1. rész: A Verbascoside védi a hasnyálmirigy sejtjeit az ER-stressz ellen
Mar 05, 2022
Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, plusz , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3, Michela Castagna 1 és Carla Perego 1,*
Absztrakt:
Jelentős epidemiológiai bizonyítékok azt mutatják, hogy a polifenolokban gazdag étrend megvéd a 2-es típusú cukorbetegség kialakulásától. A feniletanoid glikozidverbaszkozid/akteozid, egy széles körben elterjedt polifenolos növényi vegyület, számos biológiai tulajdonsággal rendelkezik, beleértve az erős antioxidáns, gyulladásgátló és neuroprotektív hatást. A kutatás célja a lehetséges hatások tesztelése voltverbascosidehasnyálmirigy-sejteken, korábban soha nem tesztelt célpont. Egér és emberi sejteket inkubáltunkverbascoside(0,8–16 uM) legfeljebb öt napig, és biokémiai és képalkotó technikák kombinációját alkalmaztuk a sejtek túlélésének és működésének értékelésére normál vagy endoplazmatikus retikulum (ER) stresszt kiváltó körülmények között. Dózisfüggő védőhatást találtunkverbascosideoxidatív stressz ellen a klonális és humán sejtekben. Mechanisztikus vizsgálatok kimutatták, hogy a polifenol megvédi a sejteket az ER-stressz által közvetített diszfunkciókkal szemben, modulálja a protein kináz RNS-szerű endoplazmatikus retikulum kináz (PERK) ágának aktiválódását a kibontott fehérjeválaszban, és elősegíti a mitokondriális dinamikát. Ennek eredményeként ezekben a sejtekben megnövekedett életképesség, mitokondriális funkció és inzulintartalom volt kimutatható. Ezek a tanulmányok bizonyítják, hogyverbascosidefokozza a -sejtek azon képességét, hogy megbirkózzanak az ER-stresszsel, ami fontos szerepet játszik a sejtek diszfunkciójában és kudarcában cukorbetegség esetén, és támogatja a verbaszkozid terápiás potenciálját cukorbetegségben.
Kulcsszavak:
verbascoside; polifenolok; inzulintermelő sejtek; cukorbetegség; UPR; oxidatív stressz; ER-stressz; FELFRISSÍT; gyulladáscsökkentő; mitokondriumok
1. Bemutatkozás
A cukorbetegség egy krónikus betegség, amely több száz millió embert érint [1]. Az 1-es típusú (T1D) és a 2-es típusú cukorbetegséget (T2D) eltérő etiológia jellemzi, mindkettő inzulinhiányt mutat [2]. Az inzulin szabályozza a plazma glükózkoncentrációját, serkenti a glükóz felvételét az izom- és zsírsejtekben, és modulálja a máj glükóz metabolizmusát. A tápanyagok elérhetősége, a hormonok és az idegi bemenetek szabályozzák a hasnyálmirigy inzulinszekrécióját, és fenntartják a vércukorkoncentrációt egy fiziológiás tartományon belül [3–5]. Ezért a -sejtek diszfunkciója cukorbetegséghez vezet, amelyet éhomi hiperglikémia jellemez.
A T2D egy progresszív állapot, amelyben az inzulinrezisztencia és a -sejtek hibás működése összefügg, és a legújabb bizonyítékok felkeltették az érdeklődést a -sejtek kritikus elsődleges szerepe iránt a hiperglikémiás státuszban [6,7]. Nem cukorbeteg elhízott alanyokban a sejtek az inzulinrezisztenciát a hormon fokozott szekréciójával kompenzálják. Egyes alanyoknál azonban állapotuk romlásával az inzulinaemia csökken, a glükózszint pedig hiperglikémiáig emelkedik [8,9].
A glükóz a sejtfunkciók legfontosabb modulátora. A glükózstimuláció befolyásolja a gének szabályozását és számos sejtfunkcióban, például glikolízisben, inzulinszintézisben és szekrécióban részt vevő fehérjék expresszióját [10]. A glükóz által kiváltott inzulinszekréció az oxidatív metabolizmuson alapul, hogy adenozin-trifoszfátot (ATP) termeljen, és fiziológiásan alacsony szintű reaktív oxigénfajták (ROS) keletkeznek. A -sejtek azonban nem túl jól felszereltek scavenger enzimekkel, és ez a gyengeség nagyon fogékony az oxidatív stresszre [11,12]. Az oxidatív stressz fokozódásával a sejtek inzulintermelése csökken, és a sejtek citokineket termelnek, amelyek gyulladás és apoptózis révén sejtkárosodást okoznak [13]. Érdekes módon, bár a csökkent -sejttömeget korábban a sejthalálnak tulajdonították, a legújabb tanulmányok a sejtek dediferenciálódásának fő szerepére utalnak [14,15]. Világossá vált, hogy több szakasz vezet a T2D-hez. A metabolikus és oxidatív inzultusok endoplazmatikus retikulum (ER) stresszt okoznak, amely az inzulin szintézisének és szekréciójának csökkenéséhez vezet, gyulladásos folyamatok követik a citokinek felszabadulását, és sejtvesztés következhet be apoptózis és dediferenciálódás révén. Ez a tudás alapvető fontosságú a megfelelő kezelési stratégiák kidolgozásához, mivel az oxidatív stressz és a gyulladás ellensúlyozható, és a hasnyálmirigysejtek plaszticitása lehetővé teszi az őssejtek -sejtekké való visszaállítását, amint azt egerekben is bebizonyították [16].
A közelmúltban a -sejtek oxidatív stresszel szembeni sebezhetősége sikeresen ösztönözte az étrendi antioxidánsok alkalmazását a cukorbetegség megelőzésére [17]. A legérdekesebb antioxidáns élelmiszerek közül az olívaolaj az ókori görögök óta ismert jótékony tulajdonságairól. Az olívaolaj jó mennyiségben tartalmaz egyszeresen telítetlen zsírsavakat (MUFA) és számos polifenolt, például tirozolt, hidroxitirozolt, oleuropeint és verbaszkozidot.
VerbascosideAz akteozid néven is ismert feniletanoid-glikozid, amelyet Olea europea-ból, a Verbascum fajba tartozó növényekből és 23 másik növénycsaládból vonnak ki [18–20]. Előállítható olívaolaj melléktermékeiből is (az olajbogyó-gyümölcs feldolgozásából származó olajbogyó-szennyvízben dúsítva), vagy előállítható anyagcsere-mérnöki és szintetikus biológiai megközelítésekkel [21].
A verbaszkozid humán biológiai hozzáférhetőségéről még nem számoltak be. Egereken, SKBR3- és Caco{1}}-sejteken végzett vizsgálatok azt sugallják, hogy lehetséges lehet, hogy a nem metabolizálódó verbaszkozid átjut a bélgáton, kering a vérplazmában, és antioxidáns hatást fejt ki [20,22,23]. A legtöbb növényi polifenoltól eltérően a verbaszkozid főként a sejteken fejti ki hatását számos enzim és szabályozó faktor géntranszkripciójának modulálásával, antioxidáns és gyulladásgátló hatással [24–30].
Bár a verbaszkozidnak számos jótékony emberi egészségre gyakorolt hatása ismert, nincs adat a hasnyálmirigy-sejtekre gyakorolt hatásáról. Mivel az oxidatív stressz és a gyulladás a T2D patogenezisének alapja, megvizsgáltuk, hogy a verbaszkozid kezelés javíthatja-e a sejtek életképességét és
működését ER-stressz indukáló körülmények között, és jellemeztük hatásának molekuláris mechanizmusait. Adataink azt mutatják, hogy a verbaszkozid megakadályozza a -sejtek oxidatív stresszét és gyulladását, modulálva a kibontakozó fehérjeválasz aktiválódását és elősegítve a mitokondriális dinamikát, ezáltal növelve a sejtek életképességét és inzulintartalmát.
2. Anyagok és módszerek
2.1. Sejtkultúra és -anyagok
Egér tc3 sejteket (Prof. Hanahan – Biokémiai és Biofizikai Tanszék, Kaliforniai Egyetem, San Francisco, CA [31]) RPMI 1640 táptalajban (Euroclone SpA, ECB90) tenyésztettük. 0, Pero MI, Olaszország), kiegészítve 10% (v/v) hővel inaktivált borjúmagzatszérummal (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Olaszország), 1% (v/v) penicillin-sztreptomicinnel (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Olaszország) és 1% (v/v) L-glutamint (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Olaszország). Humán Langerhans szigetecskéket Milánóban (Niguarda Ca' Granda) izoláltunk holttestű többszerv donoroktól Ricordi és munkatársai által leírt eljárás szerint. [32]; 5,5 mmol/l glükózt, 10% hővel inaktivált magzati borjúszérumot, 0,7 mM glutamint, 50 egység/ml penicillint és 50 ug/ml sztreptomicint (EuroClone, SpA, Pero MI, Olaszország) tartalmazó RPMI táptalajban tenyésztettük. Négy különböző szigetpreparátumot használtunk, a szigetek tisztasága 80 ± 10 százalék volt. A szigetizolációt és a szigetek vizsgálatait a milánói Niguarda Ca' Granda kórház etikai bizottsága hagyta jóvá (2009.12.11.). A tc3 sejteket 0,8, 1,6 és 16 µM verbaszkoziddal (Carbosynth, OV08034, Compton, Egyesült Királyság), kávésavval és hidroxitirozollal kezeltük (Prof. Dell'Agli, Farmakológiai és Biomolekuláris Tudományok Tanszéke, Universita degli Studi di Milan Milánó, Olaszország) komplett RPMI tápközegben 5 napig, míg az emberi szigetecskék 16 uM verbaszkoziddal. Kontrollként metanol/etanol kezelt sejteket használtunk. Az oxidatív stressz kiváltása érdekében a sejteket 500 uM H2O2-vel (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, USA) kezeltük komplett RPMI tápközegben 20 percig az analízis előtt, míg a kezelést 2 ug/ml tunicamycinnel (T7765, Sigma Aldrich) végeztük. ) 7 órán át végeztük az ER stressz kiváltására.
2.2. A sejtek életképességének kimutatása MTT teszttel
A sejteket 96 többlyukú lemezekre szélesztettük, és 5 nappal a verbaszkozid kezelés után 0,5 mg/ml MTT-vel (3-(4,5-dimetil-tiazol{{7}) inkubáltuk őket }il)-2,5-difeniltetrazólium-bromid) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, USA) 4 órán át 5% CO2-t tartalmazó, párásított atmoszférában 37 oC-on. Inkubálás után a sejteket óvatosan újraszuszpendáltuk 100 ul DMSO-ban (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Olaszország), és az 540 nm-es abszorbanciát mikrolemez-leolvasóval (Benchmark, microplate reader, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA) [33]. A kísérleteket három párhuzamosban végeztük, és az adatokat a kontroll mintákhoz képest többszörös növekedésként fejeztük ki.
2.3. A sejthalál kimutatása áramlási citometriával
Öt nappal a 16 uM verbaszkoziddal végzett inkubálás után a -sejteket 7 perces tripszin/EDTA-val végzett inkubálással leválasztottuk, összegyűjtöttük és centrifugáltuk; a pelletet óvatosan szuszpendáltuk foszfátpufer sóoldatban. A sejteket MuseTM count és életképességi reagenssel (Millipore, MCH100102, Burlington MA, USA) festettük a gyártó protokollja szerint, és áramlási citometriával analizáltuk. A kísérleteket három párhuzamosban végeztük, és az adatokat az összes elhalt sejtek százalékában fejeztük ki.
2.4. ROS generáció
Az intracelluláris ROS-t DCFDA-val (2/,7/-diklór-fluoreszcein-diacetát) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, USA) értékeltük, egy membránáteresztő szondával, amely ROS-hoz kötve fluoreszkálóvá válik [34]. A tc3 sejteket előre feltöltöttük 15 uM DCFDA-val Krebs-Ringer pufferben (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7,4 és 2 mM CaCl2).
11 mM glükózzal kiegészítve 1 órán át 37 oC-on. A ROS-tartalmat 30 percig detektáltuk alap- és stressz körülmények között is mikrolemez-leolvasóval (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Svájc). Az átlagértékek és a szórások három független kísérleten alapultak.
2.5. Western blottolás
A tc3 sejteket összegyűjtöttük, és aprotininnel (Sigma Aldrich, St. A452) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, USA) és Roche inhibitorok (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, USA) 40 percig 4 oC-on. A fehérjekoncentrációt Bradford assay-vel [35] határoztuk meg Bradford reagens (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, USA) alkalmazásával. MA, USA). Az elsődleges antitesteket 2 órán keresztül blokkoló pufferben alkalmaztuk 5% zsírmentes tejjel vagy 5% BSA-oldattal; a következő elsődleges antitesteket használtuk: egér anti- -aktin (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, USA), egér anti-akrolein (Abcam, ab48501, Cambridge, Egyesült Királyság), egér anti-BIP (Prof. Borgese Nica kedves ajándéka, Neuroscience Institute, CNR, Milánó, Olaszország), nyúl anti-HNE (-diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, USA), egér anti-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc.) ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, USA), nyúl anti-foszfo-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), egér anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc.) ., 4814, Danvers, MA, USA), nyúl anti-foszfo-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), nyúl anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, USA), juh anti-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Germania), nyúl anti-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, USA), nyúl anti-eIF2 (Cell Signaling Technology) Inc., 5324, Danvers, MA, USA) és nyúl anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, USA). A HRP-vel konjugált másodlagos antitesteket (Dako Agilent, Santa Clara, CA, USA) 1:5000 hígításban alkalmaztuk. A fehérjéket ECL detektáló rendszerrel (Euro-Clone SpA, Pero MI, Olaszország) Odyssey Fc Image rendszerrel (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Németország) és a sávsűrűséget Image Studiow Lite szoftverrel (LI) határoztuk meg. -COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) [36]. A kísérleteket három párhuzamosban végeztük, és az adatokat a kontroll mintákhoz képest többszörös növekedésként fejeztük ki.
2.6. Mitokondriális membrán potenciál
A tc3 sejteket és az emberi Langerhans-szigeteket 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos-sal (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milánó, Olaszország) vagy 100 nM MitoSpyw Green FM-mel (BioLegend, 424805, 3 min, 3 Camp Milan) inkubáltuk. oC; A fluoreszcencia intenzitását a TECAN Infinite⑧ F500 mikrolemez-leolvasóval detektáltuk (551/576 nm Ex/Em a MitoSpyw Orange CMTMRos-hoz; 490/516 nm Ex/Em a MitoSpyw Green esetében) (TECAN Infinite⑧ F.50te⑧nnedorf Group). A sejteket 500 uM H2O2-vel 20 percig inkubáltuk, és a fluoreszcencia intenzitását a korábban leírtak szerint detektáltuk. Az átlagértékek és a szórások három különböző kísérleten alapultak.
2.7. Mitokondriális morfológia és dinamika
A tc3 sejteket 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos-sal (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milánó, Olaszország) töltöttük fel 11 mM glükóz Krebs–Ringer pufferben 37 oC-on 30 percig. A mintákat egy képalkotó kamrában helyeztük el, és véletlenszerű mezőket az Axio Observer Z1 mikroszkóp (Zeiss, Oberkochen, Németország) rhodan szűrője segítségével készítettünk. A mitokondriális morfológia értékeléséhez a következő paramétereket elemeztük az ImageJ részecskeanalizátor szoftverrel: terület (um2), körkörösség (4mArea2/Perimeter2) és Feret maximális átmérője (um) [37].
Az időzített kísérletekhez az egysejtű képalkotást másodpercenként 1 képkocka sebességgel végezték 30 másodpercig kontroll vagy oxidatív stressz körülmények között. A mitokondriális kumulatív távolság (um2) méréséhez először a képeket korrigáltuk a fotófehérítés szempontjából, majd a videókat egy meglévő Image-Pro Plus Plug-in (objektumkövetés) segítségével elemeztük (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). Tizenkettőig
A sejteket három független kísérletben leképeztük, és az adatokat átlagértékként és standard eltérésként mutattuk be.
2.8. Inzulin szekréció
Humán izolált Langerhans-szigeteket oltottunk be 96-lyuklemezre 20 sziget/lyuk sűrűségben, majd 5 napos kezelés után mértük az inzulintartalmat és a szekréciót alapban (3,3 mM glükóz) és stimuláltuk (16,7 mM glükóz). ) körülmények ELISA immunoassay segítségével (Mercodia, 10-1113-01, Uppsala, Svédország).
2.9. Statisztikai elemzések
Minden statisztikai analízist GraphPad Prism 8-cal.{1}} végeztünk független biológiai ismétléseken. A két csoport közötti átlagokat a kétirányú Student-féle t-próbával értékeltük ki, és a p-értéket < 0,05="" tekintettük="" a="" statisztikai="" szignifikancia="" bizonyítékának.="" három="" vagy="" több="" csoport="" átlagait="" varianciaanalízissel="" (anova)="" hasonlítottuk="" össze,="" majd="" többszörös="" post-hoc="" (tukey)="" összehasonlító="" teszttel.="" az="" alkalmazott="" statisztikai="" teszt,="" a="" pontos="" p-értékek="" és="" a="" replikák="" száma="" (n)="" az="" egyes="" ábramagyarázatokban="" van="" feltüntetve.="" az="" ábrákon="" a="" hibasávok="" az="" átlag="" ±="" sd="" vagy="" az="" átlag="" ±="" se="" értéket="" mutatják,="" a="" jelzett="">
3. Eredmények
3.1. A verbascoside javítja a sejtek életképességét
Mivel nem voltak adatok a verbaszkozid -sejtekre gyakorolt hatásáról, MTT-tesztet végeztünk a sejtek életképességének értékelésére, és amint az 1A. ábrán látható, pozitív dózisfüggő tendenciát figyeltünk meg. Ezért a további vizsgálatokhoz azt a 16 uM koncentrációt választottuk ki, amely statisztikailag bizonyítottan hatásosnak bizonyult a -sejtek életképességének fokozására. Áramlási citometriával tanulmányoztuk a verbaszkozid ötnapos inkubációjának hatását a sejtek túlélésére alapkörülmények között és 2{21} után. } perc előkezelés 500 uM H2O2-val. Alapállapotban a verbaszkozid nem befolyásolta a sejtek túlélését, ami arra utal, hogy az MTT vizsgálatban megfigyelt megnövekedett -sejtek életképessége a mitokondriális aktivitás javulásának tudható be. Míg H2O2 expozíció után a 16 uM verbaszkozid előkezelés jelentősen csökkentette az oxidatív stressz által kiváltott sejthalált (1B, C ábra). A verbaszkozid egy összetett molekula, amely hidrolizáló enzimekkel módosítható [18]. Annak tesztelésére, hogy a verbaszkozid metabolitok felelősek-e a megfigyelt védőhatásért, a tc3 sejteket hidroxitirozollal és kávésavval (0,8 és 16 uM) kezeltük 5 napon keresztül. Mindkét metabolit nem fokozta a sejtek életképességét, éppen ellenkezőleg, a 16 uM koncentrációnál a H2O2 expozíció után jelentősebb citotoxikus hatást észleltek (S1. ábra). Ez az eredmény azt bizonyítja, hogy a verbaszkozid és nem metabolitjai fejtik ki védő hatást a H2O2 kezelésre.
3.2. A verbascoside modulálja a redox homeosztázist, és gyulladáscsökkentő hatást fejt ki a sejtekben
Először tc3 sejtekben erősítettük meg a verbaszkozid gyulladáscsökkentő és antioxidáns hatását, amely más sejttípusokban is megfigyelhető [24,29,34]. A verbaszkozid ROS befogó aktivitását ROS-specifikus DCFDA (2/,7/-diklór-fluoreszcein-diacetát) celluláris permeábilis szondával jelölt tc3 sejtekkel értékeltük. Amint a 2A. ábrán látható, a ROS-tartalom jelentős csökkenése volt kimutatható a verbaszkozid előkezelést követően, mind bazális, mind oxidatív stressz körülmények között.
A Western blot analízis az akrolein oxidatív stresszmarkerek és a 4-hidroxinonenális (HNE) expressziójának jelentős csökkenését mutatta ki a verbaszkoziddal kezelt sejtekben. Ezenkívül a szuperoxid-diszmutáz (SOD1) expressziójának növekedését találtuk, ami arra utal, hogy a verbaszkozid valószínűleg két különböző mechanizmussal fejti ki antioxidáns hatását, közvetlenül ROS-megkötőként és közvetetten az antioxidáns enzimek expressziójának indukálásával (2B, C ábra).
A verbaszkozid -sejtekre kifejtett gyulladásgátló hatását az NFKB-útvonal aktiválásának értékelésével értékelték, amely a legfontosabb gyulladásgátló útvonal ezekben a sejtekben [38]. Western blot analízissel a nukleáris kappa B faktor (IKB ) és a nukleáris faktor kappa könnyű lánc fokozó (NFKB) expressziójának csökkenését, valamint az NFKB foszforilációjának szignifikáns csökkenését találtuk előkezelt sejtekben, ami alátámasztja azt a hipotézist, a verbaszkozid hatékonysága a sejtes gyulladás csökkentésében (2D, E ábra).
3.3. A Verbascoside modulálja a -sejtek kibontott fehérjeválaszát
Ezt követően alaposan elemeztük azt a molekuláris mechanizmust, amellyel a verbaszkozid antioxidáns és gyulladásgátló szerepet tölt be, az endoplazmatikus retikulumra összpontosítva, amely a sejtekben a metabolikus és stresszjelek kulcsfontosságú érzékelőjeként jelenik meg. Stressz körülmények között az organellum homeosztatikus reakciót vált ki, az úgynevezett kibontott fehérjeválaszt (UPR), amelynek célja az ER funkció helyreállítása; ennek az útvonalnak a túlzott aktiválódása azonban apoptózist eredményez [39,40].
A megnövekedett ER-stressz markerei a chaperon fehérjék felszabályozása és az UPR válasz aktiválása. A verbaszkoziddal kezelt sejtek Western blot analízise a két chaperonin hősokk-fehérje 70 (HSP70) és a kötő immunglobulin fehérje (BIP) csökkenését mutatta ki (3A, B ábra). Továbbá a protein kináz RNS-szerű ER kináz (PERK) expressziójának jelentős csökkenését és a downstream efector, az eukarióta transzlációs iniciációs faktor 2 (eIF2) foszforilációjának csökkenését mutatták ki.
