3. rész: A Cistanche Tubulosa-ból izolált echinakozid feltételezhetően serkenti a növekedési hormon szekrécióját a ghrelin receptor aktiválásával
Mar 06, 2022
A Cistanche tubulosa-ból izolált echinakozid feltehetően serkenti a növekedési hormon szekréciót a ghrelin receptor aktiválásával
Chieh-Ju Wu 1, Mei-Yin Chien 2, Nan-Hei Lin 1, Yi-Chiao Lin 1, Wen-Ying Chen 3, Chao-Hsiang Chen 2,4* és Jason TC Tzen 1,*
1 Diplomás Biotechnológiai Intézet, National Chung-Hsing University, Taichung 402, Tajvan; baby159357520@gmail.com (C.-JW); CMNHEI@mohw.gov.tw (N.-HL); s9755702@gmail.com (Y.-CL)
2 Ko Da Pharmaceutical Co. Ltd., Taoyuan 324, Tajvan; rd1@koda.com.tw
3 Állatorvosi Tanszék, National Chung-Hsing University, Taichung 402, Tajvan; wychen@dragon.nchu.edu.tw
4 Graduate Institute of Pharmacognosy, Taipei Medical University, Taipei 110, Tajvan
* Levelezés: gm@koda.com.tw (C.-HC); TCTZEN@dragon.nchu.edu.tw (JTCT); Tel.: plusz 886-4-22840328 (776-os mellék) (JTCT); Fax: plusz 886-4-22853527 (JTCT)
Tudományos szerkesztő: Pinarosa Avato
Beérkezett: 2019. január 22.; Elfogadva: 2019. február 14.; Közzétéve: 2019. február 17
Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Absztrakt:Cistanchefaj, a sivatagi ginzeng, amelyről a hagyományos kínai gyógyszerkönyvben számos biológiai aktivitást jegyeztek fel, és öregedésgátló gyógyszerként is használják. Három fenil-etanol-glikozid –echinakozid, tubulozid A és akteozid – kimutatták a vizes kivonatábanCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight és a fő alkotó,echinakozid, tovább tisztították.EchinakozidA 10_6 M-nél magasabb koncentrációjú vegyületek jelentős aktivitást mutattak a patkány agyalapi mirigy sejtjeinek növekedési hormon szekréciójának serkentésében. Hasonlóan a növekedési hormon felszabadító hormonhoz-6, a ghrelin szintetikus analógjához, a növekedési hormon szekréció echinakozid általi serkentését a [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-P anyag gátolta. , a ghrelin receptor inverz agonistája. A molekuláris modellezés azt mutatta, hogy mindhárom fenil-etanol-glikozid megfelelően kölcsönhatásba lép a ghrelin receptor kötőzsebével, és az echinakozid valamivel jobb kölcsönhatást mutatott a receptorral, mint a tubulozid A és az akteozid. Az eredmények azt sugallják, hogy a fenil-etanoid-glikozidok, különösen az echinakozid, aktív összetevők, amelyek feltételezhetően felelősek a C. tubulosa öregedésgátló hatásáért, és a ghrelin nem peptidil-analógjaként fejlődhetnek ki.
Kulcsszavak: cistanchetubulosa;echinakozid; ghrelin; növekedési hormon szekréció;feniletanoidglikozidok
echinakozidban bencistancheszámos hatása van
Kérem kattintson ide a 2. részhez
4. Anyagok és módszerek
4.1. Vegyszerek és növényi anyagok
CistancheA deserticola YC Ma-t egy helyi piacról szerezték be, és Dr. Nan-Hei Lin hitelesítette.Cistanchetubulosa (Schenk) R. Wightot a Sinopharm Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd.-től (Hangzhou, Kína) vásároltuk. A HPLC-minőségű acetonitrilt, hangyasavat és metanolt az ECHO Chemical Co., Ltd.-től (Miaoli, Tajvan) vásároltuk. A Dulbecco-féle módosított Eagle táptalajt (DMEM), a dializált borjúmagzati szérumot (DFBS) és a Trypsin-EDTA-t az Invitrogentől (Carlsbad, CA, USA) vásároltuk. A DNáz I-et a Worthington Biochemical-tól (Lakewood, NJ, USA) vásároltuk. A növekedési hormon-felszabadító hormont-6 (GHRP-6) a Gen Way Biotech, Inc.-től (San Diego, CA, USA) szereztük be. Az I típusú kollagenázt és a [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-P anyagot a Sigma-Aldrich Co.-tól (St. Louis, MO, USA) vásároltuk. A patkánynövekedési hormon ELISA készletet a Sunred Biological Technology Corporation-től (Sanghaj, Kína) vásároltuk.
4.2. HPLC/UV és LC_MSn elemzések a Cistanche spp. vízkivonásáról.
Szárított szár (25 g).Cistanchedeserticola YC Ma illCistanchetubulosa (Schenk) R törzset háromszor extraháltuk 500 ml desztillált vízzel 60 percig 50 fokos vízfürdőben. Az oldatot 13 mm-es szíriai szűrőn, 0,45 um-es PP membránszűrőn (Pall Corporation, Glen Cove, NY, USA) átszűrjük, és a következő elemzéseknek vetjük alá. A kivonatokban lévő kémiai összetevőket elemeztük
Syncronis C18 oszlop (4,6 × 250 mm belső átmérő, 5 um, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) felhasználásával HPLC rendszerben, 600E típusú fotodiódasoros detektorral (Waters Corporation,
Milford, MA, USA). A mozgófázis (A) {{0}},1% hangyasavat tartalmazó vízből és (B) acetonitrilt tartalmazott. Az eluáló gradiens a következő volt: 0–60 perc, lineáris gradiens 14% B-től; 0–3 perc, 14–17 százalék B; 3-4 perc, 17 százalék B; 4–15 perc, 17–20 százalék B; 15–20 perc, 20 százalék B; 20–50 perc, 20–14 százalék B; 50–60
min, 14% B. Az ultraibolya (UV) abszorbancia detektálási hullámhosszát 330 nm-re állítottuk be. Egy lineáris csapda kvadrupól (LTQ) tandem tömegspektrométer (Thermo Electron, San Jose, CA, USA), amely elektrospray ionizációs (ESI) interfésszel van felszerelve, egy Surveyor LC rendszerhez (Thermo Electron) csatlakozik.
5 ul-es mintahurokkal. Az eluálási gradiens a következő volt: 0–90 perc, lineáris gradiens 14 százalék B-től; 0–24 perc, 14–17 százalék B; 24–25 perc, 17 százalék B; 25–36 perc, 17–20 százalék B; 36–37 perc, 20 százalék B; 37-80 perc,
20% to 14% B; 80–90 min, 14% B. The heated capillary temperature was set at 300℃ with a spray voltage of 4.5 kV. Negative ESI mode was firstly scanned ranging from m/z 400–1000. Data-dependent MSN was obtained using the high purity helium (>99,99 százalék), mint az ütközési gáz.
4.3. Az echinakozid izolálása
A C. tubulosa szárított szárából származó vizes extraktumot (25 g) csökkentett nyomáson bepároljuk, így mélybarna szirupot kapunk. A nyers extrakciót desztillált vízzel szuszpendáljuk, és liofilizáljuk fagyasztva szárítóval. A 100 mg-os port 5 ml-es desztillált vízben oldottuk, és Sephadex LH-20 oszlopon (100 ml; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Svédország) tisztítottuk, 10%-os vizes metanol oldattal eluáltuk, és HPLC-vel követtük. . Az echinakozidot tartalmazó frakciókat a 245 nm-en mért abszorbancia leolvasásával detektáltuk, és autosampler segítségével gyűjtöttük össze.
4.4. Állatok
A kísérleteket a National Chung{0}}Hsing Egyetem Állatgondozási és Felhasználási Intézményi Bizottsága hagyta jóvá az IACUC 106-079 jóváhagyási számával. A 250_300 g tömegű hím Sprague{2}} Dawley patkányokat a BioLASCO, Taiwan Co., Ltd.-től (Taipei, Tajvan) vásároltuk. Ketrecenként két állatot tartottunk 23 o2-es, 60 o 10 százalékos páratartalmú, 12 órás világos/sötét ciklusban szabályozott környezetben. A patkányokat standard chow diétával etették (kalória biztosított
28,7 százalék fehérje, 13,4 százalék zsír és 57,9 százalék szénhidrát, 5001 Rodent LabDiet, St. Louis, MO, USA) és desztillált víz ad libitum.
4.5. Elsődleges agyalapi mirigy sejtkultúra
Az agyalapi mirigy sejteket Yamazaki és munkatársai által kifejlesztett módosított enzimatikus diszperziós módszerrel izoláltuk. [29]. Röviden, a hím Sprague Dawley patkányokat Zoletil 50-nel (40 mg/kg, IP; Virbac Laboratories, Carros, Franciaország) érzéstelenítettük, és az agyalapi mirigy elülső részét eltávolítottuk, és az agyalapi mirigy sejttenyészetébe diszpergáltuk szuszpenzióban, a korábban leírtak szerint [30].
4.6. Növekedési hormon szekréciós vizsgálat
A 4 × 104 sejt/lyuk elsődleges elülső agyalapi mirigy sejtjeit 37 fokon tenyésztettük 5 százalékos CO2 alatt 2 napig a növekedési hormon szekréciós vizsgálat előtt a korábban leírt protokoll szerint [30].
A táptalaj eltávolítása után a sejteket szérummentes Dulbecco's Modified Eagle táptalajban (DMEM) éheztettük 90 percig, hogy stabilizáljuk a bazális hormonszekréciót. Az éheztetési táptalajt friss DMEM-mel helyettesítettük, amely echinakozidot (10_8-tól 10_5 M-ig) vagy GHRP-t-6 (egy humán ghrelin receptor agonistája, GHSR, 10_7 M) tartalmazott. pozitív kontrollként, és a sejteket 15 és 30 percig inkubáltuk 37 °C-on 5% CO2 alatt. Az antagonista hatás kimutatására a sejteket GHSR-rel inkubáltuk
inverz agonista, [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-P anyag (0,5 uM), majd echinakozidot (10_5 M) tartalmazó DMEM-mel kezeljük, ill. GHRP-6 (10_7 M) 30 percig. A táptalajt azért gyűjtötték össze
növekedési hormon szekréció meghatározása patkány növekedési hormon ELISA kittel (Shanghai Sunred Biological Technology Corporation).
4.7. Statisztikai analízis
Az adatokat átlagos o SD értékként adtuk meg. A különbségeket T-teszttel elemeztük. A statisztikai számításokat GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) segítségével végeztük. A p < 0,05="" szintet="" tekintettük="" statisztikailag="">
4.8. Homológia modellezés és dokkolás
A homológia modellezést és a humán ghrelin receptorhoz, a növekedési hormon szekretagóg receptorhoz (GHSR, AAI13548 letéti szám) való dokkolást korábbi konstrukciónk nyomán hoztuk létre [21,24]. Röviden, az 1 és 2 adrenerg receptorok (PDB 2YCY és 3PDS) kristályszerkezeteit kötött ligandumokkal, cianopindolollal és FAUC50-nel használtuk templátként a GHSR szerkezet megalkotásához [31,32]. A legalacsonyabb PDF összenergiájú GHSR-struktúrát választottuk ki a GHRP{10}}, echinakozid, tubulozid A és akteozid további dokkoláshoz. Minden modellezési folyamat a Discovery Studio 2.1 platformon (http://accelrys.com/) történt.
A GHRP-6 3D-s szerkezetét a Pub-Chem összetett adatbázisából töltötték le az NCBI webhelyéről (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Az echinakozid, a tubulozid A és az akteozid 3D struktúráit a Chem3D programmal (http://www.cambridgesoft.com/) építettük fel. A GHSR ligandumkötő helyét a dokkoló szimulációban a kötőzseb közepétől 14 Å sugarú gömb alakú térként határoztuk meg. A GHRP-6, az echinakozid, a tubulozid A vagy az akteozid dokkolása a GHSR kötőhelyéhez in silico a Discover Studio 2.1 csomagban található LibDock modul használatával történt, és tovább minimalizálták az intelligens minimalizálási algoritmussal a CHARMm erőtérrel. Fedezze fel a Studio 2.1 csomagot [33]. Az echinakozid, a tubulozid A és az akteozid relatív kötési affinitásának összehasonlítására GHSR-ben a GHSR-ben GHRP-6-ból szerkesztett aktív centrum területet használtuk a dokkoláshoz, a kötési energiát pedig a GEMDOCK (The Institute of Bioinformatics) számította ki. , Nemzeti Chiao Tung Egyetem, Tajvan).
A szerző közreműködése: Állatkísérletek, C.-JW, Y.-CL és W.-YC; Azonosítás és tisztítás: MY.C., N.-HL és C.-HC; Molekuláris modellezés: C.-JW, Y.-CL és JTCT; Projekttervezés és írás: C.-HC és JTCT
Finanszírozás: A munkát részben a National Chung-Hsing Egyetem (NCHU-102D604) Jason TC Tzen javára nyújtott támogatás támogatta.
Köszönetnyilvánítás: A szerzők köszönetet mondanak Tian-Shun Wengnek, hogy megosztotta szakmai tapasztalatait a Cistanche fajok felhasználásával kapcsolatban.
Érdekellentét: Minden szerző nem nyilatkozik összeférhetetlenségről.
Hivatkozások
1. Wang, T.; Zhang, X.; Xie, W. Cistanche deserticola YC Ma, "Sivatagi ginseng": Áttekintés. Am. J. Chin. Med. 2012, 40, 1123–1141. [CrossRef] [PubMed]
2. Wang, T.; Chen, C.; Yang, M.; Deng, B.; Kirby, MG; Zhang, X. Cistanche tubulosa etanolos kivonat közvetíti a patkány nemi hormonszintjét a here szteroidogén enzimeinek indukálásával. Pharm. Biol. 2016, 54, 481–487. [CrossRef] [PubMed]
3. Lin, WY; Chun, Y.; Jack, C.; Kao, ST; Tsai, FJ; Liu, HP A Drosophila Cistanche tubulosa hosszú élettartamának elősegítésével és kognitív fejlesztésével kapcsolatos molekuláris útvonalak. Fitomedicina 2017, 26, 37–44. [CrossRef]
4. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH A Cistanche tubulosa vizes kivonatának megfordítása viselkedési hiányosságokból Alzheimer-kór-szerű patkánymodellben: Relevancia az amiloid lerakódás és a központi neurotranszmitter funkció szempontjából. BMC Complement. Altern. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]
5. Xuan, GD; Liu, CQ Kutatás a Cistanche deserticola feniletanoid-glikozidjainak (PEG) öregedésgátló hatásáról D-galaktóz által indukált öreg egerekben. Zhong Yao Cai 2008, 31, 1385–1388. [PubMed]
6. Jiang, Y.; Tu, PF Cistanche fajok kémiai összetevőinek elemzése. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]
7. Gao, C.; Wang, C.; Wu, G. Cistanche összglikozidok a vaszkuláris demenciában szenvedő patkányok tanulásának és memóriájának befolyására, valamint a mechanizmusok kutatására. Áll. Növény. Med. 2005, 36, 1852–1855.
8. Li, F.; Yang, Y.; Zhu, P.; Chen, W.; Qi, D.; Shi, X.; Zhang, C.; Yang, Z.; Li, P. Az echinacoside elősegíti a csontregenerációt az OPG/RANKL arány növelésével az MC3T3-E1 sejtekben. Fitoterápia 2012, 83, 1443–1450. [CrossRef]
9. Shimoda, H.; Tanaka, J.; Takahara, Y.; Takemoto, K.; Shan, SJ; Su, MH A Cistanche tubulosa kivonat, egy hagyományos kínai nyers gyógyszer hipokoleszterinémiás hatásai egerekben. Am. J. Chin. Med. 2009, 37, 1125–1138. [CrossRef]
10. Tang, F.; Hao, Y.; Zhang, X.; Qin, J. Az echinacoside hatása a vesefibrózisra a TGF- 1/Smads jelátviteli útvonal gátlása révén a diabéteszes nephropathia DB/DB egérmodelljében. Drug Des. Devel. Ott. 2017, 11,2813–2826. [CrossRef]
11. Xiong, WT; Gu, L.; Wang, C.; Nap, HX; Liu, X. A Cistanche tubulosa anti-hiperglikémiás és hipolipidémiás hatásai 2-es típusú diabéteszes DB/DB egerekben. J. Ethnopharmacol. 2013, 150, 935–945. [CrossRef] [PubMed]
12. Bao, XX; Ma, HH; Ding, H.; Li, WW; Zhu, M. Egy kínai gyógynövény-formula előzetes optimalizálása a neuroprotektív hatások alapján rotenon-indukált Parkinson-kór patkánymodelljében. J. Integr. Med. 2018, 16, 290–296. [CrossRef] [PubMed]
13. Kojima, M.; Hosoda, H.; Dátum, Y.; Nakazato, M.; Matsuo, H.; Kanagawa, K. A ghrelin egy növekedési hormont felszabadító acilezett peptid a gyomorból. Természet 1999, 402, 656–660. [CrossRef] [PubMed]
14. Zigman, JM; Jones, JE; Lee, CE; Saper, CB; Elmquist, JK A ghrelin receptor mRNS expressziója patkány és egér agyában. J. Comp. Neurol. 2006, 494, 528–548. [CrossRef] [PubMed]
15. Castaneda, TR; Tong, J.; Datta, R.; Culler, M.; Tschop, MH Ghrelin a testsúly és az anyagcsere szabályozásában. Elülső. Neuroendokrinol. 2010, 31, 44–60. [CrossRef] [PubMed]
16. Rudman, D.; Feller, AG; Nagra, HS; németek, GA; Lalitha, PY; Goldberg, AF; Schlenker, RA; Cohn, L.; Rudman, IW; Mattson, DE Az emberi növekedési hormon hatásai 60 év feletti férfiakban. N. Engl. J. Med. 1990, 323, 1–6. [CrossRef] [PubMed]
17. Liu, H.; Bravata, DM; Olkin, I.; Nayak, S.; Roberts, B.; Garber, AM; Hoffman, AR Szisztematikus áttekintés: A növekedési hormon biztonságossága és hatékonysága egészséges időseknél. Ann. Gyakornok. Med. 2007, 146, 104–115. [CrossRef] [PubMed]
18. Giordano, R.; Bonelli, L.; Marinazzo, E.; Ghigo, E.; Arviat, E. Növekedési hormon kezelés az emberi öregedésben: Előnyök és kockázatok. Hormones 2008, 7, 133–139. [CrossRef] [PubMed]
19. Sattler, FR Növekedési hormon az öregedő férfiakban. Legjobb gyakorlat. Res. Clin. Endokrinol. 2013, 27, 541–555. [CrossRef]
20. Lo, YH; Chen, YJ; Chang, CI; Lin, YW; Chen, CY; Lee, MR; Lee, VS; Tzen, JTC Teaghrelins, egyedülálló acilezett flavonoid tetraglikozidok a Chin-shin oolong teában, a ghrelin receptor feltételezett orális agonistái.
J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 5085–5091. [CrossRef]
21. Hsieh, SK; Íme, YH; Wu, CC; Chung, TY; Tzen, JTC Teaghrelin és teaghrelinszerű vegyületek bioszintetikus intermediereinek azonosítása oolong teákban, és molekuláris dokkolódásuk a ghrelin receptorhoz.
J. Food Drug Anal. 2015, 23, 660–670. [CrossRef]
22. Hsieh, SK; Chung, TY; Li, YC; Íme, YH; Lin, NH; Kuo, PC; Chen, WY; A Tzen, JTC Ginkgoghrelins, a Folium Ginkgo egyedülálló acilezett flavonoid glikozidjai a ghrelin receptor aktiválásával serkentik a növekedési hormon szekréciót. J. Ethnopharmacol. 2016, 193, 237–247. [CrossRef]
23. Han, L.; Mavis, BY; Liu, E.; Zhang, Y.; Li, W.; Dal, X.; Fu, F.; Gao, X. A Cistanches deserticola YC Ma-ból származó feniletanoid-glikozidok szerkezeti jellemzése és azonosítása UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS segítségével. Phytochem. Anális. 2012, 23, 668–676. [CrossRef]
24. Lu, D.; Zhang, J.; Yang, Z.; Liu, H.; Li, S.; Wu, B.; Ma, Z. A Cistanches Herba kvantitatív elemzése nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával, diódasoros detektálással és nagy felbontású tömegspektrometriával kombinálva kemometrikus módszerekkel. J. Sep. Sci. 2013, 36, 1945–1952. [CrossRef]
25. Moon, M.; Kim, HG; Hwang, L.; Seo, JH; Kim, S.; Hwang, S.; Kim, S.; Lee, D.; Chung, H.; Ó, MS; et al. A ghrelin neuroprotektív hatása a 1-metil-4-fenil-1, 2, 3-ban, a Parkinson-kór 6-tetrahidropiridin egérmodelljében a mikroglia aktiváció blokkolásával. Neurotox. Res. 2009, 15, 332–347. [CrossRef]
26. Lupien, SJ; Isabelle, OM; Hupbach, A.; Tu, MT; Buss, C.; Walker, D.; Pruessner, J.; Mcewen, BS A stressz koncepción túl: allosztatikus terhelés – Biológiai és kognitív fejlődési perspektíva. In Fejlődési pszichopatológia: Második kötet: Fejlődési idegtudomány; John Wiley & Sons, Inc.: New York, NY, USA, 2015; 578–628.
27. Rizzo, M.; Rizvi, AA; Sudar, E.; Soskic, S.; Obradovic, M.; Montalto, G.; Boutjdir, M.; Mikhailidis, DP; Isenovic, ER A ghrelin kardiovaszkuláris és antiatherogén hatásainak áttekintése. Curr. Pharm. Des. 2013, 19, 4953–4963. [CrossRef]
28. Holst, B.; Lang, M.; Brandt, E.; Bach, A.; Howard, A.; Frimurer, TM; Beck-Sickinger, A.; Schwartz, TW Ghrelin receptor inverz agonisták: Egy aktív peptid mag és kölcsönhatás epitópjainak azonosítása a receptoron. Mol. Pharmacol. 2006, 70, 936–946. [CrossRef]
29. Yamazaki, M.; Nakamura, K.; Kobayashi, H.; Matsubara, M.; Hayashi, Y.; Kanagawa, K.; Sakai, T. A ghrelin szabályozási hatása a növekedési hormon szekréciójára perfundált patkány elülső agyalapi mirigy sejtekből. J. Neuroendocrinol. 2002, 14, 156–162. [CrossRef]
30. Lo, YH; Chen, YJ; Chung, TY; Lin, NH; Chen, WY; Chen, CY; Lee, MR; Chou, CC; A Tzen, JTC Emoghrelin, egy egyedülálló emodin származék Heshouwuban, a ghrelin receptor aktiválásával serkenti a növekedési hormon szekréciót. J. Ethnopharmacol. 2015, 159, 1–8. [CrossRef]
31. Moukhametzianov, R.; Warne, T.; Edwards, PC; Serrano-Vega, MJ; Leslie, AG; Tate, CG; Schertler, GF A 6-os hélix két különböző konformációját figyelték meg egy béta1-adrenerg receptor antagonistához kötött struktúráiban. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011, 108, 8228–8232. [CrossRef]
32. Rosenbaum, DM; Zhang, C.; Lyons, JA; Holl, R.; Aragao, D.; Arlow, DH; Rasmussen, SG; Choi, HJ; Devree, BT; Sunahara, RK; et al. Egy irreverzibilis agonista-béta(2) adrenoceptor komplex felépítése és működése. Természet 2011, 469, 236–240. [CrossRef]
33. Brooks, BR; Bruccoleri, RE; Olafson, BD; Államok, DJ; Swaminathan, S.; Karplus, M. CHARMM – Program makromolekuláris energia-, minimalizálási és dinamikai számításokhoz. J. Comput. Chem. 1983, 4, 187–217. [CrossRef]