1. rész|A Herba Cistanche kivonat fokozza a mitokondriális ATP képződést a patkányszívekben és a H9c2 sejtekben

Kapcsolatfelvétel: emily.li@wecistanche.com

Hoi Yan Leung és Kam Ming Ko

Biokémiai tanszék, Hongkongi Tudományos és Technológiai Egyetem, Clear Water Bay, Hong Kong SAR, Kína

Kulcsszavak: ATP,Cistanche deserticola, H9c2 sejtek, szív, mitokondriumok

Absztrakt

A gyógyszer farmakológiai alapjainak vizsgálataYang- élénkítőA Herbal Cistanche [a szárított egész növényeCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae)], a kínai orvoslásban a Herba Cistanche metanolos kivonatának a mitokondriális ATP-képző képességre gyakorolt ​​hatását ex vivo patkányszívmodell és in situ H9c2 sejtvizsgálat segítségével vizsgálták. A Herba Cistanche kivonattal végzett kezelés dózisfüggő módon növelte a szívizom mitokondriális ATP-képző képességét patkányokban, in vitro mérésekkel értékelve. Az ATP-termelési kapacitás stimulálása a mitokondriális elektrontranszport párhuzamos fokozódásával járt együtt, amelyet piruvát támogat, de szukcinát nem. A Herba Cistanche kezelés szintén növelte a szívizom mitokondriális I-es és III-as komplex aktivitását, az I-es komplex aktivitásra gyakorolt ​​stimuláció mértéke pedig nagyobb. A Herba Cistanche kezelés dózis- és időfüggő növekedést eredményezett a mitokondriális ATP termelő kapacitásában H9c2 sejtekben. Az eredmények azt mutatják, hogy a Herba Cistanche kezelés képesnöveli a mitokondriális ATP termelésétpatkányszívekben ex vivo és H9c2 sejtekben in situ, esetleg ezen keresztülfokozza az oxidatív foszforilációt.

A Cistanche javíthatja a szívműködést, csökkentheti a vérnyomást és a vérzsírszintet

Bevezetés

A "Yang élénkítés", amely a test működésének általános fokozását testesíti meg a kínai orvoslásban, magában foglalja az energia felhasználását különböző biokémiai folyamatok mozgatására.

Ebben a tekintetben az ATP, amely a sejtműködést tápláló energia univerzális pénzneme, főként a mitokondriumok oxidatív foszforilációján keresztül keletkezik. Azt feltételeztük, hogy "Yang élénkítő" gyógynövényekképes növelni a mitokondriális ATP termelő kapacitást(Ko et al., 2004). Ezt támasztja alá az a közelmúltbeli megállapításunk, hogy a "Yang-élénkítő", de nem a "yin-tápláló" kínai tonizáló gyógynövények ex vivo fokozhatják a szívizom ATP-képző képességét egérszívekben (Ko et al., 2006). A Herba Cistanche, a Cistanche deserticola YC Ma (Orobanchaceae) szárított egész parazita növénye (a virág kivételével)'A jang-élénkítő" tonizáló gyógynövény a hagyományos kínai gyógyászatban (Chen, 1998), és számos, a Yang-élénkítésre használt kínai szabadalmi készítményben a legnépszerűbb összetevőként jelenik meg. Kínában és Japánban a Herba Cistanche-t széles körben használják számos Yang-hiánytünet kezelésére. Farmakológiai vizsgálatok azt mutatták, hogy a Herba Cistanche képesmegköti a szabad gyököket(Xiong et al., 1996),nyugtatót termelnek(Lu, 1998),öregedésgátló(Lee et al., 1990),antinociceptív és gyulladáscsökkentő hatások(Lin et al., 2002), ésfokozza az immunrendszer működését(Wu et al., 2005). A Herba Cistanche fő hatóanyaga azfeniletanoid glikozidok(Ouyang et al., 2003), amelyekről kiderült, hogy vannakantibakteriális, stresszoldó és antioxidáns hatásútulajdonságai (Xiong és mtsai, 1998), valamint anti-apoptotikus hatások a tenyésztett neuronokra (Tian és Pu, 2005). Jelen tanulmányban a Herba Cistanche Yang-élénkítő hatásának farmakológiai alapjainak vizsgálata érdekében a Herba Cistanche kezelés hatásait vizsgáltuk a patkányszívekből ex vivo és in situ tenyésztett H9c2 kardiomiocitákból izolált mitokondriumok ATP-képző képességére. Az ATP-termelést fokozó hatás mögött meghúzódó biokémiai mechanizmusok feltárására a Herba Cistanche kezelés mitokondriális elektrontranszportra és komplex I-IV aktivitásokra gyakorolt ​​hatását is megvizsgálták patkányszívekben.

A Cistanche hatékony összetevői képesek megkötni a különféle aktív oxigén szabad gyököket

Anyagok és metódusok

Vegyszerek, sejtkultúrák és növényi anyagok

Az ATP-t, az ADP-t és a 3-[4,5-dimetil-tiozol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólium-bromidot (MTT) a Sigma Chemical Co.-tól vásároltuk (St. Louis, MO, USA). A luciferáz oldatot (ATPlite) a PerkinElmertől (Boston, MA, USA) szereztük be. A Dulbecco módosított Eagle táptalajt (DMEM) és magzati szarvasmarha-szérumot (FBS) a GIBCO BRL Life Technologies-tól (Grand Island, NY, USA) vásároltuk. A H9c2 sejtvonalat az ATTC-től (Rockville, MD, USA) vásároltuk. A Herba Cistanche-t egy helyi gyógynövénykereskedő (Lee Hoong Kee) szállította. A gyógynövényt a szállító hitelesítette, és egy utalványmintát (HKUSTY00301) letétbe helyeztek a Hongkongi Tudományos és Technológiai Egyetem (HKUST) Biokémiai Tanszékén.

Gyógynövénykivonás

A Herba Cistanche-t (100g) apró darabokra vágtuk, majd 300 ml metanolban 65 °C-on 2 órán át visszafolyató hűtő alatt forralva extraháltuk. Az eljárást kétszer megismételték. Az egyesített extraktumot az oldószer csökkentett nyomáson történő elpárologtatásával szárítottuk, és a Herba Cistanche metanolos kivonatát 39 tömeg%-os hozammal kaptuk. A kémiai elemzés azt mutatta, hogy a Herba Cistanche metanolos kivonata összesen szaponint, összes flavonoidot, összes lignánt és poliszacharidot tartalmazott 1,62 (w/w), 0,08%, 0,15% és 75,6% koncentrációban.

Állatgondozás

Felnőtt hím Sprague-Dawley patkányokat (8-10 hetes; 250-300 g) 12-órás sötét/világos ciklus alatt tartottunk levegő/páratartalom ellenőrzött helyiségben, körülbelül 22 °C-on, és ad libitum kaptak táplálékot és vizet. a HKUST állatgondozóiban. A kísérleti protokollokat a HKUST Kutatási Gyakorlati Bizottsága hagyta jóvá.

Gyógyszeres kezelés

Az állatokat véletlenszerűen csoportokra osztották, mindegyikben öt-hat állatot. A kezelt csoportokban a patkányoknak intragasztrikusan adagoltuk a Herba Cistanche metanolos kivonatát (vízben oldva/szuszpendálva) növekvő napi dózisban ({{0}},031-0,5 g/kg) 3 napon keresztül. A kontroll állatok csak vizet kaptak. Huszonnégy órával az utolsó adagolás után a szívet fenobarbitállal érzéstelenített állatokból vettük ki, és biokémiai elemzésnek vetettük alá.

Mitokondriális frakciók előállítása és az ATP termelő kapacitás mérése (ATP-GC) ex vivo

A szív bal kamrai szövetmintákat kivágtuk, és jéghideg izotóniás pufferrel (0,32 M szacharóz, 1 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl, pH 7,4) öblítettük. A szív mitokondriális frakcióit differenciális centrifugálással állítottuk elő izotóniás pufferben 4°C-on. 10%-os (w/v) szívhomogenizátumot készítettünk a darált kamrai szövet homogenizálásával teflonüveg homogenizátorral 4000 fordulat/perc sebességgel 20-30 teljes ütésen keresztül. A homogenizátumot 600 x g-vel centrifugáltuk 10 percig, hogy eltávolítsuk a sejtmagokat és a sejttörmeléket. A felülúszót ezután 8000 x g-vel 30 percig centrifugáltuk a mitokondriumok ülepedése céljából (Evan, 1992). A pelleteket 1 ml izotóniás pufferben szuszpendáltuk, és a mitokondriális frakciókat helyreállítottuk. A kezeletlen állatok mitokondriális ATP-GC-jét Leung és mtsai. módszerével mérték. (2005)

A cistanche poliszacharidok késleltethetik a szervek fiziológiás degenerációját és a sejtmorfológiai degenerációt

Mitokondriális elektrontranszport mérése

Az elektrontranszport mérése izolált mitokondriumokban, amely az MTT redukcióján alapul, amint azt Cohen és munkatársai leírták [1]. (1997). A mitokondriumokat 1 mg/ml fehérjekoncentrációban állítottuk elő inkubációs pufferrel (250 mM szacharóz, 50 mM HEPES, 10 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7,4). . A mitokondrium egy aliquot részét (40 µl) összekeverjük 100 µl 15 mM piruváttal vagy 0,5 mM szukcináttal és 0,42 mg/ml MTT-vel. A reakcióelegyet 37 °C-on 10 percig enyhe rázatás mellett inkubáltuk. Az inkubálás után a reakcióelegyet 100 µl lízispuffer (10 tömeg/térfogat százalék, nátrium-dodecil-szulfát és 45 százalék dimetil-formamid, jégecettel pH 4,7-re beállított) hozzáadásával leállítottuk. 5 perces állás után a reakcióelegy abszorbanciáját leolvastuk egy mikrotiterlemez-leolvasóval (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), és 570 nm és 630 nm közötti különbségként adtuk meg. Az adatokat a kontroll (azaz Herba Cistanche-kezeletlen) csoport átlagértékének százalékában fejeztük ki.

Sejttenyésztés

A H9c2 sejteket, a szívizomsejtekből származó állandó sejtvonalat (Hescheler és mtsai., 1991), monorétegként tenyésztettük 10 térfogatszázalékos FBS-sel kiegészített DMEM-ben. A tápközeg glükózt (4,5 g/l) és glutamint (4,5 mM) tartalmazott, NaHC03-mal (17 mM), penicillinnel (100 IU/ml) és sztreptomicinnel (100 µg/ml) kiegészítve. Minden sejtet 5% (v/v) CO2 atmoszférában tenyésztettünk levegőn 37 °C-on. A táptalajt 2-3 naponta friss táptalajra cseréltük. A sejttörzseket 75 cm2-es tenyészlombikban növesztjük, és az összefolyás előtt szétválasztjuk 1:10 szubtenyésztési arány mellett. Az ATP-GC vizsgálathoz a H9c2 sejteket 2,5 × 104 sejt/lyuk sűrűséggel egy 24-lyukú lemezre oltottuk. A sejttapadás után Herba Cistanche kivonatot (foszfáttal pufferolt sóoldatban oldva; PBS) alkalmaztunk a táptalajba, és a sejteket növekvő ideig (2-16 óráig) inkubáltuk. A kontroll (kezeletlen) sejtek csak PBS-t kaptak.

Az ATP-GC in situ mérése

A HerbaCistanche kivonattal, növekvő koncentrációjú (5{{10}}–300µg/mL) megadott inkubációs periódusok után elvégeztük az ATP-GC vizsgálatot. A táptalajt leszívtuk, és a sejteket digitoninnal (50 µg/ml) kezeltük inkubációs pufferben (120 mM KCl, 5 mM MKH2PO4, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0,1 mM MgCl2, 0,5% BSA, pH 7,4 percen keresztül) 7,3 °C-on. ◦C. A digitalonin leszívása után glutamátot (5 mM), malátot (5 mM) és ADP-t (60 µM) adtunk a sejtekhez a mitokondriális ATP képződés céljából, amit növekvő időintervallumokban, 0 és 15 perc között figyeltünk meg. A reakciót 60 µl perklórsav (30 tömeg/térfogat%) hozzáadásával állítottuk le, majd a reakcióelegyeket 600 x g-vel centrifugáltuk 10 percig 4 °C-on. A felülúszó egy aliquot részét (120 µl) 90 µl 1,4 M KHCO3-mal kevertük a semlegesítéshez. A keverékeket ismét centrifugáltuk 600 × g-vel 4 °C-on, és a felülúszók ATP-tartalmát a korábban leírtak szerint mértük. A kezeletlen sejtek ATP-GC-értékét úgy becsültük meg, hogy kiszámítottuk a grafikon görbe alatti területét (AUC1), ábrázolva az ATP-t (nmol/mg fehérje) az idő függvényében (0-15 perc) és tetszőleges egységekben kifejezve. A HerbaCistanche-kezelt sejtek esetében a növekvő inkubációs idők (3, 5, 7, 10 és 15 perc) AUC1 értékeit a kezeletlen minták megfelelő átlagos kontrollértékére normalizáltuk, és százalékos kontrollként fejeztük ki. Ezután kiszámítottuk a görbe alatti területet (AUC2) a százalékos kontrollértékeket ábrázoló grafikonon az inkubációs idő (3–15 perc) függvényében, és tetszőleges egységekben fejeztük ki. A Herba Cistanche-val kezelt csoportok adatait a kontroll százalékában fejeztük ki az egyenletből:

[AUC2 (HerbaCistanche − kezelt)/AUC2 (kezeletlen)] × 100 százalék

Az I-IV komplex és a citrát szintáz aktivitás mérése

A mitokondriális elektrontranszport lánc (ETC) komplex I-III aktivitását spektrofotometriás módszerekkel mértük komplex-specifikus szubsztrátokkal (NADH a komplex I, szukcinát a komplex II és decylubiquinol a komplex III) a leírtak szerint (Grad & Lemire, 2004; Hsu et al. , 2005; Mark et al., 2001). A komplex IV aktivitást a Sigma cég citokróm c oxidáz tesztkészletével mértük. A mitokondriális citrát szintáz aktivitást Srere (1969) módszerével mérték.

Fehérje vizsgálat

A mitokondriális frakciók és sejtlizátumok fehérjekoncentrációit BioRad protein assaykit segítségével határoztuk meg, standardként szarvasmarha szérumalbumint használva ({{0}},038-0,600 mg/ml).

Statisztikai analízis

Minden adatot átlag ± standard hiba az átlag (SEM) értékben fejeztünk ki. Ezeket egyutas varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük. Utólagos többszörös összehasonlítást végeztek az LSD-vel. P értékek<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

Eredmények

A Herba Cistanche kezelés hatása a szívizom mitokondriális ATP-GC-re patkányokban

Amint az 1. ábrán látható, a Herba Cistanche kivonattal végzett kezelés legfeljebb 0,5 g/kg dózisban dózisfüggő módon növelte a szívizom mitokondriális ATP-GC-jét patkányokban, a stimuláció mértéke 89 százalékos dózis mellett. 0,5 g/kg.

A Herba Cistanche kezelés hatása a mitokondriális elektrontranszportra patkányszívekben

Az elektrontranszport mértékét izolált mitokondriumokban az MTT csökkenésének monitorozásával mértük. A vizsgálathoz használt szubsztrát piruvát vagy szukcinát volt.

1. ábra: A Herba Cistanche-kezelés hatása a mitokondriális ATP-képző kapacitásra patkányszívekben ex vivo

Minden sáv a témát ± SEM jelenti, n {{0}} értékkel. Az állatokat szájon át kezeltük HerbaCistanche-val a feltüntetett napi adagokban 3 napon keresztül. Az ATP-termelési kapacitást az „Anyagok és módszerek” részben leírtak szerint mértük. Az adatokat százalékos kontrollban fejeztük ki a megfelelő kezeletlen kontrollcsoport értékeire (AUC2) vonatkoztatva. ∗Szignifikánsan különbözik a megfelelő kezeletlen kontrollcsoporttól; szignifikánsan különbözik a Herba Cistanche-val kezelt csoporttól 0,5 g/kg.

2. ábra: A Herba Cistanche kezelés hatása a mitokondriális elektrontranszportra patkányszívekben

Minden oszlop az átlagot ± SEM, n {{0}} értékkel. (a) Piruváttal támogatott (b) A szukcináttal támogatott mitokondriális elektrontranszportot MTT redukcióval mértük, az „Anyagok és módszerek” részben leírtak szerint. Az adatokat a kezeletlen kontrollértékek százalékában fejeztük ki [piruváttal támogatott: OD570nm− OD630nm =0.0206 ± 0,0001 (SEM), n {{ 10}}; szukcináttal támogatott: férfi, 0,255 ±0,015, n=5]. ∗Szignifikánsan különbözik a megfelelő kezeletlen kontrollcsoporttól; jelentősen eltér a 0,5 g/kg-os csoporttól.

Amint a 2a. ábrán látható, a Herba Cistanche-kezelés dózisfüggően növelte a piruvát által támogatott mitokondriális elektrontranszport mértékét patkányszívekben, az optimális stimuláció pedig 0,5 g/kg dózisnál volt megfigyelhető. A szukcináttal támogatott mitokondriális elektrontranszport mértékében azonban nem észleltek jelentős változást a Herba Cistanche-val kezelt patkányszívekben (2b. ábra).

A 2. részhezkérlek kattints ide.