A 4. rész tanulmányai kimutatták, hogy az autofágia fontos szerepet játszik a sejtes LD-lerakódás szabályozásában

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

2.14. Laktát-dehidrogenáz (LDH) vizsgálat

A gyártó utasításai szerint a sejteket egy 96-lyukú lemezre szélesztettük 5000 sejt/lyuk sebességgel, és a táptalajt összegyűjtöttük az LDH-szintek mérésére egy tesztkészlettel (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). Ezután a minták abszorbanciáját a Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) 450 nm-en detektáltuk.

2.15. BODIPY493/503, BODIPY 581/591 C11 és MitoTracker mélyvörös festés

Az élő sejteket PBS-sel mostuk, és 2 ug/ml BOD-IPY 493/5{11}}3-mal (InvitrogenTM, Cat D3922) vagy BODIPY 581/591 C11-gyel (BD-C11）(2)) inkubáltuk.{15}} μM, InvitrogenTM, Cat D3861）PBS-ben 15 percig 37 fokon A MitoTracker Deep Red festéshez az élő sejteket 0,5 ug/ml MitoTracker Deep Red-ben (InvitrogenTM, Cat M22426) PBS-ben inkubáltuk 30 percig, 30 percig 3 fokon. kétszer mostuk PBS-ben, és 10 percig 3,5 százalékos PFA-ban fixáltuk, majd 10 percig mostuk és ellenfestettük Hoechst 3342-vel (Sigma, Cat B2261), majd lefedtük üveglapokra a képalkotáshoz.mennyi cistanche-t kell venniA képeket megfigyeltük, és a fényképeket fluoreszcens mikroszkóppal rögzítettük (Olympus, Tokió, Japán).

További információért kattintson ide

2.16.Hoechst és PI festés

A sejteket Hoechst 33 342 (1 ul, 500 ul PBS-ben, Sigma, Cat B2261) és PI (0,1 ul 500 ul PBS-ben hígított, Solarbio, (cistanche perc alvás) és CA1020 perc alváshoz) festéssel festettük. majd fixáltuk és fluoreszcens mikroszkóppal megfigyeltük (Olympus, Tokió, Japán).

2.17. Áramlási citometria

A sejteket emésztettük és D-hank-kal öblítettük, majd Annexin V-FITC-vel (5 ul 5{4}}0 ul PBS-ben/PI-ben hígítva (0,1 ul 500 ul PBS-ben hígítva) megfestettük apoptózis kittel (CA1020, Solarbio, Peking, Chian). ) a gyártó protokollja szerint. Ezt követően az apoptotikus sejteket áramlási citometriával (guava easyCyterM 8, Millipore, USA) elemeztük. A mitokondriális ROS és a mitokondriális membránpotenciál méréseket a 【12】 közzététel szerint végeztük. Az SH-SY5Y sejteket MitoSOX-szal (2,5 μM, Invitrogen, USA) vagy JC1-gyel (10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, USA) festettük 37 fokon 30 percig. Kétszer PBS-sel történő mosás után a sejteket 1% FBS-t tartalmazó hideg PBS-ben újraszuszpendáltuk áramlási citometriás analízishez. Az adatokat az FCS Express szoftverrel (Guava Easy CyterM8, Millipore, Hayward, CA, USA) elemeztük.

2.18. Csikóhal légzési tesztjei

Élő SH-SY5Y sejtekben a mitokondriális légzésfunkciót Seahorse extracelluláris fluxus (XFe96) analizátorral (Agi-lent, Santa Clara, USA) mértük az oxigénfogyasztási ráta (OCR) változásán keresztül. A 3 × 10³ sejt/lyuk mennyiségben beoltott SH-SY5Y sejteket hagytuk a Seahorse sejttenyésztő lemezekhez tapadni, és a kísérlet idején megközelítőleg 80 százalékos összefolyást értek el. (cisztán tea) A következő napon a sejteket előkezeltük Ka-val, majd további 24 órán át MPP-nek* kitéve. Az OCR-t alapkörülmények között detektáltuk, majd egymás után 1 μM oligomicint, 1 μM FCCP-t, valamint 1 μM rotenont és antimycin A-t adtunk hozzá.

A Cistanche javíthatja az immunitást

2.19. Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SEM formában adtuk meg. A különbség szignifikanciáját Student-féle t-próbával, kétutas varianciaanalízissel vagy egytényezős varianciaanalízissel (ANOVA) határoztuk meg, amelyet Tukey post hoc teszt követett. A különbséget szignifikánsnak tekintették P<>

3. Eredmények

Eredmény1. A Ka helyreállítja a motoros diszfunkciót és növeli a dopaminszintet az MPTP/p PD modell egerek striatumában

A Kaon PD patogenezisének neuroprotektív hatásának vizsgálatára 4-hónapos hím C57BL/6 egereket injektáltunk MPTP neurotoxinnal, hogy létrehozzuk az MPTP/p PD modellt, és Ka-val kezeljük őket (la ábra). A modellindukciót követően a rotarod tesztet és a pólustesztet alkalmaztuk az egerek motoros és viselkedési teljesítményének értékelésére a különböző csoportokban. Amint látható, a rotarod teljesítményének ideje jelentősen csökkent az MPTP-vel kezelt egerekben, és ezt a hatást a Ka megakadályozta (1b. ábra). (cistanche tubulosa előnyei) A Ka az MPTP által kiváltott viselkedési hiányosságokat is helyreállította, amint azt a pólustesztben a fordulási idő és a teljes idő csökkenése jelzi (1c. és d. ábra), anélkül, hogy befolyásolta volna az egerek testtömegét (2. ábra). le). Továbbá a HPLC analízis kimutatta, hogy a striatum dopaminszintje szignifikánsan csökkent MPTP/p-vel kiváltott egerekben, és ezt a szintet a Ka-kezelés helyreállította (1f. ábra). (cistanche tubulosa kivonat) A Ka-kezelés szintén enyhítette az MPTP/p-vel kezelt egereket. p-indukált csökkenése a dihidroxi-fenil-ecetsav (DOPAC, a dopamin metabolitja) szintjének a striatumban (1g. ábra).superman gyógynövények cistancheEzek az eredmények arra utalnak, hogy a Ka helyreállítja a motoros diszfunkciót és növeli a dopaminszintet a striatumban MPTP-indukált PD egerekben.

2. eredmény: A Ka enyhíti a DA neuronok elvesztését MPTP/p PD modell egerek SNpc-jében

Ezt követően a Kaon MPTP/p-indukált DA neuronális károsodás neuroprotektív hatásának további értékelése érdekében immunfestéssel vizsgáltuk a tirozin-hidroxiláz (TH) neuronokat az egér SNpc-ben. Amint a 2a és b ábrán látható, az MPTP/p szignifikáns csökkenést indukált a TH neuronok számában, amit a Ka-kezelés enyhített. Továbbá az SNpc-ben lévő összes neuron sztereológiai száma, Nissl

1. ábra. A Ka-kezelés enyhíti a motoros diszfunkciót és növeli a dopaminszintet az MPTP/p PD modell egerek striatumában.

(a) A kísérleti terv sematikus diagramja. (cistanche tubulosa reddit) (b) A pálcán töltött időt három egymást követő napon mértük a rotarod teszthez. (cd) A rúdteszthez feljegyeztük a megfordulás (fordulás ideje) és a rúdon való leereszkedés idejét (mászás ideje). (e) A vizsgálat végén megmértük az egerek testtömegét. (fg) A dopamint (DA) és a dihidroxi-fenil-ecetsavat (DOPAC) a striatumban nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával elemezték. Az adatok átlag±SEM.n=9-10 értékként vannak kifejezve minden csoportra vonatkozóan (b,c,d);n=6-8 minden csoportra vonatkozóan (f,g).ns-ben, nem szignifikáns,* P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,kaempferol.="" staining,="" verified="" that="" the="" loss="" of="" th+="" cells="" reflected="" cellular="" death="" but="" not="" the="" downregulation="" of="" th="" expression="" and="" showed="" that="" ka="" treatment="" restored="" the="" decrease="" in="" the="" number="" of="" nissl-positive="" neurons="" in="" the="" snpc="" of="" mptp-treated="" mice="" from="" 43.3%="" to="" 25.4%="" (fig.="" 2c="" and="" d).in="" addition,="">a bioflavonoidok előnyeiA Ka szignifikánsan javította a TH és DAT fehérje expresszió MPTP által kiváltott csökkenését, amit Western-blottal mértünk (2e-g ábra). Ez a bizonyíték megerősíti a Kaon neuroprotektív hatását a PD egérmodellben.

3. eredmény: A Ka csökkenti az LD vakuolák felhalmozódását és az oxidatív stresszt az MPTP/p-vel kezelt egerek SNpc-jében

Egyre több bizonyíték támasztja alá az LD-k szerepét az NDD-kben [10], következetesen korábbi munkáink megnövekedett LD-értékeket azonosítottak az MPTP-indukált PD egerek SNpc-jében [12]. Az LD-k könnyen azonosíthatók, és kerek, alacsony sűrűségű, homogén struktúrákat mutatnak. amorf tartalom [28]. Normális esetben az LD-k autofágiával lebonthatók a felhalmozódás elkerülése érdekében [29].vegyél cistanche-tAnnak megvizsgálására, hogy a Ka képes-e szabályozni az LD-ket PD-ben, transzmissziós elektronmikroszkóppal (TEM) elemeztük az LD-k felhalmozódását a kontroll, MPTP/p és MPTP/p ＋ Ka egerek SNpc-jében. Amint azt korábbi munkánkból [12] mutattuk, az LD-k száma és mérete a következő volt

nőtt az MPTP/p egerekben a sóoldattal kezelt kontrollokhoz képest (3a. és b. ábra), és szignifikánsan csökkent a Ka-kezelt egerekben (3c-e. ábra). Ezenkívül a Ka-kezelt egerekben az LD-ket gyakrabban figyelték meg a közelben is, autolizoszómákba zárva vagy lebontva, amelyeket elektronsűrű lipofuscin granulátumként határoztak meg. A TH neuronok további szövettani festése BODIPY-val, egy olyan festékkel, amely specifikusan jelöli a semleges lipideket, és általánosan használt LD-k kimutatására [30], azt mutatta, hogy a BODIPY plusz LD-k száma és mérete az SNpc-ben magasabb volt PD egerekben, mint a kontrollokban. és szignifikánsan csökkent a Ka-kezelés (3f-h ábra).

Ha az LD-ket nem lehet időben lebontani, a felhalmozódott LD-k peroxidáción eshetnek át, és hozzájárulhatnak a mitokondriális ROS által közvetített stresszhez [4],távolságami felerősíti a neurotoxicitást és a betegség progresszióját. Ezért tovább vizsgáltuk a szabad FA toxicitás (Gpx8), a semlegesítő oxidatív fajok, a szuperoxid gyökök (Sod3) és a hidrogén-peroxid (Cat), valamint az FA metabolizmus (Acsbg1 és Dbi) elleni védelemmel kapcsolatos gének expressziós profilját, ahogy arról beszámoltunk [31]. , amelyek mindegyike feltűnően csökkent az MPTP-vel kezelt egerek SNpc-ében a kontrollokhoz képest, és ezek a hatások javultak a Ka-val kezelt PD egerekben (3i. ábra). Hasonlóképpen, az MPTP/p is növelte az mRNS expressziós szintjét

2. ábra. A Ka javítja a DA neuronok elvesztését MPTP/p PD modell egerek SNpc-jében.

(ab) Mikrofényképek a tirozin-hidroxiláz(TH)-pozitív neuronokról (a) és a TH-pozitív neuronok sztereológiai száma a substantia nigra pars compactában (SNpc) (b). A skálasávok a jelzettnek megfelelőek. (cd) Mikrofényképek krezilibolya-pozitív sejtekről (c) és krezilibolya-pozitív sejtek sztereológiai száma az SNpc-ben (d). Mérlegrúd, 120 um. (pl.) Western blot analízis a TH és DAT fehérje expressziójáról az SNpc-ben (e) és kvantitatív analízis (f,g). A számszerűsített adatokat a sóoldat-kontrollcsoportra normalizáljuk. Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki.*P<><0.01, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydroloyridine..="" (for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" nox1,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

4. eredmény: A Ka megvédi az SH-SY5Y sejteket az MPP plusz által kiváltott apoptózissal szemben

Az MPP, az MPTP aktív metabolitja gátolja a mitokondriális komplex enzimeket, és a PD-vel közvetlenül összefüggő sejthalált okoz [32]. Ezt követően azt vizsgáltuk, hogy a Ka képes-e megakadályozni az MPPt által kiváltott neuronális apoptózist in vitro. Ahogy a 4a. és b. ábrán látható, az MPPt (40 uM, 24 óra) indukálta az LDH felszabadulását az SH-SY5Y sejtekből, a Ka (30 és 60 uM) pedig jelentősen gyengítette az LDH felszabadulását anélkül, hogy befolyásolta volna a sejtek túlélését (4a. ábra). Mivel a Ka 30 μM koncentrációban jelentős védőhatást váltott ki (4. ábra). 4b), ezt a koncentrációt használtuk a következő kísérletekben. A Hoechst/PI festési eredmények azt is mutatták, hogy a Ka szignifikánsan csökkentette az MPPt-vel kiváltott kromatinkondenzációval (4c. és d. ábra) és sejtapoptózissal rendelkező sejtek százalékos arányát, amit a megnövekedett Hoechst fluoreszcencia intenzitás (4c. ábra) és a Hoechst/PI-vel festett sejtek (Hoechst plus /PI') (4e. ábra). Továbbá, amint azt áramlási citometriával kimutattuk, az MPP plusz sejtapoptózist indukált, amit az Annexin V-vel festett sejtek (AV/PI és AV plusz /PI plus) megnövekedett százalékos aránya bizonyít, a Ka védelmet nyújtott (4f. és g. ábra). Ezen túlmenően, Ka jelentősen megfordította az MPP által kiváltott változásokat az apoptózissal összefüggő fehérje expressziójában, amit a Bcl-2 fokozódása, a Bax downregulációja (4.hi-j. ábra) és a kaszpáz-3 csökkent hasadása bizonyít. (4h, k ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a Ka képes megszüntetni az MPPt káros hatásait a sejtek túlélésére.

Eredmény 5. A Ka gátolja az MPPt által kiváltott LD-felhalmozódást és lipidperoxidációt, amelyek közvetítik a mitokondriális károsodást az SH-SY5Y sejtekben

A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a váratlan LD-felhalmozódás fokozhatja a lipid-peroxidáció által közvetített stresszt, és felgyorsíthatja a mitokondriális diszfunkciót, ami elősegíti a neurodegenerációt [10]. Korábbi munkánk azt is kimutatta, hogy az SNpc-ben megnövekedett LD-k összefüggést mutatnak a PD-patológiával egerekben [12]. Annak vizsgálatára, hogy a Ka védő hatása összefüggésben van-e az LD-felhalmozódással in vitro, először LD-specifikus festést végeztünk SH-SY5Y sejtekben BODIPY 493/503 segítségével, és megfigyeltük a megnövekedett LD-lerakódást (a semleges lipidek fokozott szintje).

6. eredmény: Ka elősegíti az autofágiát és csökkenti az mtROS termelést MPP plusz-kezelt SH-SY5Y sejtekben

Általában az LD-ket autofágián keresztül juttatják a lizoszómákba, és FA-kra bonthatók a peroxidáció elkerülése érdekében. A bizonyítékok azonban azt mutatják, hogy az autofágia károsodott, ami döntő szerepet játszik a PD-ben [2]. Amikor az autofágia magában foglalja az LD-k lizoszómákban történő lebontását (6a. ábra), ezt a folyamatot kifejezetten lipofagiának nevezik [2]. Annak vizsgálatára, hogy az autofágia szerepet játszik-e a Ka neuroprotektív hatásában, megvizsgáltuk az autofágiához kapcsolódó fehérjék szintjét. Amint a 6b-d ábrákon látható, a tenyésztett SH-SY5Y sejtekben a mikrotubulusokhoz kapcsolódó fehérje könnyű lánc 3 (LC3)-II szintje jelentősen csökkent, míg a p62 expressziója jelentősen megnőtt az MPP plusz-kezelt sejtekben. immunoblottal mérve ezt a hatást jelentősen megfordította a Ka. Tovább vizsgáltuk az autofágia változásait LC3 immunfestéssel. Az autofagoszómák sejten belüli felhalmozódásának lehetővé tétele érdekében bafilomicint adtunk hozzá, hogy megakadályozzuk az autofagoszómák lizoszómákkal való fúzióját. Amint az látható, megnövekedett számú LC3b puncta volt kimutatható az MPP*-vel kezelt sejtekben, ami károsodott autofág degradációra utal, és ezt a hatást a Ka is megfordította (6e. és f. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az SH-SY5Y sejtekben az LD-ket az autofágia mobilizálja a végső eltávolításhoz, és hogy a Ka elősegítheti az autofágiát az oxidált lipid felhalmozódás csökkentésére. A fokozott lipid-peroxidáció súlyosbíthatja a mitokondriális károsodást a mitokondriális oxidatív stressz fokozásával [4]. Ezenkívül a Ka-kezelés jelentősen csökkentette a robusztus mtROS-generációt, amint azt MitoSOX festéssel határozták meg (6g és h ábra), és csökkentette a diszfunkcionális mitokondriumok számát, amint azt mitokondrium-specifikus címkék határozták meg a légzés (MitoTracker mélyvörös) és a teljes ( MitoTracker zöld) mitokondriumok (6i és j ábra). Ezen túlmenően, hogy közvetlen képet kapjunk a mitokondriális változásokról, tovább detektáltuk az oxigénfogyasztási arányt (OCR) a Seahorse XF analizátorral. Amint a 6k. ábrán látható, a mitokondriumok légzése csökkent az MPPt-vel kezelt sejtekben, míg a Ka-kezelés nyilvánvalóan visszafordítja ezt az MPP plusz által okozott károsodást (6k. ábra).

Eredmény7. Az autofágia gátlása in vitro megfordítja a Kaon LD felhalmozódásának, a mitokondriális diszfunkciónak és a DA neuronális károsodásának elnyomó hatását

Annak vizsgálatára, hogy az autofágia az egyik fő mechanizmus, amellyel a Ka közvetíti a DA neuroprotekciót, az autofágia gátló 3-MA-t használtuk. Azt találtuk, hogy a Ka gátló hatása az MPP# által kiváltott sérülésekre, beleértve a csökkent LD-felhalmozódást (7a. és b. ábra), a csökkent mtROS-termelést (7c. és d. ábra), valamint a mitokondriális diszfunkció enyhítését (7e. és f. ábra) SH-SY5Y sejteket jelentősen blokkolta az 3-MA. Mivel az LD oxidáció és a mitokondriális diszfunkció szorosan összefügg a DA neuronok halálával, ezt követően az elsődleges tenyésztett DA neuronokat vizsgáltuk. A tenyésztett mesencephalon TH plusz neuronokat Ka-val és/vagy MPPf-vel kezeltük, és immunfestéssel számszerűsítettük a TH plusz neuronális folyamatok számát és hosszát. A morfológiai elemzés kimutatta, hogy a neuronális folyamatok számát és hosszát az MPP plusz jelentősen csökkentette, a Ka pedig védett, és ezt a védelmet az 3-MA tovább fordította (7g-i. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a Ka enyhíti a DA neuronális károsodását az autofágia elősegítésével.

8. eredmény: Az Atg5 elnémítása megszüntette az idegsejtek elvesztésének Ka-közvetített megelőzését in vivo

Annak további megerősítésére, hogy a Ka autofágia-függő módon véd az MPTP/p-indukált TH és a neuronok elvesztése ellen, elhallgattuk az Atg5-öt egy adeno-asszociált vírus (AAV) mikroinjektálásával, amely egy korábban jellemzett, Atg5 elleni shRNS-t expresszál a kétoldali mesencephalonba (3. .8a) a korábban leírtak szerint [25]. Az előzetes kísérletekben megfigyeltük, hogy az Atg5 shRNS transzfekció 2 hétig elegendő GFP expressziót ért el a TH plusz neuronokban (8b. ábra), és gátolta az ATG5 expressziót az injektált egerek SNpc-jében (3. ábra). 8c). Azt találtuk, hogy az Atg{13}}knockdown megfordította a Ka neuroprotektív hatását, amit a TH fokozott fehérjeexpressziója (8d. és e. ábra) és a TH plusz neuronok számának növekedése bizonyít (8f. és g. ábra). Ezek az adatok tovább erősítik az autofágia hozzájárulását a Ka védő hatásához PD egerekben. Összefoglalva, megerősítettük, hogy a Ka védelmet nyújt az MPTP/p-indukált sérülésekkel szemben azáltal, hogy csökkenti az LD oxidációját és a mitokondriális diszfunkciót az autofágia elősegítésével.

4. Megbeszélés

A jelen tanulmány kimutatta, hogy a természetes kis molekula Ka kulcsfontosságú tényező, amellyel az autofág jelátvitel gátolja a lipidoxidatív toxicitást. Eredményeink azt mutatták, hogy az autofágia útvonal kulcsfontosságú szabályozó hurok, amelyen keresztül a Ka enyhíti az LD-peroxidációt és az azt követő mitokondriális károsodást, és az autofágia által szabályozott LD toxicitás szerepére összpontosított a mitokondriális károsodás enyhítésében, miközben megelőzi a túlzott oxidatív stressz miatti neurodegenerációt (1. 9).

Az LD-k a semleges lipidraktározás intracelluláris helyei [5], és kritikusak a lipidanyagcserében és az energiahomeosztázisban, míg az LD diszfunkcióját számos betegséggel hozták összefüggésbe [16]. A felhalmozódó bizonyítékok arra utalnak, hogy az LD-k szerepe a biológiában és a patológiában lényegesen szélesebb, mint azt korábban gondolták. A központi idegrendszerben a bizonyítékok azt mutatták, hogy az idegsejtekben és a gliasejtekben a megnövekedett LD-k szerepet játszanak a neurodegeneratív patológiában [10,36]. Részletesen, az LD-ket mind az in vitro tenyésztett Aplysia-neuronok axonjaiban [37], mind az agyi metszetekben kimutatták. Huntington-kór modellek [38]. Ezenkívül kimutatták, hogy a neuronok különösen érzékenyek a lipidtoxicitásra, és az LD-k felhalmozódása, amelyeket nem lehet időben eltávolítani, felgyorsult LD-peroxidációhoz vezet, és neurodegenerációhoz vezethet [17].

A hiperaktív neuronokban a lipidek felhalmozódása nemcsak azért toxikus, mert ezek a lipidek peroxidációra érzékenyek. Ezenkívül a feleslegben lévő LD-k tartalma nem oxidatív metabolikus pályákba kerülhet, ami túlzott ceramid-termelést válthat ki, amely toxikus a sejtekre [39]. A legújabb tanulmányok azt is kimutatták, hogy az LD-hibás sejtekben a FA-k acilkarnitinekké alakulhatnak, amelyek mitokondriális diszfunkciót és ROS-termelést okoznak [40]. Ezek a folyamatok valószínűleg specifikus és mélyreható következményekkel járnak a hiperaktív neuronokban, mivel a diszfunkcionális mitokondriumok veszélyeztetik az FA-felhasználási képességet, és az mtROS termelése tovább idézi elő a membrán lipidperoxidációját.

Így az LD homeosztázist jól ellenőrizni kell a neuronokban, ami kritikus a toxicitás elkerülése és végső soron az agy egészségének megőrzése szempontjából. Jelen tanulmányunkban azt találtuk, hogy a kis természetes molekula Ka gátolja a neuronális LD toxicitást, amely fokozott LD-felhalmozódásban, emelkedett lipidperoxidációban és a lipidtoxicitáshoz kapcsolódó génexpresszió fokozódásában nyilvánult meg MPP#-vel fertőzött SH-SY5Y sejtekben. Ennél is fontosabb, hogy azt is kimutattuk, hogy a Ka-kezelés csökkenti a 45]. Jelen tanulmányban hibás autofágiát/lipofágiát figyeltünk meg MPPt-sérült neuronális sejtekben, beleértve a csökkent LC3-II szintet és emelkedett p62 expressziót, valamint megnövekedett a sejtekben lerakódott LC3B pontok száma. A sérült SH-SY5Y sejtekben a hibás lipofagiát Ka-kezeléssel megfordították. Ennek eredményeként a Ka csökkentette az oxidált LD-k felhalmozódását, a sérült mitokondriumok felhalmozódását és az mtROS képződését az MPP#-val kezelt SH-SY5Y sejtekben. Fontos, hogy az autofágia 3-MA általi gátlása megszüntette az oxidált LD-k és a sérült mitokondriumok Ka-közvetített eliminációját, valamint a DA neuronsérülések enyhítését in vitro. Ezenkívül az autofágia gátlása az Atg5 knockdown által in vivo megfordította a Kaon DA neuronális degeneráció védő hatásait az MPTP-indukált PD egérmodellben. Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a Ka gátolja az LD toxicitással összefüggő mitokondriális károsodást azáltal, hogy elősegíti az autofágiát egy kísérleti PD modellben.

A felhalmozódó bizonyítékok azt mutatják, hogy a fokozott mtROS képződés a nagy aktivitású neuronok elsődleges jellemzője, és számos NDD-ben, köztük a PD-ben is megfigyelték [46]. Ellentmondásosak a jelentések arról, hogy a ROS oka vagy következménye az LD képződésnek [47,48]. Érdekes módon in vitro eredményeink azt mutatták, hogy az LD-peroxidáció farmakológiai gátlása o-tokoferollal megakadályozta az mtROS-képződést és a mitokondriális membránpotenciál rendellenességeket, valamint enyhítette a mitokondriális redukciókat, amint azt az SH-SY5Y sejtekben a Tomm20 festődés bizonyítja, ami alátámasztja azt az elképzelést, hogy az LD-peroxidáció szerepet játszik. okozati szerepe az MPP által kiváltott mitokondriális diszfunkcióban és az mtROS kialakulásában. Lehetséges azonban, hogy a megemelkedett ROS kezdetben felgyorsítja az LD képződését, majd az LD-k további ROS képződést indukálnak, és fokozzák az intracelluláris és mitokondriális ROS szintet.

Jelen tanulmányunkban kimutattuk, hogy az MPTP-indukált PD-ben szenvedő egerek magas szintű LD-felhalmozódást mutattak, amihez a DA neuronok fokozott elvesztése, felgyorsult ROS-közvetített stressz és viselkedési hiányok társultak. A Ka-kezelés megakadályozta az LD toxicitást in vitro, és javította a DA neuronok elvesztését és viselkedési hiányosságait a PD egérmodellben, és ezek a hatások autofágia-függőek voltak. Ezért indokolt azt a következtetést levonni, hogy a Ka elősegíti az autofágiát, és ez a fokozott autofágia csökkenti az oxidált LD felhalmozódását, csökkenti az mtROS termelést, és enyhíti a DA neuronok mitokondriális károsodását, ami hozzájárul az LD toxicitás gátlásához, ezáltal gyengíti a PD patológiát (1. ábra). 9).

Finanszírozás

Ezt a kutatást a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (81903587. sz.), a Kínai Posztdoktori Tudományos Alapítvány (No. 2019M661807), a Jiangsu tartomány Természettudományi Alapítványa (BK20190120) és a A Nanjingi Kínai Orvostudományi Egyetem Chinese Materia Medica első osztályú diszciplínájának nyílt projektje (2020YLXK006. sz.) és a Kábítószer-innovációs nagyprojekt (No. 2018ZX{8}}).

Ez a cikk a Redox Biology 41 (2021) 101911-ből származik