Ⅰ rész Europium nanorészecskék oldalirányú áramlási immunvizsgálatának kidolgozása a vizeletben lévő NGAL kimutatására és az akut vesesérülés diagnosztizálására

Absztrakt

1.Háttér

Az AKI a 2019-es Coronavirus Disease 2019 (COVID{1}}) betegek súlyos nemkívánatos kimenetelével és halálozásával kapcsolatos, ezért elengedhetetlen a korai diagnózis és a beavatkozás. A neutrofil zselatináz-asszociált lipocalin (NGAL) az egyik legígéretesebb biomarker az akut vesekárosodás (AKI) kimutatására, de a jelenlegi kimutatási módszerek nem megfelelőek, ezért gyorsabb, kényelmesebb és pontosabb módszerekre van szükség a NGAL kimutatására a korai diagnózis érdekében. az AKI-tól. Itt létrehoztunk egy gyors, megbízható és pontos laterális áramlási immunoassay-t (LFIA), amely európium nanorészecskéken (EU-NPS) alapul, az NGAL kimutatására emberi vizeletmintákban.

2. Módszerek

Kettős antitest szendvics immunfluoreszcens vizsgálatot alkalmaztunk európiummal adalékolt nanorészecskék felhasználásával, és az elektromos fúziós paraméterek optimalizálásával jelölőként NGAL monoklonális antitestek (MAbs) konjugátumot állítottunk elő. Nyolcvanhárom vizeletmintát használtunk a módszer klinikai alkalmazási hatékonyságának értékelésére.

3. Eredmények

Az NGAL kvantitatív kimutatási tartománya az AKI-ban {{0}} ng/mL, a detektálási szenzibilizáció pedig 0,36 ng/ml volt. Az intra-assay és az inter-assay variációs koefficiense (CV) 2.57-4.98 százalék és 4.11-7.83 százalék volt. Mindeközben az európium nanorészecskék alapú laterális fluoreszcens immunoassay (EU-NPS-LFIA) és az ARCHITECT analizátor közötti korrelációs együttható szignifikáns volt (R2=0.9829, n=83, p < 0,01).

4. Konklúziók

Így létrejött egy gyorsabb és egyszerűbb működésű kvantitatív NGAL-vizsgálat az AKI-re, ami nagyon fontos és értelmes a korai AKI diagnosztizálása szempontjából, ami arra utal, hogy az assay korai figyelmeztetést jelenthet a betegség kimenetelére.

Kulcsszavak

neutrofil zselatinázzal asszociált lipokalin (NGAL), monoklonális antitest, laterális áramlási immunoassay, akut vesekárosodás (AKI),Cistanche hatásai.

Kattintson ide, hogy megtudjamilyen előnyei vannak a Cistanche-nak

Bevezetés

A 2-es 019-es koronavírus-betegség (COVID-19) világszerte széles körben elterjedt, súlyos katasztrófákkal [1]. Az akut vesesérülés (AKI) magasabb megbetegedési és mortalitási arányt jelent a kritikus betegségek gyakori szövődményei között, és a kórházban kezelt betegek körülbelül 5-7 százaléka a világon[2].- Számos tanulmány értékelte az AKI kialakulását szorosan összefügg a COVID-19 rosszabb kimenetelével és halálozási arányával, ami leírja az AKI előfordulását, amely a COVID{11}} betegek körében 0,5-36,6 százalék között mozog[3]. Az AKI korai felismerése és pontos kezelése jobb megelőzési stratégiákat valósíthat meg, és megelőzheti a vesefunkció romlását és a veseelégtelenséget, hatékonyan megfékezve a COVID{13}} kórházban kezelt betegek progresszióját[4]. Közülük a neutrofil zselatinázzal asszociált lipocalint (NGAL) az egyik ígéretes biomarker jelöltként ismerték fel az AKI kimutatására. Az NGAL egy 25 kDa-os glikoprotein, amely a neutrofilekből származó zselatinázhoz kapcsolódik, és általában alacsonyabb szinten található meg az emberi szövetekben, például a gyomorban, a vastagbélben és a vesében, de expressziója drámaian megnövekszik a szérumban és a vizeletben, ha a vese ischaemiás vagy nefrotoxikus sérülést szenvedett. [5].

A laterális áramlási immunoassay-t (LFIA) egyszerűségük, in situ elemzésük és könnyű munkavégzésük miatt kívánatos szűrővizsgálatoknak tekintették[6]. A fluoreszcens mikrorészecskékkel rendelkező LFIA-t már alkalmazták különféle mikrobiális kórokozók és számos gyulladásmarker kimutatására[7, 8]. Általában számos új nanorészecskét alkalmaztak az LFIA érzékenységének javítására, beleértve a szén nanorészecskéket, kvantumpontokat, fluoreszcens festékeket, mágneses nanocímkéket és európium nanorészecskéket (EU-NPS)[9]. Az EU-NPS, mint hordozó, javíthatja az érzékenységi kontrasztot 100-szeresen az LFIA-ban jelölt kolloid arany nanorészecskékkel[10]. Az EU-NPS hosszú fluoreszcencia-élettartamú, és 75-100 nm-es átlagos részecskemérettel is elérhető, a nagy Stokes-eltolódás, amely általában 200 nm feletti, alkalmas a gerjesztőfény mérése által okozott szórt fény interferenciájának elkerülésére. Az EU-NPS-ek széles gerjesztési sávval rendelkeznek, ezért előnyös a gerjesztési energia, az éles emissziós csúcs, az alacsony háttér és a nagy felbontás növelése, amelyeket az orvosi diagnosztikában a közelmúltban használt szendvics típusú immunoassay-ben[11].

Itt egy új módszert hoztunk létre az EU-NPS-sel, mint az LFIA címkéivel a vizeletben lévő NGAL gyors, érzékeny és korai mérésére, a laboratóriumunk által felfedezett két monoklonális antitest (MAb) 1G1 és 2F4 alapján. A módszer egy kettős antitest szendvics immunfluoreszcens vizsgálat, EU-NPS és MAb konjugátum felhasználásával jelölőként. Az 1G1 mAb-t EU-NPS-sel konjugáltuk, és a 2F4 mAb-t használták az EU-NPS-1G1-antigén komplex befogására a T-vonalban. Eredményeink azt mutatták, hogy az EU-NPS-LFIA felhasználható az NGAL korai kimutatására a vizeletben, és lehetővé teszi az AKI-s betegek kezelésének javítását.

Cistanche tubulosa

Mód

1. NGAL kifejezése és tisztítása

A Genbankból származó humán NGAL génszekvenciát (NP{0}}.2) a Beijing Institute of Genomics (BGI) szintetizálta, és mindkét végéhez HindIII és XhoI restrikciós enzimeket adtak. A plazmidokat HindIII-mal és Xhol-gyel emésztettük, majd a pSecTag2A vektorba klónoztuk. A megszerkesztett plazmidokat mutáció nélkül szekvenáltuk, majd a LipofectamineTM2000 segítségével kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtekbe transzformáltuk. 8 nap elteltével a sejtfelülúszót 0,45 μm-es szűrő szűrése után összegyűjtöttük. Az expresszált NGAL-6×His fehérjét nikkel-nitrilo-triecetsav (Ni-NTA) oszlopon tisztítottuk, majd a különböző frakciókat összegyűjtöttük és nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) értékeltük. A bicinkoninsav (BCA) Protein Quantification Kit mérte a fehérje koncentrációját.

A tisztított rekombináns fehérjét 12%-os SDS-PAGE-nak vetettük alá, majd polivinilidén-fluorid (PVDF) membránra adszorbeáltuk. Miután a membránt 1 százalék Tween-20 (TBST) oldattal, 5 százalék fölözött tejet tartalmazó Tris pufferben szobahőmérsékleten (RT) 2 órán át blokkoltuk, majd HRP-konjugált anti-6×His címkével inkubáltuk. antitestet (1:5000) sötétben 1 órán át szobahőmérsékleten, benzidinnel tettük láthatóvá TBST-vel történő mosás után és Bio-Rad Western blotting detektáló rendszerrel (DNR Bio-Imaging Systems Ltd., Izrael).

2. MAb előállítása és tisztítása

Az első immunizálás során a nőstény BALB/c egereket (6 hetes életkor, összesen 10) 50 µg NGAL-6×His rekombináns fehérjével immunizáltuk azonos dózisban komplett Freund-adjuvánssal. és a kezdeti immunizálást inkomplett Freund-adjuvánsban emulgeált fehérjével végeztük. Két injekciós injekció az egerek hátára, majd az ezt követő intraperitoneális injekció 21 napos időközönként. A szérummintákat egy héttel a harmadik injekció után gyűjtöttük, és az antiszérum titerét indirekt enzim-linked immunosorbent assay-vel (ELISA) határoztuk meg[12]. Három nappal a fúzió előtt az egerek emlékeztető immunizálást végeztek 50 µg NGAL-6×His 0,9 százalékos NaCl-dal hígított oldatával.

Az izolált immun egerek lépsejtek és az SP2/0 mielómasejtek 3:1 arányban összekeverve egy platinaelektróda LF498-3 fúziós kamrában (BEX Co., Ltd, Japán) a leírtak szerint egyesülnek. az irodalomban[13]. Röviden, a kevert sejtet kétszer mostuk 10 ml elektrofúziós pufferrel (0,3 M mannit, 0,1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, pH). 7.2), és újraszuszpendáljuk 2 × 107 sejt/ml koncentrációban. A fúziót 50 V váltakozó áramú feszültséggel, 0,8 MHz-en 20 másodpercig, 450 V-os egyenáramú impulzusfeszültséggel, 2 ismétléssel 0,5 másodpercig, az utófúzió pedig 50 V-os 0,8 MHz-en keresztül fejezték be. 7 s. Végül az elektromosan kezelt sejtszuszpenziót a fúziós kamrából 4,5 ml előmelegített RPMI 1640-be (20%-os magzati szarvasmarha szérum) mozgattuk 30 percre 37 fokon, majd tenyésztettük 96-lyukú lemezeken, és 5 százalékos oldattal inkubáltuk. CO2 37 fokon. 24 óra elteltével minden lyukba hipoxantin-aminopterin-timidint (HAT) egészítettünk ki. A sejttenyészet felülúszóit ELISA-val szkríneltük 9 napos fúzió után, és a hibridóma klónok számított száma a következő volt. Az előzetesen paraffinolajjal injektált BALB/c egereket 1 × 106 NGAL hibridóma sejttel oltottuk be, az ascitest Protein A oszlopon tisztítottuk.

3. MAb-ok azonosítása

Az antitestek immunglobulin alosztályait az antitest alosztály azonosító kit segítségével elemeztük. Az indirekt ELISA a specifikus monoklonális ellenanyagokat tisztított rekombináns NGAL{{0}}×His fehérje és PCT- 6×His fehérje felhasználásával szűrte. Az antigén és az antitestek közötti kölcsönhatást a BIAcore T200 rendszerrel (GE Healthcare, Stockholm, Svédország) határoztuk meg HBS-EP pufferben (0,005% P20 felületaktív anyag, 10 mM Hepes, pH 7,4, 3 mM EDTA, 150 u. mM NaCl). Az NGAL antigént CM5 bioszenzor chipeken adszorbeálták, amelyek 400-480 válaszegységet (RU) értek el egy amin kapcsolókészlettel. Az antitesteket (2F4 és 1G1) HBS-EP pufferrel hígítottuk, lassan 50 µl/perc sebességgel engedtük át a chipen 5 percig, majd HBS-EP puffert injektáltunk a chipre, hogy 4 percig figyeljük a disszociációs fázist. . Az érzékelő chipeket glicin oldattal (pH 3,0) regeneráltuk a disszociációs fázist követően. A chipen áthaladó minden egyes analit esetében az antigénáramlási csatornából származó specifikus válaszok levonhatják a nem specifikus válaszokat a kontroll áramlási csatornából. Az illesztett telítési kötési görbéket az analit koncentrációja alapján ábrázoltuk az egyensúlyi kötési válaszokhoz a KD kiszámításához.

A tisztított anti-NGAL monoklonális antitesteket 12%-os SDS-PAGE-ban elemeztük nem redukáló és redukáló körülmények között. Röviden, a mintát összekevertük 5 x nem redukáló pufferrel vagy 5 x fehérjetöltő pufferrel, és 12%-os SDS-PAGE-ra töltöttük. Az anti-NGAL monoklonális ellenanyagok specificitását Western-blot segítségével határoztuk meg. A NGAL fehérjéket 12 százalékos SDS-PAGE-val végeztük, majd PVDF membránra adszorbeáltuk, amelyet 15 másodpercig metanolban áztatva aktiváltunk, majd 2 órán át 100 V-on elektroforézisnek vetettük alá. Miután 2 órán át szobahőmérsékleten blokkoltuk Tris-HCl pufferben 5% fölözött tejet tartalmazó 1% Tween-20 oldattal (TBST), majd a membránt egér anti-NGAL MAb-okkal inkubáltuk elsődleges antitestként 4 fokon. Másnap a membránt TBST-vel mostuk, és anti-egér konjugált HRP IgG-vel inkubáltuk sötétben 1,5 órán át szobahőmérsékleten. Végül a membránt a Western blot fokozott kemilumineszcenciájú detektáló rendszerrel (ECL) tettük láthatóvá.

4. Kompetitív enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatok (ELISA)

Két monoklonális ellenanyagot teszteltek, hogy képesek-e felismerni az NGAL egyedi epitópjait cELISA-val. A MAb-t HRP-vel konjugáltuk a HRP Antibody Labeling Kit (Shanghai YSRIBIO industrial co., LTD) segítségével, amelynek munkakoncentrációját közvetlen ELISA-val teszteltük. {{0}}lyuk A mikrotitráló lemezeket 2 µg/ml NGAL antigénnel vontuk be egy éjszakán át 4 fokon, majd a jelöletlen MAb-t (0,2 µg/lyuk, 2 µg/lyuk) kompetitív módon megkötöttük az optimális hígítási aránnyal. HRP-vel jelölt MAb, és 1 órán át 37 fokon inkubáltuk. Az enzimes reakció hidrogén-peroxiddal jelentkezett a 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidin (TMB) szubsztráttal, és 2 M kénsavval minden lyukba leállította. Az abszorbanciát (OD450 nm) Bio-Rad mikrolemez-leolvasóval (Bio-Rad Laboratories, Inc.) határoztuk meg. A monoklonális antitestek blokkoló hatását a következő egyenlettel számítottuk ki: 100×[1-OD_{450 nm}(HRP-MAb plusz MAb)/OD450 nm HRP-MAb]. Két MAb különböző epitópokat ismert fel, ha több mint 40 százalékban blokkoló hatást figyeltek meg.

Cistanche kivonat

5. EU-NPS konjugációja

Az 1G1 és 2F4 anti-NGAL monoklonális antitesteket kovalensen konjugáltuk EU-NPS-hez a Bangs Laboratories szabványos eljárásával. Röviden: 100 µL EUNPS-t adtunk 900 µL 0-hoz.05 M MES (pH 7.{{ 32}}) és ultrahanggal diszpergálva, 15 percig szobahőmérsékleten vibrálva {{40}},08 M ​​N-hidroxi-szulfoszukcinimid (NHS) és 0,05 M 1-({{19) }}Dimetilaminopropil)-3-etil-karbodiimid-hidroklorid (EDC). Az aktivált EUNPS-t kapcsolópufferrel (0,05 mM H3BO3, 0,04 mM Na2B407, pH 7,5) mostuk, és 0,3 mg antitesttel reagáltattuk 2,5 órán át szobahőmérsékleten. Az európiummal konjugált vegyületet 1000 µl blokkoló pufferben (10% BSA, 20% Tween{39}}, 0,05 M Tris-HCl) 1 órán át inkubáltuk, majd 1000 µl törzsoldathoz (10% BSA, 20% trehalóz) adtuk. százalékos tween-20, 0,05 M Tris-HCl) 4 fokon tárolandó.

6. Az LFIA fejlődése

Az LFIA csíkok nitrocellulóz membránból, konjugált betétből, mintapárnából és abszorbeáló betétből álltak. Az üvegszálas membránokat blokkoló pufferben (20% trehalóz, 10% BSA, 20% tween-20, 0,05 M Tris, 3,2 mM EDTA.Na2, pH 8,6) 1,5 órán át áztattuk. Az 1 mg/ml koncentrációjú MAb-ok (2F4 vagy 1G1) nitrocellulóz membrán tesztsorát (TL), és 1 mg/ml koncentrációjú kecske anti-egér IgG-t vontak be ugyanarra az NC membránra 4 mm távolságban. Minőségellenőrző vonalat (CL) képezve az adagoló műszer permetezési térfogatát 1 µl/cm-re állítottuk be. A membránt és az üvegszálas szőnyeget 48 órán át 45 fokon szárítottuk a tesztelés előtt. A különböző EU-NPS-1G1 és EU-NPS-2F4 konjugált részecskéket bevontuk a konjugátumpárnán, és a fluoreszcencia jelet immunfluoreszcens analizátorral (Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd.) mértük.

7. Vizeletminta gyűjtése és betegek

Összesen 83 emberi vizeletmintát gyűjtöttek AKI-betegektől a Jilin Orvosi Egyetem társkórházából. A kísérlet során szigorúan betartották az etikai irányelveket, és a Jilin Orvosi Egyetem Társult Kórháza (No.{1}}LW029) biztosította azokat. Valamennyi alany szóbeli és írásos beleegyezést kapott kínai nyelven a vizeletminták vizsgálatához. Minden kísérletet a Helsinki Etikai Elvek Nyilatkozata szerint végeztünk. A 62 éves betegek átlagos életkora 20 és 80 év között volt, akik nem voltak fertőzöttek COVID-vel-19, és az AKI 1–3. stádiumát a Kidney Disease Improving Global Outcomes AKI kritériumai szerint osztályozták[14]. Vizeletmintákat gyűjtöttünk NGAL-analízishez 12 órával az AKI diagnosztizálása előtt, és gyakori időközönként a műtét után különböző időpontokban (12, 24, 48 óra). A lehetséges zavaró tényezők minimalizálása érdekében a vizeletmintákat gyorsan elemezték a klinikai kémiai laboratóriumban, beleértve a vizelet biokémiáját is (összes fehérjekoncentráció < 1 g/dl, karbamid < 12 g/dl, glükóz < 1 g/dl, vizelet kreatinin < 1 g/dl , albumin < 2,5 g/dl, pH 4.5-9,0) és két párhuzamosban végeztük. A mintagyűjtést követő 30 percen belül 3000 fordulat/perc sebességgel, 4 fokon 15 percig centrifugáltuk. Legalább 100 µl felülúszót steril tartályokba adagoltunk, és -80 fokon tároltuk a további elemzésekhez, hogy elkerüljük az ismételt fagyasztási-olvasztási ciklusokat.

Az NGAL-szintek mérését egy ARCHITECT vizelet NGAL reagenskészlettel (Lisnamuck, Longford, Co. Longford, Írország) végeztük, nem kompetitív szendvics formátumot használva kemilumineszcens jelek detektálásával. A húgyúti NGAL-t egy gombaellenes antitest ismerte fel, amely kovalensen kapcsolódott paramágneses részecskéihez mikrorészecske-reagensben, és egy második anti-NGAL antitest konjugátuma, amely akridiniumhoz társult. A gyártó utasításait követve a kalibrációs vizsgálatot 0- 1500 ng/mL tartományban végeztük, és megmértük az NGAL koncentrációját.

8. Klinikai minták vizsgálata és elemzése

Az NGAL standard antigén sorozatkoncentrációit (10, 50, 100, 200, 400, 800, 1500, 2000 és 3000 ng/mL) FBS-sel készítettük a biokonjugátum specifikus reakcióinak erősítésére, mindegyik koncentráció három ismétlést végzett. Miután a klinikai mintákat a mintapárnákra helyeztük, a leolvasó rögzítette a fluoreszcencia intenzitás eredményeit a T vonalon (HT) és a C vonalon (HC). A kvantitatív kimutatást a HT/HC arány tette teljessé, hogy hatékonyan kiküszöbölje a csíkok (T és C) különbségeit és a matematikai minta standard mátrix hatásait[15]. A standard görbét az NGAL és a HT/HC arány minden egyes koncentrációjának függvényében ábrázoltuk.

9. Statisztikai elemzés

A Passing-Bablok regresszióanalízist és a BlandAltman diagramot a MedCalc és az SPSS 17.{2}} szoftver varianciaanalízisével (ANOVA) végeztük. Az összes adatot átlagértékként mutattuk be standard deviációval (átlag ± SD ).

Cistanche tabletták

Hivatkozások

1. Zheng X, Zhao Y, Yang L: Akut vesekárosodás a COVID-ban-19: A kínai tapasztalat. Seminars in Nephrology 2020, 40(5):430–442.

2. Mandelbaum T, Scott D, Lee J, Mark R, Malhotra A, Waikar S, Howell M, Talmor D: Akut vesekárosodásban szenvedő kritikus állapotú betegek kimenetele az Acute Kidney Injury Network kritériumai alapján. Critical care medicine 2011, 39(12): 2659–2664.

3. Al-Hwiesh A, Mohammed A, Elnokeety M, Al-Hwiesh A, Al-Audah N, Esam S, Abdul-Rahman I: Három COVID{5}} miatti akut vesekárosodásban szenvedő beteg sikeres kezelése peritoneális dialízissel : Esetismertetés és irodalmi áttekintés. Peritoneális dialízis nemzetközi 2020, 40(5):496–498.

4. Shabaka A, Rovirosa-Bigot S, Guerrero Márquez C, Alonso Riaño M, Fernández-Juárez G: Akut vesekárosodás és nefrotikus szindróma a COVID{3}}asszociált fokális szegmentális glomerulosclerosis következtében. Nefrologia 2021.

5. Gabbard W, Milbrandt E, Kellum J: NGAL: az AKI súlyosságának előrejelzésére szolgáló új eszköz klinikai vizsgálattal könnyen kimutatható. Critical Care 2010, 14(4): 318.

6. Zuk R, Ginsberg V, Houts T, Rabbie J, Merrick H, Ullman E, Fischer M, Sizto C, Stiso S, Litman D: Enzyme immunochromatography – kvantitatív immunoassay, amely nem igényel műszert. Clinical Chemistry 1985, 31(7): 1144–1150.

7. Juntunen E, Myyryläinen T, Salminen T, Soukka T, Pettersson K: Fluoreszcens europium(III) nanorészecskék és kolloid aranyriporterek teljesítménye oldalirányú áramlási bioaffinitási vizsgálatban. Analytical Biochemistry 2012, 428(1):31–38.

8. Swanson C, D'Andrea A: Laterális áramlási vizsgálat közeli infravörös festékkel multiplex kimutatáshoz. Clinical Chemistry 2013, 59(4):641–648.

9. Chen Y, Fu Q, Xie J, Wang H, Tang Y: Nagy érzékenységű kvantumpont-alapú fluoreszcens kioltó laterális áramlási vizsgálat kifejlesztése a zearalenon kimutatására. Analytical Bioanalytical Chemistry 2019, 411(10): 2169–2175.

10. Zhang F, Zou M, Chen Y, Li J, Wang Y, Qi X, Xue Q: Lantaniddal jelölt immunkromatográfiás csíkok a Pantoea stewartii subsp. Stewart. Biosensors bioelectronics 2014, 51:29–35.

11. Nankoberanyi S, Mbogo G, LeClair N, Conrad M, Tumwebaze P, Tukwasibwe S, Kamya M, Tappero J, Nsobya S, Rosenthal P. Ugandában. Malaria Journal 2014, 13:95.

12. Xu H, Dong Y, Guo J, Jiang X, Liu J, Xu S, Wang H: Monoklonális antitestek termelése és egy közvetett kompetitív enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat kifejlesztése a T-2 toxin szűrésére tejben. Toxicon 2018, 156:1–6.

Moli Yin1 , Yuanwang Nie2 , Hao Liu2 , Lei Liu1 , Lu Tang1 , Yuan Dong2 , Chuanmin Hu1 és Huiyan Wang1

1 Jilin Collaborative Innovation Center for Antibody Engineering, Jilin Medical University, 132013 Jilin, PR Kína.

2 Academy of Laboratory, Jilin Medical University, 132013 Jilin, PR Kína.