1. rész: Az echinacoside véd az MPP +-indukált neuronális apoptózis ellen ROS / ATF3 / CHOP útvonalszabályozással

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

Érintkezés:joanna.jia@wecistanche.com

Pls kattintson ide a 2. részhez

a fajok (ROS) szintén hozzájárulnak a fejlődéséhez [3]. A PD-hez hasonló jellemzőket számos környezeti toxin indukálhatja, beleértve az 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridint (MPTP), a cianidot, a szén-diszulfidot és a toluolt. Az MPTP-t széles körben használják a PD állatmodelljeinek indukálására, és aktív metabolitját, az 1-metil-4-fenil-piridiniumiont (MPP?) a PD sejtmodelljeiben használják [4, 5]. MPP? szelektíven gátolja az elektron transzportláncot, és túlzott ROS-termelést eredményez, ezáltal neuronális halált és PD-re emlékeztető szindrómát idéz elő [6]. A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy az MPP? in vitro PD modellben több útvonalat indukál, beleértve a megnövekedett GSK3B foszforilációt (pY206) és az a-szinuklein felhalmozódást [5], a hem-oxigenáz-1/ni-nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát-oxidáz/ROS tengely [7, 8], az aktív transzkripciós faktor 3 (ATF3) fokozott expresszióját és a növekedés megállítását DNS-károsodással indukálható 153 (GADD153)/C/EBP-homológ fehérje (CHOP) révén [9]. A klinikai kezelésben a ROS termékek szuppressziója az egyik legfontosabb stratégia a neuronok túlélésére és a PD kezelésére [1].

Echinacoside(ECH, 1A ábra), egy természetesfenil-etánoidszámos gyógynövényben megtalálható, afenil-etánoidGlikozidoka hagyományos kínai gyógynövénytől elkülönítve, tCistanchesalsa [10]. Érdekes módon a legújabb tanulmányok kimutatták, hogyECHvédőhatása van az MPTP által indukált PD egérmodellben [10, 11].ECHemellett in vitro csillapítja a tumor nekrózis faktor-a vagy 6-hidroxi-dopamin által kiváltott neuroblasztóma sejtes apoptózist [12, 13]. Azonban azok a mechanizmusok, amelyekECHelősegíti a neuronok túlélését az MPP?-indukált PD sejtmodellben, továbbra sem világos.

Megmutattuk, hogyECHjelentősen csökkentette az MPP által indukált ROS termékeket? SH-SY5Y sejtekben.ECHgátolta az ATF3, a CHOP és az a-synuclein MPP által indukált expresszióját, valamint elnyomta a kaszpáz-3 és a poli (ADP-ribóz) polimeráz (PARP) pro-apoptózis fehérjék aktiválását.

Cistancheechinacosidevanneuroprotektívingóságok

Anyagok és módszerek

Reagensek

A Dulbecco minimális esszenciális közege (DMEM), a magzati szarvasmarha szérum, a 0,25% tripszin, az 1% penicillin/streptomicin és a TRIzol reagens a Life Technologies-től (Grand Island, NY) származott. A biszbenzimid kromatinfesték (Hoechst 33342), poli-L-lizin, MPP? az jodid és az MPTP Sigmából (St. Louis, MO) származott. A lipid peroxidációs malondialdehid (MDA) vizsgálati készlet és a diklór-fluoreszcein-diacetát (DCFH-DA) a Beyotime Biotech-től (Haimen, Kína) származott. A C98% tisztaságú ECH a Push Biotechnology-tól (Chengdu, Kína) származott.

Állatok és kezelések

Az állatok karbantartása és kezelése a korábban leírtak szerint történt [14]. 10 hetes korunkban 24–26 g súlyú hím C57BL/6 egereket (Shanghai Laboratory Animal Co., Shanghai, Kína) használtunk. Az állatokat normál körülmények között tartották (12:12 óra világos: sötét ciklus, 21 ± 2C, és relatív páratartalom 40%), és lehetővé tették az élelemhez és a vízhez való hozzáférést ad libitum. Minden eljárást a Fudan Egyetem Zhongshan Kórház Állatetikai Bizottsága hagyott jóvá, és a Nemzeti Egészségügyi Intézetek útmutatójával összhangban hajtották végre a

Laboratóriumi állatok.

Az egereket véletlenszerűen négy csoportra osztották (10 egér/csoport): A csoport, vivőanyag-kontrollcsoport, egyenlő térfogatú (500 lL) normál sóoldatot (NS) kapva; B csoport, ECH kontrollcsoport, 20 mg/kg ECH-ben; C csoport, MPTP modellcsoport, azonos térfogatú NS-sel előkezelve; és d csoport, ECH-kezelés alatt álló csoport, 20 mg/kg-mal előkezelveECH.ECHNS-ben oldották fel, és 24 óránként gyomoron belüli adagolással adták be 15 egymást követő napon keresztül. A C és D csoportok egér PD modelljét öt egymást követő intraperitoneális injekcióval generálták, amelyek 24 óránként 30 mg/kg MPTP-t tartalmaztak a 11. naptól a 15. napig. Az egereket a méhnyak diszlokációja vagy a perfúzió elpusztította, amelyet a végső kezelés után 24 órával 24 órával 10% klóralhidráttal (3,6 mg/kg) narkotizáltak.

A perfúziót és a szövetfeldolgozást az előzetesen leírt módon írták le [14]. Az intrakardiális perfúzió után az agyi mintákat 4% paraformaldehidben rögzítettük 24 órán keresztül 4 ° C-on, paraffinba ágyazva, és a teljes SNc-t magában foglaló koronális szakaszokat (sztereotaxikus koordináták anteroposterior -3,64 és -2,92 mm között a bregmához képest) 5 lm-re vágtuk.

Minden csoportból további 5 állatot öltek meg a nyaki diszlokáció, és a ventrális középagyat gyorsan lüktették 1% SDS lízis pufferben jégen. A lizátum CHOP és ATF3 fehérjeszintjét nyugati blottinggal elemeztük.

Cistancheechinacosideazzal a hatással jár, hogy felpezsdíti avese

Patkány ventrális középagy kultúrája (VM)

Dopaminerg neuronok

A terhes Wistar patkányokat a Shanghai Laboratory Animal Co.-tól (Sanghaj, Kína) vásárolták. A VM-ben lévő DA neuronokat a 14. embrionális napon izoláltuk. A virtuális gépet szétvágtuk és feldolgoztuk az elsődleges VM DA neurontenyészetek létrehozásához a korábban leírtak szerint [15, 16]. Röviden, a szövetdarabokat jéghideg Hanks kiegyensúlyozott sóoldatába (HBSS) gyűjtöttük össze, és 1000 fordulat / perc sebességgel 4C-on centrifugáltuk 5 percig. A szöveti pelletet 750 lL 0,1% tripszin-HBSS 750 lL-ben inkubáltuk 15 percig 37 ° C-on, 5% CO2-vel. A magzati borjúszérumot (FCS; 750 lL) a tripszin inaktiválására használták, és a szöveteket gyengéd triturációval disszociálták

sterilizált Pasteur pipettával. A sejtszuszpenziókat 1000 fordulat / perc sebességgel centrifugáltuk 4 percig 4 ° C-on, és újra szuszpendáltuk differenciálódó közegben (a Dulbecco módosított Eagle közepes / F12, 33 mmol / L D-glükóz, 1% L-glutamin és 1% FCS, kiegészítve 2% B27-tel). A sejteket poli-D-lizinnel (Sigma) bevont 24 lyukú szövettenyészetes lemezekre oltottuk 5 9 104 sejt/lyuk 500 lL differenciálódó közegben 37 ° C-on, 5% CO2-vel 10 napig, hogy 10 napig 5% CO2-vel együtt 50 napig fejlődjenek, hogy

érett DA neuronok. A VM DA neuronokat immunfluoreszcencia jellemezte anti-b-tubulin izotípus III antitesttel és tirozin-hidroxiláz (TH) antitesttel (Ábra. S1). A sejteket 1 mmol / L MPP?, 40 LG / ml ECH-vel kezeltük, az MPP kombinációjával? és az ECH, vagy csak a PBS mint vezérlő. A sejtek életképességét CCK-8 reagenssel elemeztük 96 órás kezelés után.

és átlagos ± SD-ként jelennek meg (n = 6; **P \0,01 vs kontroll, #P \ 0,05, ##P \0,01 vs MPP? kezelés). C Az MPP által indukált morfológiai változások fénymikroszkópos képei? vagy MPP? és az ECH. a, PBS vezérlés; b, 40 lg/ml ECH; c, 1 mmol/L MPP?; d, 1 mmol/L MPP? és 10 lg/ml ECH; e, 1 mmol/L MPP? és 20 lg/ml ECH; f, 1 mmol/L MPP? és 40 lg/ml ECH (skálarúd, 200 lm).

A Cistanche echinacoside gátolja az apoptózist

SH-SY5Y sejttenyészet

Az SH-SY5Y sejtek a Shanghaii Sejtbiológiai Intézetből (Kínai Tudományos Akadémia, Sanghaj, Kína) származtak, és DMEM-ben tenyésztették őket, kiegészítve 10% magzati szarvasmarhaszérummal, 100 U / ml penicillinnel és 100 U / ml sztreptomicinnel. A sejteket párásított 37C inkubátorban tartották fenn, amelyet 5% CO2-vel láttak el. MPP? steril vízben oldották fel és azonnal felhasználták. Az ECH-t feloszlatták PBS-ben. A ROS-szal kapcsolatos génexpresszió és fehérjeszintek feltárásához a sejteket 6 lyukú lemezekbe vetettük, és 24 órán át tenyésztettük. A sejteket ezután friss közeggel tápláltuk, amely MPP?, ECH, MPP kombinációja? és az ECH, vagy csak a PBS mint vezérlő. 24 órás kezelés után a sejteket 1% SDS lízispufferrel (1% SDS,25 mmol/l EDTA, 45 mmol/L Tris–HCl, pH 6,5) lizáltuk a western blot analízishez, és a teljes RNS-t közvetlenül TRIzol reagenssel izoláltuk.

Az ATF3 és a CHOP eloszlásának a kezelés utáni elemzéséhez nukleáris és citoplazmatikus extrakciós reagenskészleteket (Thermo Fisher, Waltham, MA) használtunk a citoplazmatikus és nukleáris frakciók kivonására a gyógyszerrel kezelt és kontroll sejtekből.

Sejtéletképességi vizsgálat

Az SH-SY5Y sejteket 96 lyukú lemezekbe vetettük, és egyik napról a másikra inkubáltuk. A sejteket 24 óránként tápláltuk egy friss, teljes közeggel, amely különböző gyógyszereket tartalmazott, és 3 napig tartottuk fenn. Ezután az életképességet a CCK8 cellás számlálókészlet segítségével értékelték (Dojindo, Japán). Az adatokat normalizáltuk a PBS-vezérlő eredményeire, és az SD átlagos ±ként jelenik meg. Az ATF3-knockdown SH-SY5Y (ATF3 shRNS) és a kontroll (GFP shRNS) sejtek életképességének elemzéséhez a sejteket 96 lyukú lemezekhez adtuk, és 14–16 h-ra tenyésztettük. A sejteket 1 mmol/l MPP-vel kezeltük? vagy azonos térfogatú PBS 24 óra transzfekció után, majd 3 napig inkubálták őket. A cellaszámokat minden nap megszámolták. Az adatok az SD átlagában ± jelennek meg.

shRNS konstrukciók és oligo primerek

A pGV298-ATF3 shRNS (ATF3shRNS) és a GFP kontroll shRNS konstrukciók a GeneChem Co.-tól (Sanghaj, Kína) származtak. Az ATF3 célsorozat az 50-GCAAAGT G volt! CCGAAACAAGA-30 korábban leírt módszerekből [17, 18]. Az MPP által indukált génexpresszió kimutatására a qRT-PCR-hez ROS stresszel kapcsolatos és PD-hez kapcsolódó géneket választottunk, és a GAPDH-t használtuk kontrollként. Az összes alapozót a Sangon Biotech Co. (Sanghaj, Kína) szintetizálta, és az alapozó szekvenciákat az 1. táblázat tartalmazza.

Valós idejű PCR

A teljes RNS-t TRIzol reagenssel extraháltuk a gyártó utasításainak megfelelően. A fordított transzkripciót és a kvantitatív valós idejű PCR-t (qRT-PCR) a korábban leírtak szerint végeztük. A fordított transzkripciós reakciót a RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (Thermo Scientific, Waltham, MA) segítségével végeztük el a gyártó utasításainak megfelelően. Az SYB Premix Ex Taq II készletet (TaKaRa, Dalian, Kína) qRT-PCR-hez használták: 20 lL reakciórendszereket használtak az ABI-val (Life Technologies, Carlsbad, CA). A PCR-paraméterek a következő lépésekből álltak: 95C 3 percig, 1 ciklus; 95C 5 másodpercre és 60C 40 másodpercre, 40 ciklus. A végső adatok nem voltak-

moralizált a GAPDH-ra, és az ellenőrzés arányában jelenik meg. Az amplifikációhoz használt alapozókat az 1. táblázat sorolja fel.

Nyugati blotting

A western blot analízist a korábban leírtak szerint végeztük el [19]. Az elsődleges antitestek a következők voltak: hasadt kaszpáz 3 és p53 (Sejtjelző Technológia, Danvers, MA), ANTI-GAPDH (Proteintech Group, Chicago, IL), anti- GADD153/CHOP (Wanlei Bio, Shenyang, Kína), valamint anti-ATF3, anti-PARP, anti-PUMA és anti-hiszton 3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). A torma peroxidáz címkével ellátott másodlagos antitestek a Jack- son Immune Research Laboratories-tól (Western Grove, PA) származtak. A PVDF membránok az EMD Millipore-ból (Billerica, MA), az ECL szubsztrát pedig a CWBio-ból (Suzhou, Kína) származtak. A kép szürke szintjein alapuló relatív fehérjeszinteket Tanon GIS szoftverrel (Tanon Biotech, Shanghai, Kína) elemeztük, és az adatokat a célfehérje GAPDH-hoz viszonyított arányaként mutatjuk be.

Cistancheechinacosidea máj védelmét szolgálja