1. rész:A Cistanche Deserticola kivonatai antagonizálhatják az immunszeszcenciát és meghosszabbíthatják az élettartamot az öregedéssel gyorsított egér hajlamos 8 (SAM-P8) egerekben

Kapcsolattartó: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Ke Zhang,1 Xu Ma,1 Wenjun He,1 Haixia Li,1 Shuyan Han,1 Yong Jiang,1

Hounan Wu,2 Li Han,3 Tomohiro Ohno,3 Nobuo Uotsu,3 Kohji Yamaguchi,3 Zhizhong Ma,1,4 és Pengfei Tu1

1 Természetgyógyászati Tanszék, Gyógyszerészeti Tudományok Iskolája, Pekingi Egyetem, Xueyuan Road 38. szám, Peking 100191, Kína

2 Orvosi és Egészséges Elemző Központ, Pekingi Egyetem, No. 38 Xueyuan Road, Peking 100191, Kína

3 Alapkutató Kar, Fancl Research Institute, FANCL Corporation, 12-13 Kamishinano, Totsuka-ku, Jokohama, Kanagawa 244-0806, Japán

4 Hagyományos kínai és nyugati orvoslás integrációs tanszéke, Orvostudományi Alaptudományi Iskola, Pekingi Egyetem, 38. sz. Xueyuan Road, Peking 100191, Kína

A levelezést Zhizhong Ma-nak kell címezni; zhma@bjmu.edu.cn és Pengfei Tu; pengfeitu@bjmu.edu.cn Beérkezett: 2013. július 19.; Módosítva: 2013. október 23.; Elfogadva: 2013. november 11.; Közzétéve: 2014. január 9.; Akadémiai szerkesztő: Adair Santos

1. Bevezetés

Cistanche deserticola, az egyik legnépszerűbb hagyományos kínai gyógynövény-/egészségügyi terméket számos történelmi kínai gyógynövény-gyógyszerkönyvben úgy írták le, mint amelyek öregedésgátló tulajdonságokkal rendelkeznek. Következésképpen Kínában széles körben alkalmazták különböző életkorral összefüggő rendellenességek kezelésére, beleértve a szenilis demenciát, az impotenciát, a meddőséget, a krónikus fertőzést és az idősek hematopoetikus rendellenességeit [1]. A modern kémiai megközelítések lehetővé tették, hogy a Cistanche deserticola fő hatóanyagaként két fő vegyülettípust, a fenil-etánoid-glikozidokat és az oligoszacharidokat izolálják [1]. Az elmúlt évtizedben a Cistanche deserticolát és kivonatait intenzíven tanulmányozták, és kimutatták, hogy képesek megvédeni a neuronokat a neurotoxinok által kiváltott sérülésektől[2], gátolva a szén-tetraklorid által kiváltott hepatotoxicitást [2], és elősegítve a csontvelősejtek co által kiváltott sugárzáskárosodásból való visszanyerését [3]. Azt is kimutatták, hogy gyulladáscsökkentő, antioxidáns és öregedésgátló hatása van [4]. Azonban, hogy a Cistanche deserticola növelheti-e az élettartamot, és melyek a mögöttes molekuláris mechanizmusok [3], amelyek aöregedésgátlóa tulajdonságokat nem tesztelték szigorúan.

Öregedésgátló Cistanche deserticola kivonatok

Immunszenszcencia, vagyis az immunrendszer megváltozása az életkorral együtt képezi azt a hátteret, amely alatt az idősek fertőzéseire, rákra, neurodegeneratív betegségekre és autoimmun betegségekre való fokozott fogékonyságot figyeltek meg [5]. A terápiás beavatkozásokról, például a kalóriakorlátozásról [6] és az E-vitamin-kiegészítésről azt jelentették, hogy hatékonyan késleltetik az immunszenszcencia progresszióját, és ezáltal csökkentik egyes életkorral összefüggő betegségek morbiditását, valamint meghosszabbítják mind az emberek, mind a rágcsálók élettartamát [7, 8]. Az ezen a területen végzett vizsgálatokat azonban bonyolítja az a tény, hogy az öregedés az egyidejű immunhiány és a krónikus gyulladás paradoxonjával jár [9]. Ez azt jelenti, hogy a limfocita pro- felszabadulás vagy gyulladáscsökkentő egyszerű stimulálása nem jelent ideális terápiás beavatkozást az öregedéssel és az életkorral összefüggő állapotok kezelésében [10]. Következésképpen az életkorral összefüggő állapotok megelőzésére vagy enyhítésére alkalmas orvosi beavatkozások keresése során, beleértve a fertőzéseket, a rákot, az autoimmun betegségeket, az ateroszklerózist és a neurodegeneratív betegségeket, amelyek a halál és a fogyatékosság okait vezetik, és az immunrendszeri hibák helyreállítását a gyulladásos válaszok gátlásának kell kísérnie.

Az öregedéssel gyorsított egér [11] egy beltenyésztett egérmodell, amely az AKR/J törzsből származik, és amelyet széles körben használnak az öregedés tanulmányozásában. Ezeknek az egereknek a P8 alstrainja (SAM-P8) élettartama jelentősen lerövidült az R1 alstrainhoz (SAM-R1) képest, amely lassabb öregedési folyamatot is mutat [12]. Korai öregedésükkel párhuzamosan a SAM-P8 egerek fokozott neurológiai öregedést, immunszekvenciát és életkorral összefüggő hematopoetikus hiányokat is mutatnak, amelyek szorosan utánozzák a tipikus emberi öregedési jellemzőket [13, 14]. A felgyorsult öregedési folyamatért és az életkorral összefüggő rendellenességekért felelős mögöttes mechanizmusok elemzése azt mutatja, hogy a mitokondriális diszfunkció [15], az oxidatív stressz és a megnövekedett szomatikus DNS-mutációs ráta mind szerepet játszanak [16, 17]. Ez az egérrendszer homogén genetikai hátterével tehát kiváló kísérleti modellt nyújt az öregedés és az öregedésgátló terápiák tanulmányozásához [12], amelyeket a kínai Pekingi Egyetem Gyógyszerészeti Tudományok Iskolájának herbáriumában helyeztek el.

cistanche öregedésgátló lehet

2. Anyagok és módszerek

2.1. Anyagok.

FrissCistanche deserticola Y. C. MAÉszaknyugat-Kína különböző területeiről gyűjtötték be, beleértve Hszincsiangot, Neimenggut és Ningxia autonóm régiókat. A kivonatok elkészítéséhez használt mintákat Pengfei Tu professzor, a Pekingi Egyetem Gyógyszerészeti Tudományok Iskolájának Természetgyógyászati Tanszékének farmakognógiai szakembere hitelesítette. A Cistanche deserticola utalványpéldánya (CD-2007-03-08 szám) a Tudományos Központ (Peking, Kína) volt. Ezt a tanulmányt a Pekingi Egyetem Állatkutató Bizottsága hagyta jóvá, és a Pekingi Egyetem laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó irányelveknek megfelelően végezték el. Ezeknek az egereknek a tanúsítási száma SCXK2001-2008 volt. Az egereket standard metabolikus ketrecekben tartották környezetvédelmi szempontból

C, 45–60% páratartalom és 12 óra világos/sötét ciklus), és lehetővé tette az élelmiszerhez és a vízhez való szabad hozzáférést. 2 hetes akklimatizáció után az állatokat öt csoportra osztották: 3 ECD kezelési csoportra, egy SAM-R1 kontrollcsoportra és egy kezelés nélküli SAM-P8 kontrollcsoportra. A 3 kezelési csoport étrendjét kiegészítettük az ECD különböző koncentrációival kevert étrenddel: alacsony (50 mg/kg), közepes (150 mg/kg) és magas (450 mg/kg) átlagos ECD dózisok napi hozamával. A SAM-R1 és a SAM-P8 nem kezelt kontrollcsoportokat ugyanazzal az étrenddel táplálták ECD nélkül. A kísérlet során az összes állat táplálékfelvételi mérését háromnaponta végeztük. Vérnyomás és szívhónapok a kísérlet időtartama alatt az egerek egészségi állapotának meghatározására. Az egyes egerek élettartama életképes apoptotikus volt, és a nekrotikus limfociták mennyiségi meghatározása az Annexin V-FITC készlet segítségével (Peking Biosea Biotechnology Co., Ltd., Peking, Kína) számszerűsítették. A limfocitákat kettős festésnek vetettük alá fluoreszcein-izotiocianát konjugált konjugált V. melléklettel (Annexin V-FITC) és propid-szuszpendált 200 kötő pufferben (10 mM HEPES/NaOH,

2.2 Cistanche deserticola (ECD) kivonatok és HPLC-elemzés.

Levegőn szárított és szeletelt Cistanche deserticola(2,0 kg) porítottuk és kétszer extraháltuk 70% -os etanollal 1 órán keresztül. A felhasznált növény/etanol aránya az első extrakciónál 1/6 (w/w) és a másodikban 1/4 (w/w) volt. A két kivonatot összekevertük és szűrtük, mielőtt 60 °C-on csökkentett nyomás alatt 1,10–1,15 relatív sűrűségre koncentráltuk volna őket. Ezt a koncentrátumot ezután porszívózták, és a kapott por a Cistanche deserticola (ECD) kivonata volt, amelyet a vizsgálat során felhasználtak.

Az ECD összetevőit HPLC-vel elemeztük a korábban leírtak szerint [1]. Röviden, 100 mg ECD port feloldottunk 10,0 ml H O-ban, és szűrés után befecskendeztük a HPLC-be. A HPLC-elemzést Agilent 1100 folyadékkromatográfiás rendszeren végeztük (Agilent Co., USA) A mobil fázis metanol (A) és 0,10% metanolsav (B) keverékéből állt. Gradiens kromatográfiás programot alkalmaztak; ez 0–7 perc alatt 26,5% (A) és 73,5% (B), 8–10 perc alatt 26,5–29,5% (A) és 73,5–70,5 (B), 20–27 perc alatt pedig 29,5% (A) és 70,5% (B) volt. Az áramlási sebességet 1,0 ml/percen állandóan tartottuk, a befecskendezési térfogat 10 ml volt, az oszlop hőmérsékletét pedig 25 °C-on tartottuk. Az oszlop kiáramlásának ellenőrzésére és kromatogramok előállítására 330 nm-re beállított UV-detektort használtunk.

Szárított és szeletelt Cistanche deserticola

Fenil-etánoid-glikozidok és a cistanche oligoszacharidjairetenciós idejükből és abszorpciós spektrumukból azonosították őket. A számszerűsítést külső standard kalibrációs görbékkel végeztük. AzCistanche deserticola kivonatai(ECD) körülbelül 3,33%, a fenil-etánoidok tartalma pedig 17,94% volt. Az acteoside és az echinacoside volt a két fő alkotóelem ebben a frakcióban, tartalmuk 3,80%, illetve 8,25% volt. Az oligoszacharidok a teljes ECD 82%-át teszik ki. Az ECD fő aktív komponenseinek koncentrációját az 1. táblázat mutatja be.

2.3 Az állati élettartamok elemzése.

Ez a tanulmány annak vizsgálatára összpontosított, hogyCistanche deserticola kivonataiképesek meghosszabbítani a SAM-R1 egerek élettartamát, amelyeket a Pekingi Egyetem Egészségügyi SAM-P8 egerek Laboratóriumi Állattenyésztési és Kutatóközpontjától vásároltak, és megfordítják immunszeszcenciájukat.

2.4. Statisztikai elemzés.

Az adatok átlagértékekként jelennek meg S.D. A különböző csoportok közötti összehasonlításokat egyirányú ANOVA végezte egy poszt hoc teszttel. Az élettartam-vizsgálatban az adatok Kaplan-Meier túlélési elemzésen mentek keresztül, amely magában foglalta mind a Log-rank (Mantel-Cox), mind a Gehan-Breslow-Wilcoxon tesztek használatát. A statisztikai elemzést a Statisztikai Társadalomtudományi Csomag Windows rendszerhez (SPSS, foszfátpufferes sóoldat (PBS, pH 7,4) 0,01% nátrium-azidot tartalmazó alkalmazásával végeztük, és FCM-elemzésnek vetettük alá. A limfocita alpopulációkat áramlási citometriával elemeztük facs Calibur áramlási citométer (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) és BD CellQuest elemző szoftver segítségével. Chicago, IL) és a jelentős.

Fenil-etánoid-glikozidok és a cistanche oligoszacharidjai

3. Eredmények

0,05-nél kisebb értéket vettünk figyelembe.A perifériás T limfociták sejtéletképességének értékelése Annexin V-FITC és PI kettős festéssel és FACS elemzéssel. A SAM-P8 egerek három adag ECD-vel történő, 4 héten át történő étrend-kiegészítését követően az állatokat 12 órán át rögzítették, majd érzéstelenítették, és vért gyűjtöttek és elemeztek.

3.1. A Cistanche deserticola (ECD) kivonataiban található potenciális aktív komponensek elemzése. Amint azt az 1. táblázat mutatja, az ECD főként kétféle vegyületből áll, fenil-etánoid-glikozidokból és oligoszacharidokból. A fenil-etánoid glikozidokban az echinakozidot, az akteozidot és a 8-epilogénsavat azonosították, míg az oligoszacharidokban csak galaktitot azonosítottak.

3.2.TheImpact ofCistanchedeserticolakbdO4ctsa SAM-P8 egerek átlagos élettartama alapján. Ehhez és az azt követő vizsgálatokhoz a nyolc hónapos hím SAM-P8 egereket 4 csoportra osztották. Közülük az egyik csoportomikumot normál étrenddel, ECD nélkül kezelték, a másik 3 csoport külön-külön fogyasztotta el az ECD különböző arányú étrendjét. A SAM-R1 alstrainból származó egereket, amelyek anormális öregedési folyamattal és élettartammal rendelkeznek, minden kísérletben kontrollcsoportként használták fel.

A kontroll SAM-R1 csoporthoz képest a SAM-P8 egerek átlagos élettartama jelentősen lerövidült (1(a) ábra);<0.001). although="" supplementation="" of="" diet="" with="" the="" low="" dose(50mg/kg)of="" ecd="" failed="" to="" produce="" a="" significant="" increase="" in="" life="" spanofsam-p8mice,="" at="" the="" medium="" (150="" mg/kg)and="" high(450="" mg/ml)="" supplementary="" doses="" there="" was="" a="" dose-dependent="" increase="" in="" life="" span="" (figures="" 1(a)and=""><0.05 0.0thatwasconfirmedby="" kaplan-meier="" survival="" analysis,="" which="" included="" use="" of="" both="" the="" log-rank="" (mantel-cox)="" and="" gehan-breslow-wilcoxon="">

3.3. Az immunszenszcencia megfordítása SAM-P8 egerekben Cistanche deserticola (ECD) kivonatokkal. A perifériás naiv T-limfociták csökkenése és a perifériás memória T-limfociták egyidejű növekedése az immunszenszcenciának kiemelkedő jellemzői, amelyeket széles körben az életkorral összefüggő immunológiai rendellenességek fő kiváltó okainak tekintenek. Ez az immunszcencia a SAM-P8-ban a SAM-R1-hez viszonyítva

aniftalsv0agtleararan nyilvánvaló, amikor a FACS analízis a (CD3 +CD44wCD4Bigh) limfociták enumerálására irányult, mint a naiv T-sejtek indikátora és (CD3+ CD44gh CD45 BR limfociták a memória T-sejtek san indikátora. Így a SAM-P8 egerekben az inbpth perifériás vér (2. ábra) és a lépsejt (3. ábra)popu-lációk redukált szintjei csökkentek a takonyos Tcellák és a memória T-sejtek szintjének emelkedése. A SAM-P8mice étrendjének ECD-vel való kiegészítése dózisfüggő módon képes megfordítani az immunceszcencia ezen mutatóit mind a perifériás vérben (2. ábra), mind a lépsejtes populációkban (3. ábra). Az immunszeszcencia ECD-rugalmas étrend-adás általi megfordításának további mutatójaként a naturalkiller [18]sejtek szintje, a veleszületett immunrendszer amajor sejt markere, analizálták. Ez azt mutatta, hogy az ECD étrend-kiegészítés az NK (CD3+ CD49+) sejtek dózisfüggő növekedését eredményezte mind a perifériás vérben (4. ábra), mind a lépsejtben (5. ábra) limfocita populációkban.

3.4. A Cistanche deserticola kivonatai erősítik a Sca-1 pozitív sejtek relacenciális fluoreszcencia intenzitását SAM-P8 egerekben. Az őssejt antigén-1 (Sca-1)a hematopoetikus őssejtek (HSC) egyik legjelentősebb biomarkere a csontvelősejt-populációkban. A Sca-1 pozitív sejtek olyan limfocita progenitorokat is képviselnek, amelyeket újonnan exportáltak a csontvelőből a perifériás vérbe, ahol átesnek.

2. ábra:FACSanalízis az ECD-vel történő étrend-kiegészítés hatására anaiveand memory Tlymphocytesin perifériás blúderre. A nyolc hónapos hím SAM-P8 és kontroll SAM-RI egereket 5 csoportra osztották. ASAM-P8 állatok 3 kezelési csoportját négy héten át alacsony (100 mg/kg), közepes (500 mg/kg) és magas (2500 mg/kg) ECD dózisokkal kiegészített étrenddel, valamint a két kontrollállattal egészítették ki

gatingon CD3+Tcels.A vonalakhownoneachplotindikálják a CDD44x* és CD45 megkülönböztetésére használt küszöbértékeket a naiv(CD3+Cp b"C4RB→) és a memória(CD3+CD4hCD 4Bl)T-sejtek teljes alacsony azonosítását kell használni. b)A csoportokat ábrázoló hisztogramot ugyanazon a diétán táplálták, anélkül, hogy a csoportokat kiegészítették volna. 12 órás böjtölést követően perifériás vért gyűjtöttek anesztezizálódott RB Tcellsubsets állatoktól, és FACS-elemzésnek vetették alá őket az 5. szakaszban leírtak szerint. a) A miæ különböző csoportjainak reprezentatív FACS-alkalmazásai a naiv T-sejtek százalékos arányát generálták a különböző állatcsoportok perifériás vérében. vagy Hisztogram, amely a különbözőanimális csoportok perifériás vérében lévő metrikus Tcellák százalékos arányát mutatja. A sávok az átlag±SD-t jelölik (minden csoportban = 10).<0.05sam-p8versus>

3. ábra: FACSanalízis az ECD-vel történő étrend-kiegészítés hatásának a vizsgálati és amemory Tlymphocitákra gyakorolt hatásáról inspleens. Nyolc hónapos hímSAM-P8 és kontrollSAM-RI egereket osztottak,5 csoportokra. A SAM-P8 állatok3 kezelési csoportját négy hétig etették alacsony (100 mg/kg), közepes (500 mg/kg) és magas (2500 mg/kg) ECD és thetwocontrolanimalis csoportok ecd és thetwocontrolanimalis csoportokkal kiegészített étrenddel, gatingon CD3+Tcellák által. Az egyes ábrákon látható sorok azt jelzik, hogy a CDD44zhand CD45 bw megkülönböztetésére kell használni, amely lehetővé teszi a naiv (CD3 + CD "CsRB动) és a memória (CD3 + CD42CD I'm) Tcels azonosítását.(b)A hisztogramot ugyanazon az étrenden táplálták kiegészítés nélkül. A 12 órás böjtölést követően a lép limfocitákat érzéstelenített RB T-sejt részhalmaz állatokból gyűjtöttük össze, és FACS-elemzésnek vetettük alá az 5. szakaszban leírt összes s-t. a) A különböző mikrofoncsoportok reprezentatív FACS-példányai.

4. ábra:Az ECDdietáris kiegészítés hatása a természettudományoskiller sejtekre (NKcells, CD3+ CD49+ Tcells)a SAM-P8 egerek perifériás vér limfocita populációira. A nyolc hónapos hím SAM-P8 és kontroll SAM-RI egereket 5 csoportra osztották. A SAM-P8 állatok 3 kezelési csoportját négy héten át etették alacsony (100 mg/kg), közepes (500 mg/kg) és magas (2500 mg/kg) ECD dózisokkal kiegészített étrenddel, és a két kontrollállatcsoport ugyanazt az étrendet kapta kiegészítés nélkül. A 12 órás éhgyomorra után perifériás vért gyűjtöttek érzéstelenített állatokból, és facsanalízisnek vetették alá őket az 5. szakaszban leírtak szerint. és A ReprezentációFACS a CD3+CD49+Tcellákon történő kapuzással generált egerek különböző csoportjainak ábrázolása. b) Hisztogram, amely a különböző elemcsoportok perifériás blúdiájában a Tcellvariális csiga százalékos arányát mutatja. Barsrepresentensa közép±SD (ineach csoport,=10).=<0.01><0.01 each="" treatedgroup="" versussam-p8group="" (byone="" way="" anovawith="" post="" hoc="">

5. ábra: Az ECD étrend-kiegészítő hatása a természetgyilkos sejtekre (NKcells, CD3+ CD49+ T-sejtek) a SAM-P8 egerek splenikus limfocitáiban. A nyolc hónapos hím SAM-P8 és kontroll SAM-RI egereket5 csoportokra osztották. A SAM-P8 állatok 3tkezelési csoportját négy héten át etették, az ECD közepes (500 mg/kg) közepes (500 mg/kg) és magas (2500 mg/kg) dózisaival kiegészített étrenddel, és a két kontrollállatcsoportot ugyanazon az étrenden, kiegészítés nélkül táplálták. 12 órás böjtölést követően.a splein limfocitákat érzéstelenített állatokból gyűjtöttük össze, és az 5. szakaszban leírtUK FACSanalízisnek vetették alá. és Reprezentatív FACSplotsofthe különböző egércsoportok, amelyeket a CD3+ CD494 T sejteken történő kapuzás generál. vagy Hisztogram, amely a természetes gyilkos T-sejtek százalékos arányát mutatja a különböző állatcsoportok splenikus limfocitáiban. A sávok az átlagos SD-t jelölik (minden csoportban=10), #< 0.01="" sam-p8="" yersus=""><0.01 eachtreatedgroup="" versussam-p8group(by="" oneway="">

További differenciálódás különböző típusú érett limfocitákká. Következésképpen ezek a Sca-1 pozitív sejtek jelentik a naiv T limfociták fő forrását a perifériás vérben. A 6. ábra azt mutatja, hogy a SAM-R1 kontroll egerekhez képest a SCA-1 pozitív sejtek relatív fluoreszcencia-intenzitása a SAM-P8 egerekben lényegesen alacsonyabb volt. Kimutatták, hogy a SAM-P8mice étrend-kiegészítése három különböző ECD dózissal jelentősen növeli a Sca-1 pozitív sejtek relatív fluoreszcencia intenzitását (6. ábra).

A cistanche gyógynövény előnye: öregedésgátló