na membrán-permeaWe blokkolójával⁺/Ca²+ csere. Az öt vizsgált szinaptoszomális készítményben 20 pMechinacoside100 pM-mel kombinálva a CGP37157 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulást 48,3% -kal csökkentette 土 5,2% -kal (F(2,13) = 136,79,p= 7.000), hasonlóan a csak az echinacoside gátlásához (46,2% 土 2,3%;p= 0,89;

2.4.EchinacosideInhibcts 4-aminopiridin-kiváltott (Glutamát felszabadulás a protein kináz C-n keresztüli jelátvitellel

Amint azt a 3. ábra szemlélteti, 10 °jlM 2-[1-(3-dimetil-amino-propropil)indol-3-il]-3-(indol-3-il) maleimid (GF109203X), gen er al protein kináz C inhibitor [29], redukált ed 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulás (F(2,13) = 19,46, p = 0,000). A GF109203X-szel kezelt szinaptoszómákban a 20 pM echinacozidát csak 5,5%- kal csökkentette a 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulást 土 1,8% (p = 0,89), kevesebbel, mint önmagában az echinacoside (42,4% 土 2,3%; p = f.000). Hasonló eredményeket kaptunk 5,6,7,13-tetrahidro-13-metil-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pirrol[3,4-c]karbazol-12-propánnitrillel (Go6976), amely a Ca2+-függő protein-kináz C izoformák (a, |3I, |3II, y) szelektív változata [29]. 3 pM Go6976, 20 pM jelenlétébenechinacosidecsökkentett glutamát felszabadulás 11,9% 土 2,9% (p = 0,59), ami jelentős csökkenést jelent a csak az echinacoside-hoz képest (42,4% 土 2,3%; p = 0,000; 3. ábra). Ezzel szemben a 3 pM rottlerin, egy Ca2+-független protein-kináz C6 inhibitor [30], nem változtatta meg szignifikánsan a 4-aminopiridin (1 mM) által kiváltott glutamát felszabadulást (p = 0,45). Mindazonáltal rottlerin jelenlétében a 20 pM echinacoside hatékonyan 37,1% 土 5,6% -os átlagos gátlást okozott (F(2,13) = 19,72, p = 0,000), hasonlóan csak az echinacoside-hoz (p = 0,41; 3. ábra). Ezenkívül a mitogén által aktivált protein kináz inhibitor 2-(2-amino-3-metoxifenil)-4H-1-benzopyran-4-on) (PD98059) (50 pM) és a protein kináz A inhibitor N-[2-(p-bromocinnamylamino)etil]-5-izokinolineszulfonamid (H89) (100 pM) redukált 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulást (p = 0,000). Még PD98059 vagy H89 jelenlétében is, 20 pMechinacosidehatékonyan csökkentette a felszabadulást (F(2,13) = 52,3, p = 0,000; 3. ábra).

A 4. ábra azt mutatja, hogy a tha11 mM 4-aminopiridin növelte a protein kináz C foszforilációját a szinaptomákban (t(4) = –6,871,p= 0,002). Amikor a szinaptomómákat 20 pM echinacoziddal 10 percig előkezeltük a 4-amino-piridin hozzáadása előtt, a 4-aminopiridin által indukálta protein kináz C foszforilációja jelentősen csökkent (F(2)_egy6) = 29,202,p= 0,00 1).

Echinacosidebancistanchenövelheti aImmunrendszer

2.5.Echinacoside-A glutamát felszabadulásának mediált gátlása nem jár A típusú gamma-amino-vajsavval (GAB)³Egy_Egy) Receptor

Az 5. ábrán az echinacozid hatása a 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabadulására SR95531 (a GABA antagonistája) hiányában vagy jelenlétében_Egyreceptor) összehasonlították. Ezenkívül a 100 pM SR95531 nem változtatta meg szignifikánsan a 4-aminopiridin (1 mM) által kiváltott glutamát felszabadulást. Az

Sr95531-gyel kezelt szinaptomoszok, 20 pM echinacoside alkalmazása 43%-os gátlást eredményezett a 4-aminopiridin által kiváltott glutamát felszabaduláson (F(2,12) = 42,63,p= 0,000), ami nem különbözött szignifikánsan az echinacoside által termelt gátlástól (40%);p= 0,000). Hasonló eredményt kaptunk egy másik GABAa receptor antagonistával, a bicuculline-nal (50 pM). A felszabadulást cikloullin jelenlétében és