Ⅱ rész: Új fenilpropanoiddal helyettesített diglikozidok dereplikáció által vezérelt izolálása a Cistanche Salsából és a makrofágok NO-termelését gátló hatásuk
Mar 04, 2022
Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
A H-2 COZY-korrelációi H-1a és H-1b, valamint a H{{ közötti HMBC-korrelációk alapján egy 3-metil-butenil-csoport, egy aglikon szubstruktúra. 4}} és H-5, valamint az olefin szénatomok, kC 120,7 (C-2) és 136,4 (C-3) mellett. A savas hidrolizátum NMR spektrumanalízisével és HPLC spektrumanalízisével két cukorrészt állapítottunk meg, MS fragmentummintázattal. Abszolút konfigurációjukat D-glükóznak és L-ramnóznak határoztuk meg a savas hidrolizátum HPLC analízisével [17]. Ezeket a cukorrészeket -glükózként és a-ramnózként határozták meg az anomer protonok konstansainak összekapcsolásával. Az 1H-1H COZY spektrum szekvenciális korrelációkat mutatott H-13-tól H-63-ig és H-133-től H-633-ig (4. ábra).
Egy lefelé tolódott glükóz proton kH 4,70-nél (H-43) a glükóz acilszubsztituensére utalt. A HMBC spektrumból a H-43 és a C-9333 közötti korreláció megerősítette a koffeoil-szubsztituens helyzetét. A H-13 és C-1 (kC 64,5), valamint a H-33 (kH 3,68) és C-133 (kC 101,2) közötti HMBC korrelációk az egyes szubsztituensek helyzetére utalnak. . Ennek megfelelően a 6 vegyület szerkezetét 3-metilbutenil-O- -L-ramnopiranozil-(1→3)-4-O-(E)-koffeoil- -D-ként határoztuk meg. glükóz-piranozid és a cisztansalsid B.
A cisztanzalzid C (12), egy barna amorf por, C26H38O13 molekulaképletűnek bizonyult (plusz )-HR-ESI-QTOF-MS, amely csúcsot mutatott m/z 581,2213 [M plusz Na] plusznál (számított C26H38O13Na: 581,2205). Egy jellegzetes ion m/z 163-nál arra utal, hogy a szerkezetben koffeoil-szubsztituens található. A fragmentionok m/z 325 és m/z 471 mellett egy ramnóz egység és egy glükóz egység létezésére utaltak.
A 12-es és a 6-os NMR-spektrumok összehasonlítása azt mutatta, hogy az aglikonszerkezet kivételével hasonlóak. A 12-es NMR-spektrumban kC 380 (C-2) és 24,4 (C-3) paraffin szénatomot figyeltünk meg két olefin szén helyett kC 12{{16-on. }},7 (C-2) és 136,4 (C-3) a 6-os aglikonjában. A csíra metilcsoportjai (kH 0,88) a 12-es aglikonjában felfelé tolódnak el. H-4-hoz és H-5-hoz (kH 1,71 és 1,63) viszonyítva a 6 aglikonjában (2. táblázat). A 12-es aglikont egy 3-metil-butil-csoportnak tartották, amit az 1H és COZY NMR-spektrumok is megerősítettek. A 3-metil-butil-csoport csúcsai a következő értékeknél figyelhetők meg: 3,81 (1H, m, H-1a), 3,48 (1H, m, H-1b), 1,71 (1H, m). , H-3), 1,44 (2H, m, H-2) és 0,88 (H-4, 5).
A savas hidrolizátum HPLC-elemzése és az NMR-spektrum-analízis, valamint az MS-fragmentum mintázata két cukorrészt ismét megerősített. A cukrok abszolút konfigurációját D-glükózként és L-ramnózként azonosítottuk a savas hidrolizátum HPLC analízisével [17]. Egy -glükóz és egy a-ramnóz részt az anomer protonok kapcsolási állandóival igazoltunk. Az 1H-1H COZY spektrum szekvenciális korrelációkat mutatott H-13-től H-53-ig, H-133-től H-333-ig és H{{11}-ig. } H-433-re (4. ábra).
A szubsztituensek helyzetét HMBC analízissel igazoltuk. A HMBC spektrumban a H-13 és a C-1 (kC 67,2), a H-33 (kH 3,68) és a C-133 (kC 101,2) közötti korreláció H-43 (kH 4,70) és C-9333 (kC 165,7) kimutatható. Következésképpen a 12 szerkezetét 3-metil-butil-OaL-ramnopiranozil-(1→3)-4-O-(E)-koffeoil- -D-glükóz-piranozidnak és cisztansalside C néven.
A Cisztanzalsid D (17), egy amorf barna por, a pozitív módú, nagyfelbontású ESI-QTOF-MS módszerrel megállapították, hogy C31H38O14 molekulaképlete, amely addukt ioncsúcsot mutatott m/z 657,2147 [M plusz Na] plus mellett. (C31H38O14Na összegképletre számított: 657,2154). Fragmentionok, köztük egy [M plusz H x Aglikon x Rha x Acetil Glc] plusz ion m/z 147-nél, egy [M plus H x Aglikon x Rha] plusz ion m/z 351-nél és egy [M plus H x Aglikon] plusz iont is detektáltunk 497 m/z értéknél. Egy jellegzetes ion m/z 147-nél arra utal, hogy a szerkezetében kumaroil-szubsztituens van jelen. A fragmentionok m/z 351 és m/z 497 mellett egy ramnóz egység és egy acetil-szubsztituált glükóz egység létezésére utaltak.
Cistansalside fromcistanche gyógynövény
A 13C-NMR spektrum 31 szénatom jelenlétét mutatta ki. Két anomer protont figyeltünk meg kH 4,61 (1H, m, H-13) és 4,60 (1H, s, H{{10}}) mellett az 1H és a HSQC spektrumban. . Az 1H-NMR-spektrum metilcsoport jelenlétét mutatta 1,97-nél (3H, s, acetil-CH3), transz-olefint kH-nál 7,55 (1H, d, J=15,9 Hz, H{{) 25}}) és 6,34 (1H, d, J=15,9 Hz, H-8333) és két para-szubsztituált benzolgyűrű kH 7,53 (2H, d, J=6) értéknél. 9 Hz, H-3333, 5333) és 6,79 (2H, d, J=6,9 Hz, H-2333, 6333)/kH 6,98 (2H, d, J {{5) 0}},0 Hz, H-2, 6) és 6,65 (2H, d, J=8,0 Hz, H-3, 5) (2. táblázat) . A HMBC NMR spektrumból a karbonil szénatom kc 165,5 (C-9333) és H-8333, valamint a H-2333, 6333 és C-7333 (kc) közötti összefüggések 145,4) (E)-kumaroilcsoportot javasolt. A metil-protoncsúcs és a karbonil-szénatom közötti HMBC-korreláció 169,0 kc-nél megerősítette az acetilcsoport jelenlétét.
A 4-hidroxi-fenil-csoportot a H-3, 5 és a kvaterner aromás szénatomok közötti HMBC-korrelációk alapján javasoltuk 155,6 (C-4) és 128,6 (C{8}}) kC-n. . A hidroxilezett etilcsoportot a COZY NMR jelek igazolták: kH 2,66 (2H, t, J=6,1 Hz, H-7), 3,90 (1H, m, H-8a). ) és 3,54 (1H, m, H-8b). A H-7 és a C-1 (kC 128,6) és a C-2, 6 (kC 129,7) közötti HMBC-korrelációk egy 4-hidroxi-fenil-etil-csoportot javasoltak aglikon szubstruktúraként.
A savas hidrolizátum HPLC-analízise és az NMR-spektrumok két, az MS fragmensmintázat alapján javasolt cukorrészt igazoltak. A D-glükózt és az L-ramnózt a savas hidrolizátum HPLC analízisével határoztuk meg [17]. Egy -glükóz- és egy a-ramnóz-csoportot hoztunk létre az anomer protonok konstansainak kapcsolásával. Az 1H-1H COZY spektrum szekvenciális korrelációkat mutatott H-13-tól H-53-ig és H-133-től H-633-ig (4. ábra).
Az 1H-NMR spektrumból a H-23 (kH 4,69) és H-43 (kH 4,80) lefelé irányuló eltolódása a glükóz acil-szubsztituált helyzetére utal. A glükóz és két acilcsoport közötti kapcsolatokat a H-43 (kH 4,80) és C-9333, valamint a H-23 és egy acetilcsoport karbonil-szénatomja (kC 169,0) HMBC korrelációi igazolták. ). Az aglikon és a ramnóz helyzetét a H-33 (kH 3,95) és a C-1333, valamint a H-8 és a C-13 közötti HMBC korrelációk határozták meg. Ennek megfelelően a 17. vegyület szerkezetét 4-hidroxi-fenil-etil--2-O-acetil-O- -L-ramnopiranozil-(1→3)-4-O-(E)- kumaroil- -D-glükopiranozid és a cisztanzalzid D.
A Cistansalside E-t (18) amorf barna por formájában izoláltuk. Molekulaképletét C31H38O14-nek határozták meg a 13C-NMR adatok és a pozitív módú nagyfelbontású ESI-QTOF-MS csúcs m/z-nél 657,2166 [M plusz Na] plus (C31H38O14Na-ra számított: 657,2154). Ezen túlmenően, fragmentionokat is kimutattunk, köztük egy koffeoiliont 163 m/z-nél, egy [M plusz H x Aglikon x Rha] plusz iont m/z 367-nél és egy [M plus H x Aglikon]iont m/z 513-nál. A fragmensionok egy ramnóz egység és egy acetil-szubsztituált glükóz egység létezésére utaltak.
Az 1H-NMR-spektrum két anomer proton jelenlétére utalt kH 4,63 (1H, d, J=8,2 Hz, H-13) és 4,60 (1H, s, H{11}} értéknél) ) és két acil-szubsztituált glükóz proton kH 4,71 (1H, dd, J=8,9, 8,2 Hz, H-23) és 4,81 (1H, dd, J=9,7) , 9,5 Hz, H-43). Az 1H és HMBC spektrumok egy acetilcsoport létezésére utaltak kH 1,94-nél (3H, s, acetil-CH3), egy (E)-koffeoil-rész meglétére kH-nál 7,48 (1H, d, J=15,9 Hz, H-7333), 7,02 (1H, d, J=1,6 Hz, H-2333), 6,98 (1H, dd, J=8,1, 1,6 Hz, H-6333), 6,76 (1H,d, J=8,1 Hz, H-5333) és 6,21 (1H, d, J=15,9 Hz, H{ {67}}) és egy monoszubsztituált benzolgyűrű kH 7,29 (2H, m, H-3, 5), 7,21 (2H, m, H-2, 6) és 7,20 (1H, m, H-4) (2. táblázat). A H-7 (2H, kH 2,80, m) és a C-1 (kC 138,8), valamint a H-7 és C közötti HMBC-korrelációk alapján egy fenil-metil-csoport, egy aglikon szubstruktúra. -2, 6 (kC 128,9), valamint a H-7 COZY NMR jelei H-8a-val (1H, kH 3,99, m) és H-8b-vel (1H, kH 3,63, m).
A savas hidrolizátum HPLC-analízise és az NMR-spektrum analízise két cukorrészt ismét megerősített. A cukrok abszolút konfigurációját a savas hidrolizátum HPLC analízisével tisztáztuk, amelyekről megerősítették, hogy D-glükóz és L-ramnóz [17]. Egy -glükóz és egy -ramnóz részt az anomer protonok konstansainak kapcsolásával hoztunk létre. Az 1H-1H COZY spektrum szekvenciális korrelációkat mutatott H-13-től H-53-ig, H-133-től H-233-ig és H{{11}-ig. } H-333-re (4. ábra).
A HMBC spektrumból a H{{0}} és a C-8 (kC 69,4), a H-23 és egy acetilcsoport karbonil-szénatomja (kC 169,1) közötti összefüggések H-33 (kH 3,95) és C-133 (kC 102,0) és H-43 (kH 4,81) és C-9333 (kC 165,6) között megerősítette a szubsztituensek helyzetét a szerkezet. Ezért a 18. vegyület szerkezetét fenil-etil-2-O-acetil-OaL-ramnopiranozil-(1→3)-4-O-(E)-koffeoil- -D-glükopiranozidnak és a cistansalside E.
A legtöbb transz-cinnamoil szubsztituens in vitro izomerizálódott cisz-izoformává. Beszámoltak arról, hogy a fény transz-fahéjsav-származékokat cisz-izoformákká alakítja [18,19]. A cinnamoil-szubsztituensek transz-cisz konverziójának egyensúlyát megfigyelték, hogy az izolátumok körülbelül 70%-át a transz-izoformában tartja. A cisz-forma olefin protonjainál a csúcsok körülbelül 6,90 ppm (d, J=12~13 Hz, H-7333) és 5,80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) hozzárendelhetőek az 1H-NMR-spektrumokban, míg a csúcsok körülbelül 7,55 ppm-nél (d, J=15,8 Hz, H-7333) és 6,40 ppm-nél (d, J {) {28}},8 Hz, H-8333) volt megfigyelhető a transzformációnál [20]. A transz-cisz keverékek 1H-NMR spektrumában két olefin proton (H-7333 és H-8333) csúcsait figyeltük meg 7:3 (transz:cisz) arányban. A cisz forma13C-NMR csúcsai hasonlóak voltak a transzformációéhoz.
A cistanche hatékony összetevői: akteozidok
Minden izolátumot megvizsgáltunk az LPS-indukált NO-termelésre gyakorolt gátló hatásuk szempontjából RAW-ban
Az összes izolátumot megvizsgáltuk az LPS-indukált NO termelésre gyakorolt gátló hatásuk szempontjából RAW 264.7 sejtekben. Pozitív kontrollként dexametazont használtunk, és IC50 értéke 7.0 uM volt. A vizsgált vegyületek közül az 5 (IC50 42,7 o 6,6 uM), 11 (IC50 37,3 o 2,2 uM), 13 (IC50 40) vegyület.{{2{{ 24}}}} o 4.0 uM) és 18(IC50 27,9 o 0,8 uM) mérsékelt gátló hatást mutatott az indukálható NO-szintázra, míg a többi vegyület inaktív volt ebben a vizsgálatban (IC50). értékek > 100 uM). Annak ellenőrzésére, hogy ezeknek a vegyületeknek van-e citotoxicitásuk, a sejtek életképességét MTT vizsgálattal mértük. Ennek eredményeként egyikük sem mutatott szignifikáns citotoxicitást (S6-1 kiegészítő ábra). Ezt a négy vegyületet azért választottuk ki, hogy kiértékeljük az NF-λB útvonal elleni gátló hatásukat LPS-stimulált RAW 264.7 sejtekben. A RAW 264.7 sejtek LPS-sel történő stimulálása az I΅B és NF-΅B (p65) foszforilációját indukálta 0,5 órás inkubáció után. Az NF-入 B (p65) foszforilációja szignifikánsan csökkent a 11., 13. és 18. vegyülettel végzett előkezelés hatására, amint azt a Western blot analízis mutatja (5. ábra). Ezért a 11, 13 és 18 vegyületek gyulladásgátló hatást fejthetnek ki az NF-΅B makrofágokban való gátlásán keresztül.
5. ábra.Négy vegyület hatása az I入B és NF-入B (p65) foszforilációjára LPS-stimulált RAW 264.7 sejtekben. (A) A Western-blotokat LPS-ben és mintával kezelt RAW 264.7 sejtekben végeztük; (B, C) Az immunblot jeleket Molecular Analyst/PC denzitometriás szoftverrel (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) határoztuk meg. A foszforilált izoformák denzitometriás elemzését közölték. A RAW 264.7 sejtben az NF-入 B-t -aktintartalomra normalizáltuk.
3. Anyagok és Mód
3.1. Általános kísérlet Eljárás
Az optikai elfordulásokat Jasco P-2000 digitális polariméterrel mértük (Jasco, Tokió, Japán). Az UV-spektrumokat Chirascan plus Circular Dichroism spektrométerrel (Chirascan, APL, UK) vettük fel. Az IR-spektrumokat Jasco FT/IR-4200 spektrofotométerrel vettük fel. A nagy felbontású elektropermet ionizációs kvadrupól repülési idő tömegspektrometriát (HR-ESI-qTOF-MS) egy Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS készüléken végeztük, amely Agilent 1260 Infinity sorozattal (Agilent Technologies, Inc. Technologies) volt felszerelve. , Palo Alto, CA, USA), és a használt oszlop egy Jasco SFCpak Crest C18T-5 oszlop volt (id 150 4,6 mm, 5 um). Az adatgyűjtéshez MassHunter Workstation szoftvert használtunk.
Az 1D (1H és 13C) és 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR-spektrumokat egy Jeol LA 300 (Jeol, Tokió, Japán), Bruker AVANCE-400, Bruker készülékkel vettük. AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 és Bruker AVANCE 800 HD spektrométerek krio-szondával (Bruker, Ettlingen, Németország). NMR-oldószerként és referenciacsúcsként (kH 2,50 és kC 39,5) DMSO-d6-ot (Cambridge Isotope Laboratories, Cistanche Andover, MA, USA) használtunk. Az oszlopkromatográfiát (CC) Sephadex LH-20 (25–100 um; Pharmacia, Uppsala, Svédország) vagy Kieselgel 60 szilikagéllel (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck, Darmstadt) használtuk. , Németország). A vékonyréteg-kromatográfiát (TLC) előre bevont Kieselgel 60 szilikagél F254 lemezeken (Art. 5715; Merck) végeztük. A vékonyréteg-kromatográfiás foltokat UV-lámpával detektáltuk 254 nm-en és 365 nm-en (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Franciaország). A közepes nyomású folyadékkromatográfiát (MPLC) RediSep 120 g-os szilika flash oszlopon (Isco, Lincoln, NE, USA) és Kiesegel 60 szilikagélen (40-63 um, 230-400 mesh, Art. 9385; Merck) végeztük. Combiflash társ (Isco). A nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) rendszer egy Gilson HPLC volt, Gilson 321 pumpával és UV.VIS 151 detektorral (Gilson, Middleton, WI, USA), félpreparatív ODS oszlopokkal (Luna 5 um C18 (2)). 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, Németország; Inno C018 oszlop Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Korea). Az analitikai RP-HPLC rendszer egy Waters 2695 szövetségi rendszer volt 996 Photodiode Array (PDA) detektorral (Waters Corp, Milford, MA, USA), az alkalmazott oszlop pedig egy Hypersil™ BDS C18 oszlop volt (130 Å, id 150: 4,6). mm, 5 um, Thermo Scientific™). A hangyasavat a Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd.-től (Szöul, Korea) vásároltuk. A HPLC minőségű oldószereket a Fisher Scientific Korea Ltd.-től (Szöul, Korea) vásároltuk. A H2SO4-et, Na2CO3-at és az extrakcióhoz, frakcionáláshoz és izoláláshoz szükséges első osztályú oldószereket a Daejung Chemical & Metals Co. Ltd.-től (Szöul, Korea) vásároltuk. Az L- és D-cisztein-metil-észter-hidrokloridot és az o-tolilizotiocianátot a Tokyo Chemical Industry-tól (Tokió, Japán) vásároltuk.
3.2. Növény Anyag
Az egész növényCistanche salsa, amelyeket a Shinjang Ujguroktól gyűjtöttek be, a Daerim Pharmaceutical Wholesale Company-n (Cheongju, Korea) keresztül importálták. Prof. Dr. Jehyun Lee (Dongguk Egyetem, Szöul, Korea) azonosította őket. Az utalványmintát (SNUPH2016-03) a Szöuli Nemzeti Egyetem Gyógyszerészeti Főiskola Herbarium of Medicinal Plant Gardenében helyezték letétbe.
3.3. Kivonás és Elkülönítés
A szárított egész növényeketCistanche salsa(5,7 kg) felaprítottuk, és háromszor extraháltuk MeOH-val (20 l) szobahőmérsékleten 99 perces ultrahangos kezelés mellett. Az oldószer vákuumban történő eltávolítása után a nyers extraktumot (1,35 kg) 5 liter vízben szuszpendáljuk, majd 5 liter etil-acetáttal megosztjuk. Az EtOAc maradékot (55,3 g) 16 frakcióra (E01-16) választottuk szilikagél kromatográfiával, eluálószerként CHCl3/MeOH (50:1-0:1, lépcsőzetes gradiens rendszer) alkalmazásával.
Az E08-at (611,7 mg) szilikagélen közepes nyomású folyadékkromatográfiának vetettük alá (25 g), és CHCl3/MeOH-val (18:1–0:1, lépcsőzetes gradiens rendszer) eluáltuk. 11 törtet adott (E08a-k). Az E08g-ből a 13. (0,7 mg) és a 18. vegyületet (0,6 mg) Luna 5 um HPLC oszlopon tisztítottuk, és izokratikus eluálást végeztünk 28%-os vizes oldattal. MeCN. Az E08h (138,5 mg) HPLC-tisztítása (Hypersil GOLD, 25%-os vizes MeCN) a 7 (10,6 mg), 8 (17,2 mg), 14 (13,4 mg) és 17 (4,9 mg) vegyületet eredményezte.
Az E09-et (1,15 g) szilika-MPLC oszlopon (20 g) tovább tisztítottuk, CHCl3/MeOH (10:1–0:1, lépés: gradiens rendszer), így 11 szubfrakciót kapunk (E09a-k). Az E09e-t (398,7 mg) Sephadex LH-20-nak (MeOH) vetettük alá, és nyolc szubfrakciót (E09e1-8) kaptunk. Az E09e6-ot ezt követően Hypersil GOLD HPLC oszlopon (22%-os vizes MeCN) tisztítottuk, így a 11. vegyületet (0,4 mg) kaptuk. Az E09e7-ből az 5. vegyületet (0,6 mg) izokratikus eluálással tisztítottuk Luna 5 um-es HPLC oszlopról 40%-os vizes oldattal. MeOH.
Az E10-ot (1,20 g) kilenc frakcióra (E10ai) választottuk Sephadex LH-20 oszlopon, MeOH-val eluálva. Az E10g (147,5 mg) vegyületből a 4 (13,4 mg), 9 (8,0 mg) és 15 (5,0 mg) vegyületet izoláltuk HPLC elválasztással (Inno, 23%-os vizes MeCN). Az E10h frakciót (470,0 mg) Hypersil GOLD oszlopon tisztítottuk izokratikus eluálással (40%-os vizes metanol), így az 1 (3,8 mg), 10 (42,1 mg) és 16 (3,0 mg) vegyületet kaptuk.
Az E11-et (2,96 g) Sephadex LH-20-nek vetjük alá MeOH-val eluálva, így kilenc frakciót kapunk (E11a-i). Az E11e-t Sep-Pak C18 patronnal választottuk el, eluálva lépésenként 10, 20, 30, 50 és 100 százalékos vizes oldattal. MeOH-val hét frakciót (E11e1-7) kapunk, majd Luna 5 um HPLC-vel (28%-os vizes MeCN) a 3 (3,4 mg), 6 (1,4 mg) és 12 (1,2 mg) vegyületet kapjuk.
Az E12-t (19.{2}} g) szilícium-dioxid MPLC-nek (120 g) vetettük alá CHCl3/MeOH fokozatos gradiens rendszer alkalmazásával, így hat frakciót kaptunk (18:1–0:1). , E12a-f). Az E12f-et Sephadex LH-20 oszlopon (MeOH) kromatografáltuk, így hét frakciót (E12f1-7) kaptunk. Az E12f7 HPLC tisztítása (Hypersil GOLD, 25%-os vizes MeCN) 2. vegyületet (3,3 mg) eredményezett. A HPLC-hez használt összes oldószer 0,05%-os hangyasav puffer volt. A HPLC és MPLC kromatográfia általános áramlási sebessége 3, illetve 40 ml/perc volt.
3.4.Jellemzés
Cisztanzalzid A (5): barna amorf por; [ |20 x33,7 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (loge) 332 (3,18); IR (tiszta) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) és 13C-NMR (200 MHz) adatokat lásd a 2. táblázatban; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plusz Na] plusz 645,2146 (C30H38O14Na-ra számítva: 645,2154).
Cisztanzalzid B (6): barna amorf por; [ |20 x72,9 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (loge) 333 (3,32); IR (tiszta) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; 1H-NMR (500 MHz) és 13C-NMR (125 MHz) adatok, lásd a 2. táblázatot; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plusz Na] plusz 579,2054 (C26H36O13Na-ra számítva, 579,2048).
Cisztanzalzid C (12): barna amorf por; [ |20 x61,6 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (loge) 337 (3,25); IR (tiszta) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) és 13C-NMR (200 MHz) adatokat lásd a 2. táblázatban; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plusz Na] plusz 581,2213 (C26H38O13Na-ra számítva: 581,2205).
Cisztanszalzid D (17): barna amorf por; [ |20 x51,1 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) Amax nm (loge) 221 (3,53), 315 (3,52); IR (tiszta) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; 1H-NMR (400 MHz) és 13C-NMR (75 MHz) adatok, lásd a 2. táblázatot; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plusz Na] plusz 657,2147 (C31H38O14Na-ra számítva: 657,2154).
Cisztanszalzid E (18): barna amorf por; [ |20 x59,2 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) Amax nm (loge) 336 (3,22); IR (tiszta) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) és 13C-NMR (200 MHz) adatokat lásd a 2. táblázatban; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plusz Na] plusz 657,2166 (C31H38O14Na-ra számítva: 657,2154)
3.5.HPLC-QTOF-MS Elemzés
A kromatográfiás-tömegspektrometriás elemzést Agilent 1260 Infinity sorozatú LC rendszeren (Agilent Technologies, Inc., USA) végeztük. Az analitikai oszlop egy SFCpak Crest C18T-5 oszlop volt (id 15{{10}}: 4,6 mm, 5 um, Jasco, Japán). A mozgófázis 0,1% (v/v) hangyasavból állt MeCN-ben (A) és vízben (B), gradiens elúcióval 0-35 perc (23% A), 35-45 perc ( 23–28 százalék A), 45–75 perc (28 százalék A) és 75–80 perc (90 százalék A). Az áramlási sebességet 0,3 ml/perc értéken tartottuk. Az abszorbanciát 320 nm-en mértük. Az ESI forrás feltételei a következők voltak: szárítógáz (N2) áramlási sebesség, 10 l/perc; szárítógáz hőmérséklet, 350 fok; porlasztó, 30 psig; köpenygáz áramlási sebessége, 12,0 l/perc; köpenygáz hőmérséklet, 350 fok ; kapilláris, 4000 V; szkimmer, 60 V; oktapol RF, 750 V; fragmentor feszültség, 180 V; pozitív mód. A rendszer Masshunter munkaállomás szoftverrel működött. A tömegtartományt m/z 50–1000 között állítottuk be.
3.6.Sav Hidrolízis
A vegyületeket 1 N H2SO4-dal (100 ul) hidrolizáltuk, vízfürdőn 90 fokon 2 órán át melegítettük, majd telített vizes Na2CO3-oldattal semlegesítettük. Miután az oldatokat nitrogénáramban szárítottuk, a termékeket és a standard cukrokat (D-Glc, L-Glc, L-Rha) 0,5 mg L-cisztein-metil-észter-hidrokloridot tartalmazó piridinben (100 ul) feloldottuk. Egy L-ramnóz mintát 0,5 mg D-cisztein-metil-észter-hidrokloridot tartalmazó piridinben (100 ul) oldunk. Ezt követően 1 órán át 60 fokon melegítettük. Az oldatokat 1 ul (1,11 mg) o-tolilizotiocianáttal kezeltük, majd ismét 60 fokon 1 órán át melegítettük. Minden egyes végső keveréket közvetlenül analizáltunk analitikai RP-HPLC-vel (Hypersil™ BDS C18 oszlop, 17%-os vizes MeCN, 0,8 ml/perc, 40 perc, 35 °C). A 21,9 és 40,4 percnél mért csúcs tR értéke egybeesett a D-glükóz, illetve az L-ramnóz tiokarbamoil-tiazolidin származékának értékével.
3.7. Sejt Kultúra
Az egér makrofágokat (RAW 264.7) a Koreai Biotudományi és Biotechnológiai Kutatóintézettől (Daejeon, Korea) szereztük be, és 10% magzati szarvasmarha szérumot és 100 U/ml penicillin/sztreptomicin-szulfátot tartalmazó RPMI táptalajban növesztettük. A sejteket párásított, 5 százalékos CO2 atmoszférában, 37 fokon inkubáltuk.
3.8. Kábítószerek és vegyszerek
Az RPMI-t, a penicillint és a sztreptomicint a HyClone-tól (Logan, UT, USA) vásároltuk. A szarvasmarha-szérumalbumint és az LPS-t a Sigmától (St. Louis, MO, USA) vásároltuk.
3.9. A NO-termelés mérése
A nitrit koncentrációt a tápközegben mértük a NO-termelés indikátoraként a Griess-reakció szerint. A sejteket 2:105 sejt/lyuk arányban oltottuk be 96-lyukú tenyésztőlemezekre. A RAW 264.7 sejtek 18 órás előinkubálása után a sejteket előkezeltük vegyületekkel (5 0 uM, 10 uM, 5 uM vagy 1 uM), és LPS-sel (500 ng/ml) stimuláltuk 24 percig. h. Tesztvegyületek DMSO-ban oldva. A sejteket 0,05% DMSO-val is kezeltük vivőanyag-kontrollként. RAW 264.7 sejteket (2: 105 sejt/lyuk) tenyésztettünk 96-lyukú lemezeken RPMI-vel fenolvörös nélkül, és 0,5 órán át mintákkal előkezeltük. A celluláris NO termelést 500 ng/ml végső koncentrációjú LPS hozzáadásával és 24 órás inkubációval indukáltuk. Az inkubálást követően 100 ul kondicionált tápközeget kevertünk össze azonos térfogatú Griess-reagenssel, és 15 percig inkubáltuk. A keverék abszorbanciáját 540 nm-en mértük ELISA mikrolemez-leolvasóval (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA). A kapott értékeket összehasonlítottuk az RPMI-ben oldott nátrium-nitrit standard koncentrációival, és kiszámítottuk a nitrit koncentrációját a mintával kezelt sejtek kondicionált tápközegében.
3.10.3-(4,5-Dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromid (MTT) sejtéletképességi vizsgálat
A sejteket {{0}}lyukú lemezekre oltottuk 5:104 sejt/lyuk sűrűséggel, és szérummentes táptalajjal inkubáltuk minták jelenlétében. Tesztvegyületek DMSO-ban oldva. A sejteket 0,05% DMSO-val is kezeltük vivőanyag-kontrollként. 24 órás inkubálást követően 10 ul MTT-t (5 mg/ml sóoldatban) adtunk hozzá, és az inkubálást további 4 órán át folytattuk. A mitokondriális szukcinát-dehidrogenáz élő sejtekben az MTT-t látható formazánkristályokká alakítja az inkubáció során. A formazánkristályokat ezután dimetil-szulfoxidban szolubilizáltuk, és az abszorbanciát 540 nm-en mértük enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) mikrolemez-leolvasóval (Benchmark, Bio-Rad Laboratories). A relatív sejtéletképességet a kezeletlen kontrollcsoport abszorbanciájával hasonlítottuk össze. Minden kísérletet három párhuzamosban végeztünk.
3.11. Immunblot analízis
A fehérjeexpressziót Western-blot-eljárással értékeltük standard eljárások szerint. Röviden, a RAW264.7 sejteket 6{{20}} mm-es tenyésztőedényekben (2:106/ml) tenyésztettük, majd 50 uM vegyülettel előkezeltük. . A sejteket kétszer mostuk jéghideg PBS-ben (pH 7,4), a sejtpelleteket jégen lízispufferben 15 percig újraszuszpendáltuk, majd a sejttörmeléket centrifugálással eltávolítottuk. A fehérjekoncentrációt Bio-Rad protein assay reagenssel határoztuk meg a gyártó utasításai szerint. A fehérjét (20–30 ug) 1:1 arányban kevertük össze 2: mintapufferrel (20 százalék glicerin, 4 százalék SDS, 10 százalék 2- ME, 0,05% bróm-fenolkék és 1,25 M Tris [pH 6,8]), 8 vagy 15% SDS-PAGE gélekre töltve, és 150 V-on 90 percig futtatjuk. A sejtfehérjéket Immunoblot polivinilidén-difluorid membránokra (Bio-Rad) vittük át Bio-Rad félszáraz transzfer rendszerrel a gyártó utasításai szerint. A membránokat ezután egy éjszakán át inkubáltuk a megfelelő p-NF-入B, NF-入B, pI入B és -aktin elsődleges antitestekkel (Abcam, Cambridge, UK) 5% fölözött tejet és 0,1% Tweent tartalmazó Tris-pufferolt sóoldatban. 20. A következő napon a blotokat háromszor mostuk Tris-pufferolt sóoldattal (0,1 százalék Tween 20), és 1 órán át inkubáltuk HRP-vel konjugált másodlagos anti-IgG antitesttel (1:2000–1 arányban hígítva). :20 000). A blotokat ismét háromszor mostuk Tris-pufferolt sóoldattal (0,1% Tween 20), és az ECL Plus kemilumineszcens szubsztrát (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) segítségével immunreaktív sávokat hoztunk létre.
3.12. Statisztikai elemzés
A kísérleti adatokat átlag o SEM-ként mutatjuk be. A statisztikai szignifikancia szintjét varianciaanalízissel (ANOVA), majd Dunnett-féle t-teszttel határoztuk meg többszörös összehasonlításra.p A 0,05-nél kisebb értékeket tekintettük szignifikánsnak.
Cistanche salsa kivonat
4. Következtetések
Ebben a vizsgálatban öt új fenilpropanoid-szubsztituált glikozid, a cistansalsid AE (5, 6, 12, 17 és 18) szerkezetét izoláltuk és tisztáztuk, amellett, hogy 13 ismert vegyületet izoláltunk és azonosítottunk, dereplikációs stratégia alkalmazásával. Az ismert vegyületek a következők: lipedozid AI (1) [21], 23-acetil-lakteozid (2) [22], izocisztanozid C (3) [15], ozmanthuzid B (4) [21], epimeridinozid A ( 7) [15], cisztanozid D (8) [23], salzazid B (9) [6], tubulozid E (10) [16], cisztanozid M (11) [15], izomartynozid (13) [24], salzasid C (14) [6], jionozid C (15) [25] és salzasid F (16) [6]. Szerkezetüket kiterjedt spektroszkópiai adatok elemzésével és az irodalomban közölt adatokkal való összehasonlítással állapították meg. Megerősítették, hogy a fenilpropanoid-szubsztituált glikozidok feltételesen megjósolt szerkezetei helyesen illeszkedtek valós szerkezetükhöz.
A Cistanche salsa kivonat előnyei
Hivatkozások
1. Shimamura, H.; Miyazawa, M.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I.; Kameoka, H. A Trp-P-1 SOS-indukáló aktivitásának elnyomása Cistanche salsából származó zsírsavakkal a Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002 umu tesztben. Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 261–265. [CrossRef]
2. Jeon, E.; Chung, K.-S.; An, H.-J. A Cistanches salsa proliferációt gátló hatásai a jóindulatú prosztata-megnagyobbodás progressziójára. Tud. J. Physiol. Pharmacol. 2016, 94, 104–111. [CrossRef] [PubMed]
3. Xu, C.; Jia, X.; Xu, R.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Sun, S. Herba Cistanches gyors megkülönböztetése többlépcsős infravörös makro-ujjlenyomattal kombinálva az osztályanalógia lágy független modellezésével (SIMCA). Spectrochim. Acta Part A Mol. Biomol. SpectrosCistanche2013, 114, 421–431. [CrossRef] [PubMed]
4. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Herba Cistanches differenciálása ujjlenyomat alapján nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás-diódasoros detektáló-tömegspektrometriával. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]
5. Kobayashi, H.; Karasawa, H.; Miyase, T.; Fukushima, S. Tanulmányok a Cistanchis Herba összetevőiről. V. Két új fenilpropanoid-glikozid izolálása és szerkezete, a Cistanosides E és F. Chem. Pharm. Bika. 1985, 33, 1452–1457. [CrossRef]
6.Lei, L.; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F.; Wu, L.-J.; Chen, F.-K. Új glikozidok a Cistanche salsából. Helv. Chim. Acta 2007, 90, 79–85. [CrossRef]
7. Kartbaeva, EB; Sakipova, ZB; Ibragimova, LN; Kapsalyamova, EN; Ternynko, II A Kazah Köztársaságban termő Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck fenolos vegyületeinek összetételi vizsgálata. J. Chem. Pharm. Res. 2015, 7, 120–122.
8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zeng, Z.-L. A fenil-etanoid-glikozidok jobb felhalmozódása a Cistanche salsa szuszpenziós tenyészetébe való prekurzor táplálással. Biochem. Eng. J. 2007, 33, 88–93. [CrossRef]
9. Maruyama, S.; Akasaka, T.; Yamada, K.; A Tachibana, H. Cistanche salsa kivonat a fehérjéhez kötötthez hasonlóan hat
poliszacharid-K (PSK) különböző típusú sejtvonalakon. J. Tradit. Med. 2008, 25, 166–169.
10. Tian, X.-F.; Pu, X.-P. A Cistanches salsából származó feniletanoid glikozidok gátolják a 1-metil-4-fenilpiridinium-ion által kiváltott apoptózist a neuronokban. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 59–63. [CrossRef] [PubMed]
11. Michel, T.; Halabalaki, M.; Skaltsounis, AL Új fogalmak, kísérleti megközelítések és dereplikációs stratégiák a természetes forrásokból származó új fitoösztrogének felfedezéséhez. Planta Med. 2013, 79, 514–532. [CrossRef] [PubMed]
12.De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ingmar, H.; Larsen, TO; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Depsides theaflavins ST és lecanora DF dereplication-guided izolálása a Setophoma sp. endofita gombából. Fitokémia 2015, 111, 154–162. [CrossRef] [PubMed]
13.Rakotondraibe, LH; Rasolomampianina, R.; Park, H.-Y.; Li, J.; Slebodnik, C.; Brodie, PJ; Blasiak, LC; Hill, R.; TenDyke, K.; Shen, Y.; et al. Antiproliferatív és antiplazmodiális vegyületek kiválasztott Streptomyces fajokból. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2015, 25, 5646–5649. [CrossRef] [PubMed]
14. Jiang, Y.; Liu, F.-J.; Wang, Y.-M.; Li, H.-J. Új hepatoprotektív triterpenoid szaponinok dereplikáció által vezérelt izolálása Celosiae Semenből nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával, elektropermetes ionizációs tandem kvadrupólus-repülési idő tömegspektrometriával párosítva. J. Pharm. Biomed. Anális. 2017, 132, 148–155. [CrossRef] [PubMed]
15.Zhang, J.; Li, C.; Che, Y.; Wu, J.; Wang, Z.; Cai, W.; Li, Y.; Ma, Z.; Tu, P. A hagyományos kínai orvoslás LTQ-Orbitrap alapú stratégiája az osztályok felfedezését, azonosítását és omikakutatását célozta: Esettanulmány fenil-etanol-glikozidokról három különböző Herba Cistanches fajában. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [CrossRef]
16. Yoshizawa, F.; Deyama, T.; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. A Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook alkotóelemei. f. II. Egy új feniletanoid-glikozid és egy új neolignán-glikozid izolálása és szerkezete. Chem. Pharm. Bika. 1990, 38, 1927–1930. [CrossRef]
17. Tanaka, T.; Nakashima, T.; Ueda, T.; Tomii, K.; Kouno, I. Aldóz-enantiomerek könnyű megkülönböztetése fordított fázisú HPLCistancheChem. Pharm. Bika. 2007, 55, 899–901. [CrossRef] [PubMed]
18. Wong, WS; Guo, D.; Wang, XL; Yin, ZQ; Xia, B.; Li, N. A cisz-fahéjsav vizsgálata Arabidopsis thaliana-ban. Plant Physiol. Biochem. 2005, 43, 929–937. [CrossRef] [PubMed]
19.Kahnt, G. Hidroxifahéjsavak transz-cisz-egyensúlya vizes oldatok besugárzása során különböző pH-n. Phytochemistry 1967, 6, 755–758. [CrossRef]
