2. rész: Az akteozid hatása sejtvédőként klónozott kutya előállítására

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2, Min Kyu Kim1*

Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com

Kérem kattintson ide az 1. részhez

Kattintson ide a 3. részhez

Acteozidban bencistanchesok vanEgészségelőnyöket

Statisztikai analízis

Az adatokat IBM SPSS statisztikák (SPSS Inc., Chicago, IL USA) segítségével elemeztük egyutas ANOVA és Tukey őszintén szignifikáns különbség tesztje segítségével. A különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük, ha a P-érték kisebb volt, mint 0,05.

Eredmények

Az akteozid hatása a sejtciklus szinkronizálására

A hatásaakteozida sejtcikluson a szinkronizációt fluoreszcenciával aktivált sejtválogatással (FACS) vizsgáltuk (1. táblázat). Kutya magzati fibroblasztjait különböző koncentrációjú gyógyszerekkel kezeltékakteozid(10, 30, 50 μM) különböző időtartamokig (24, 48, 72 óra), és a sejteket G0/G1 szakaszra, S szakaszra és G2/M szakaszra különítettük el FACS. A FACS eredményeit a szérum éhezéssel és kontakt gátlással szinkronizált sejtekével hasonlítottuk össze. A szérum éhezés a G0/G1 stádiumban eredményezte a sejtciklus szinkronizálásának legmagasabb arányát (88,2 százalék) a kontakt gátláséhoz képest (84,6 százalék), ill.akteozidkezelés (80,8-84,5 százalék).Acteozid24 órás kezelés G0/G1 sejtciklus szinkronizálást indukált a legalacsonyabb hatékonysággal (80,8, 81,1 és 82,0 százalék).Acteozidvolt a leghatékonyabb a G0/G1 sejtciklus szinkronizálásában 30 μM koncentrációnál és 48 órás kezelési időtartamnál (84,5%). Azonban nem volt szignifikáns különbség a koncentrációk és az időtartamok közöttakteozidkezelés a G1/G0 sejtciklus szinkronizálásában. Átfogó,akteozidA kezelés nem mutatott szignifikáns különbséget a szérum éhezéshez és a kontaktgátláshoz képest a G{{0}}/G1 sejtciklus szinkronizálása tekintetében. Szintén nem volt különbség a sejtciklus szinkronizálásában az S szakaszban a három csoport között. Ezenkívül a G2/M stádiumban letartóztatott sejtek aránya hasonló volt a G0/G1 stádiumban letartóztatott sejtek arányához.

1. táblázat: A kontakt gátlás hatása, a szérum éhezés ésakteozida sejtciklus szinkronizálásának kezelése kutya magzati fibroblasztokban.

1. ábra: ROS szint a kutya magzati fibroblasztjaiban. Sejtciklus szinkronizálás (A) kontakt gátlással, (B) szérum éhezéssel és (C) 30 μM akteozid kezeléssel 48 órán keresztül. A hisztogramok a kutya magzati fibroblasztjaiban kimutatott ROS-szinteket mutatják.

Az akteozid hatása a ROS-ra és az apoptózisra

A hatásaakteozidA ROS-on a FACS-t a karboxi-H2DCFDA, egy oxidatív stressz indikátor alkalmazásával határoztuk meg, amely akkor aktiválódik a sejtekben, amikor az észterázok eltávolítják az acetátcsoportokat a sejtek között (1. ábra). A ROS-t alacsonyabb szinten mutatták ki az akteoziddal kezelt sejtekben, mint a széruméhezéssel vagy kontaktgátlással szinkronizált sejtekben. A ROS szintje szignifikánsan alacsonyabb volt az akteoziddal kezelt csoportban (42,8 százalék), mint a kontaktgátlásos és a szérum éhezés csoportjában (54,3 és 99,5 százalék) (2. táblázat).

Hogy megértsük a hatásátakteozida sejtek túlélésére és elhalására vonatkozóan a sejtciklus szinkronizálása után az apoptózist vizsgálták a sejtekben. Az akteoziddal kezelt sejtek túlélési aránya (94,8 ± 1,2 százalék) szignifikánsan magasabb volt, mint mind a kontaktgátlásos, mind a széruméhezés csoportjaiban (87,3 ± 0,5 százalék) (2D. ábra). Az apoptózis aránya a szérum éhezés csoportjában

(52,1 ± 5,3 százalék) szignifikánsan magasabb volt, mint a kontaktgátlásos és az akteozidos kezelési csoportban (2E. ábra). A kontaktgátlásos csoportban megfigyelt apoptózis 10,6 százalék volt, ami szintén szignifikánsan magasabb, mint az akteoziddal kezelt csoportban (4,2 százalék) (2E. ábra). Ezenkívül az akteoziddal kezelt sejtekben kevesebb nekrózist találtak, mint a kontakt gátlásos csoportban (2F. ábra).

Cistanchea deserticola acteozid fokozhatjaimmunitásés csökkentiapoptózis

Az akteozid hatása a kutya nukleáris transzfer embrióinak in vitro fejlődésére

Az akteozid SCNT embriófejlődésre gyakorolt ​​hatásának vizsgálata érdekében a sejtmagdonor sejteket a sejtciklus szinkronizálása után a kutya sejtmag nélküli petesejtekbe vitték át.akteozid. Amint a 3. táblázat mutatja, a korai embriófejlődésben nem volt szignifikáns különbség a sejtmaghoz képest

2. táblázat: A ROS mennyiségi meghatározása

2. ábra: Kutya magzati fibroblasztok sejttúlélésének, apoptózisának és nekrózisának aránya. Apoptotikus sejtek az (A) kontakt gátlásban, (B) a szérum éhezésben és (C) 30 μMakteozidA 48 órás csoport kezelését FACS határozta meg; A (D) sejttúlélés, (E) apoptózis és (F) nekrózis FACS eredményeinek kvantitatív elemzése. Ezt a kísérletet négyszer megismételtük egymástól függetlenül. (P<>

donorsejtek különböző sejtciklus szinkronizálási módszerekkel, akár kontaktgátlás, akár akteozid kezelés. Azonban csak azok a kutya SCNT embriók, amelyeket a G0/G1 stádiumban az akteoziddal szinkronizált nukleáris donorsejtek felhasználásával alakítottak ki a 10-sejt embrióstádiumon túl.

Klónozott kutya előállítása a következővel tenyésztett sejtek felhasználásávalakteozid

Ötvenhét klónozott, kontakt gátolt donorsejtekkel előállított kutyaembriót sebészi úton vittünk át 6 recipiens petevezetékébe. A 6 címzett közül egyik sem hozott utódot

3. táblázat: Kutya nukleáris transzfer embriók in vitro fejlődése.

4. táblázat: klónozott kutya előállítása az SCNT segítségével.

vagy akár teherbe esett. Az akteoziddal kezelt donorsejtekből előállított harmincnyolc klónozott kutyaembriót szintén sebészi úton vittünk át 3 recipiens petevezetékébe. A három bérmama közül az egyiknél megerősítették a vemhességet, aki végül császármetszéssel adott életet egy egészséges, 354 g-os kölyökkutyának (4. táblázat és 3. ábra). A genom eredetének meghatározására mikroszatellit amplifikációt végeztünk a klónozott kutya génjeivel. A mikroszatelliták rövid tandem ismétlődő szekvenciák, amelyeket genom-szűrésekben használnak a családok öröklődési és kapcsolódási elemzésének nyomon követésére. Hét mikroszatellit markert használtunk a klónozott kutya genomjának eredetének azonosítására (5. táblázat). A klónozott kutya és a kutya klónozására használt donorsejtek ugyanazokkal a mikroszatellit-markerekkel rendelkeztek, míg a petesejtek donorja és helyettesítője csak részleges alléleket osztozott (5. táblázat). Az anyai származási tesztben a klónozott kutya és a recipiens petesejtek azonos mitokondriális DNS (mtDNS) szekvenciákkal rendelkeztek, ami azt mutatja, hogy a klónozott kutya mtDNS-e az oocita donortól származik (6. táblázat).

akteozidin cistanche

Vita

A donor sejtciklus szinkronizálása fontos tényező az SCNT hatékonyságának javításában [43]. Az SCNT embriófejlődés üteme és az állati termelés klónozásának hatékonysága

3. ábra klónozott kutya: (A) a magzat ultrahangfelvétele a magzati vezikulumban 32 nappal az embriótranszfer után; (B) A klónozott beagle 2 hónapos korában.

akteozidban bencistancheöregedésgátló hatású