Ⅱ rész: Az autofágia szabályozásának mechanizmusa MPTP-indukált PD egerekben az echinakozid MTOR jelátviteli útvonalán keresztül
Mar 06, 2022
Kapcsolatfelvétel: emily.li@wecistanche.com
MPTP-indukált PD egerek neuroviselkedési tüneteinek javítása echinacosiddal
Az echinakozid lerövidítette a mászási időt MPTP-indukált PD egerekben
A T-turn és a T-Total az M csoportban észrevehetően hosszabb volt, mint az N csoportban (P < 0.01).="" a="" t-turn="" és="" t-total="" az="" eh="" csoportban="" szignifikánsan="" csökkent="" az="" m="" csoporthoz="" képest="" (p="">< 0.01).="" az="" eh="" csoporthoz="" és="" az="" m="" csoporthoz="" képest="" a="" fenti="" két="" index="" a="" cq="" csoportban="" és="" a="" wo="" csoportban="" szignifikánsan="" emelkedett="" (p="">< 0,01="" és="" p="">< 0,05).="" az="" eh-csoport="" és="" az="" ra-csoport="" összehasonlítása="" azt="" mutatta,="" hogy="" nincs="" szignifikáns="" különbség="" a="" t-turn="" és="" a="" t-total="" között="" (ahogy="" az="" 1a.="" ábrán="">
Az echinakozid jót tesz az egészségnek
Az echinakozid növelte a spontán aktivitást MPTP-indukált PD egerekben
Az öt percen belüli nevelési szám és a 30 percen belüli teljes távolság szignifikánsan csökkent az M csoportban az N csoporthoz képest (P < 0.01).="" a="" fenti="" két="" index="" szignifikánsan="" nőtt="" az="" eh="" csoportban="" és="" az="" ra="" csoportban="" az="" m="" csoporthoz="" képest="" (p="">< 0,01).="" az="" eh="" csoporthoz="" képest="" a="" nevelési="" szám="" és="" a="" teljes="" távolság="" szignifikánsan="" csökkent="" a="" cq="" csoportban="" és="" a="" wo="" csoportban="" (p="">< 0,01).="" a="" fenti="" két="" indexben="" nem="" volt="" statisztikailag="" szignifikáns="" különbség="" az="" eh-csoport="" és="" az="" ra-csoport="" között="" (p=""> 0,05) (az 1B. ábra szerint).
I. ábra Az egyes csoportok egereinek idegrendszeri viselkedése.
(A) A pólusteszt minden csoportba tartozó egereken∶ Fordulási idő (T-Tumn); Teljes tompítási idő (下Totl).
(B) A spontán aktivitás az egyes csoportok egereiben: Az erekciós idők öt percen belül (nevelési szám); A vízszintes mozgási távolság 30 percen belül (Total Distance).
(C) Az egyes csoportok egereinek járásanalízise: a mellső végtag lépéshossza; A hátsó végtag lépéshossza.
(D) A rotarod az egyes csoportok egereiben: A rotarodon való tartózkodási idő (más néven esési késleltetés).
Megjegyzések:*P<0.05,**p><0.0i, compared="" with="" the="" model=""><0.0l, compared="" with="" the="" high-dose="">echinakozidcsoport, n =6.
Az echinakozid megnyújtotta az elülső és a hátsó végtag lépéseit MPTP-indukált PD egerekben
Az elülső és hátsó végtag lépése szignifikánsan csökkent az M csoportban az N csoporthoz képest (P < {0}}.01).="" az="" elülső="" és="" hátsó="" végtag="" lépéshossza="" szignifikánsan="" nőtt="" az="" eh="" csoportban="" és="" az="" ra="" csoportban="" az="" m="" csoporthoz="" képest="" (p="">< 0,01).="" összehasonlítva="" az="" eh="" csoporttal="" és="" az="" m="" csoporttal,="" az="" elülső="" és="" a="" hátsó="" végtag="" lépései="" szignifikánsan="" csökkentek="" a="" cq="" és="" a="" wo="" csoportban="" (p="">< 0,01="" és="" p="">< 0,05).="" nem="" volt="" statisztikailag="" szignifikáns="" különbség="" az="" elülső="" és="" hátsó="" végtagok="" lépéseiben="" az="" eh-csoport="" és="" az="" ra-csoport="" között="" (az="" 1c.="" ábra="">
Az echinakozid meghosszabbította a késleltetést az MPTP-indukált PD egerekben
A rotarodon való tartózkodási idő, más néven az esés késleltetése, szignifikánsan csökkent az M csoportban az N csoporthoz képest (P < {0}}.01).="" a="" csökkenés="" látenciája="" szignifikánsan="" nőtt="" az="" eh-csoportban="" és="" az="" ra-csoportban="" az="" m-csoporthoz="" képest="" (p="">< 0.01).="" a="" csökkenés="" késleltetése="" szignifikánsan="" csökkent="" a="" cq="" csoportban="" és="" a="" wo="" csoportban="" (p="">< 0,01="" és="" p="">< 0,05)="" az="" eh="" csoporthoz="" és="" az="" m="" csoporthoz="" képest.="" az="" eh-csoport="" és="" az="" ra-csoport="" között="" nem="" volt="" statisztikailag="" szignifikáns="" különbség="" az="" esés="" latenciájában="" (p=""> 0,05) (az 1D. ábra szerint).
Echinakozidjót tesz az egészségnek
Az echinakozid növelte a DA és a metabolitok tartalmát a striatumban MPTP-indukált PD egerekben
Az N csoporthoz képest az M csoportban a DA, DOPAC és HVA tartalma szignifikánsan csökkent (P < {0}}.01).="" a="" da,="" dopac="" és="" hva="" tartalma="" szignifikánsan="" megemelkedett="" az="" eh="" csoportban="" és="" az="" ra="" csoportban="" az="" m="" csoporthoz="" képest="" (p="">< 0.01).="" az="" eh="" csoporthoz="" és="" az="" m="" csoporthoz="" képest="" a="" da,="" dopac="" és="" hva="" tartalma="" szignifikánsan="" csökkent="" a="" cq="" és="" a="" wo="" csoportban="" (p="">< 0.01="" és="" p="">< 0,05)="" .="" nem="" volt="" statisztikailag="" szignifikáns="" különbség="" a="" da,="" dopac="" és="" hva="" tartalmában="" az="" eh-csoport="" és="" az="" ra-csoport="" között="" (p=""> 0,05) (ahogy a 2A–C. ábrán látható). Az N csoporthoz képest a 5-HT tartalom szignifikánsan csökkent az M csoportban (P < 0,01),="" és="" a="" 5-ht="" tartalom="" az="" eh="" csoportban="" szignifikánsan="" nőtt="" (p="">< 0,01).="" az="" eh="" csoporthoz="" képest="" a="" 5-ht="" tartalom="" szignifikánsan="" csökkent="" a="" cq="" csoportban="" és="" a="" wo="" csoportban="">< 0.01)="" (as="" demonstrated="" in="" figure="">
2. ábra A striatum neurotranszmitter tartalmának kimutatása a nagy teljesítményű folyadékfázisú elektrokémiai módszerrel (HPLC-ECD).
(A) Dopamin (DA):
(B) dihidroxi-fenil-ecetsav (DOPAC);
(C) homovanillinsav (HVA);
(D) 5-hidroxi-triptamin (5-HT).
Megjegyzések:*P < 0.05.*P<00 i.="" compared="" with="" the="" model="" group;=""><><001.compared with="" the="" high-dose="">echinakozidcsoport
Az echinakozid növelte a TH expresszióját a Substantia Nigrában és csökkentette a -synuclein expresszióját PD egerekben
Először kettős immunfluoreszcens festést végeztünk TH és -synuklein esetében. Az N csoporthoz képest a TH expressziója a substantia nigrában szignifikánsan csökkent az M csoportban, míg a -synuclein expressziója szignifikánsan nőtt. Az M csoporthoz képest azonban a szinuklein expressziója szignifikánsan csökkent az EH csoportban és az RA csoportban. A -synuclein expressziója szignifikánsan megemelkedett a CQ csoportban és a WO csoportban, ami még magasabb volt, mint az M csoportban (amint azt a 3. ábra mutatja).
3. ábra: TH és a-synuclein kettős immunfluoreszcens festődése a jelentős nigrában az egyes csoportok egereiben.
Az ábra a tirozin-hidroxiláz (TH) immunfluoreszcens kettős festődését mutatja.
-synuclein a substantia nigrában minden n csoportba tartozó egerekben =6
a fluoreszcens mikroszkóp nagyítása: 200×.TH zöld fluoreszcenciával lett kivérezve,
A 2. a-tanuló vörös fluoreszcenciával vérzett, a kék DAPI az aktokat ábrázolta.
A zöld 2. piros átfedése a kétszeresen festett pozitív sejt (sárga).
Ezután Western blot-ot alkalmaztak a fenti két mutató mérésére. Az eredmények azt mutatták, hogy a TH fehérje expressziója az M csoportban szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az N csoportban (P < {0}}.01).="" a="" th="" fehérje="" expressziója="" az="" eh="" csoportban="" és="" az="" ra="" csoportban="" szignifikánsan="" megemelkedett="" az="" m="" csoporthoz="" képest="" (p="">< 0.{{10}}1).="" a="" th="" fehérje="" expressziója="" a="" cq="" csoportban="" és="" a="" wo="" csoportban="" szignifikánsan="" csökkent="" az="" eh="" csoporthoz="" képest="" (p="">< 0,01).="" a="" -synuclein="" fehérje="" expressziója="" az="" m="" csoportban="" szintén="" növekedett="" az="" n="" csoporthoz="" képest="" (p="">< 0,01).="" a="" -synuclein="" fehérje="" expressziója="" azonban="" az="" eh="" csoportban="" és="" az="" ra="" csoportban="" szignifikánsan="" csökkent="" az="" m="" csoporthoz="" képest,="" és="" a="" különbségek="" statisztikailag="" szignifikánsak="" voltak="" (p="">< 0,01).="" az="" eh="" csoporthoz="" és="" az="" m="" csoporthoz="" képest="" a="" -synuclein="" fehérje="" expressziója="" a="" cq="" csoportban="" és="" a="" wo="" csoportban="" szignifikánsan="" nőtt,="" és="" a="" különbségek="" statisztikailag="" szignifikánsak="" voltak="" (p="">< 0,01)="" (ahogy="" a="" 4.="" ábrán="">
4. ábra A TH és -synuclein fehérje expressziójának változásai a jelentős nigrában az egyes csoportok egereiben.
Megjegyzések∶甲P<><00i,compared with="" the="" model="" group;=""><><00i,compared with="" the="" high-dose="">echinakozidn=6 csoport.
Az echinakozid csökkentette a P62 expresszióját a Substantia Nigrában MPTP-indukált PD egerekben
Először Western-blotot alkalmaztak a P62 fehérje expressziójának kimutatására. Az eredmények azt mutatták, hogy a P62 fehérje expressziója az M csoportban észrevehetően nőtt az N csoporthoz képest (P < 0.01).="" a="" p62="" fehérje="" expressziója="" az="" eh="" csoportban="" és="" az="" ra="" csoportban="" észrevehetően="" csökkent="" az="" m="" csoporthoz="" képest,="" és="" a="" különbségek="" statisztikailag="" szignifikánsak="" voltak="" (p="">< 0,01).="" az="" eh="" csoporttal="" összehasonlítva="" a="" p62="" fehérje="" expressziója="" a="" cq="" csoportban="" és="" a="" wo="" csoportban="" észrevehetően="" nőtt="" (p="">< 0,01)="" (ahogy="" az="" 5c.="" ábrán="" látható).="" ezután="" immunfluoreszcens="" festést="" végeztünk="" a="" p62="" és="" a="" dapi="" esetében.="" megállapították,="" hogy="" az="" n="" csoporthoz="" képest="" a="" substantia="" nigrában="" a="" p62="" kifejezettebben="" nőtt="" az="" m="" csoportban,="" a="" p62="" expressziója="" csökkent="" az="" eh="" csoportban="" és="" az="" ra="" csoportban,="" és="" a="" p62="" expressziója="" nőtt="" a="" cq="" csoportban="" és="" a="" wo-ban.="" csoport="" (az="" 5d.="" ábra="">
5. ábra: A Becin I, LC3ll P62 és P62 immunfluoreszcens festődés fehérje expressziójának változása a substantia nigrában az egyes csoportok egereiben.
Megjegyzések:*P<><00l, compared="" with="" the="" model=""><>< 0.0i,="" compared="" with="" the="" high-dose="">echinakozidcsoport
A fluoreszcencia mikroszkóp nagyítása: 200×.P62 piros fluoreszcenciával volt jelölve. A kék DAPI az aktot, n= 6 jelképezi.
Az echinakozid növelte a Beclin 1 és LC3II expresszióját a Substantia Nigrában MPTP-indukált PD egerekben
Először Western-blotot alkalmaztunk a Beclin 1 fehérje expressziójának meghatározására a substantia nigrában az egyes csoportok egereiben. Azt találtuk, hogy a Beclin 1 fehérje expressziója az M csoportban szignifikánsan megnőtt az N csoporthoz képest (P < 0.01).="" azonban="" a="" beclin="" 1="" fehérje="" expressziójának="" növekedése="" az="" eh-csoportban="" és="" az="" ra-csoportban="" nyilvánvalóbb="" volt="" (p="">< 0,01).="" az="" eh="" csoporthoz="" és="" az="" m="" csoporthoz="" képest="" a="" beclin="" 1="" fehérje="" expressziója="" a="" cq="" csoportban="" és="" a="" wo="" csoportban="" szignifikánsan="" csökkent,="" és="" a="" különbségek="" statisztikailag="" szignifikánsak="" voltak="" (p="">< 0,01)="" (amint="" az="" 5a.="" ábrán="">
Mivel az LC3 az autofágia kulcsmutatója, kettős festést végeztek a TH és az LC3 esetében. Az eredmények azt mutatták, hogy az LC3 pozitív sejtek száma az M csoportban szignifikánsan megnőtt az N csoporthoz képest. Az LC3 pozitív sejtek száma az EH csoportban és az RA csoportban szignifikánsan nőtt, mint az M csoportban. Az autofágia-gátló alkalmazásakor azonban a WO csoportban az LC3 pozitív sejtek száma szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az M csoportban, míg az LC3 pozitív sejtek száma nem csökkent szignifikánsan a CQ csoportban (ahogy a 6. ábrán látható). . Ezután Western-blotot alkalmaztunk az LC3 fehérje expressziójának kimutatására a substantia nigrában az egyes csoportok egereiben. Az eredmények azt mutatták, hogy az LC3II fehérje expressziója az M csoportban szignifikánsan megnövekedett az N csoporthoz képest (P < 0.01).="" az="" lc3ii="" fehérje="" expressziója="" az="" eh-csoportban,="" az="" ra-csoportban="" és="" a="" cq-csoportban="" mind="" szignifikánsan="" növekedett="" az="" m-csoporthoz="" képest="" (p="">< 0.01).="" a="" wo="" csoportban="" az="" lc3ii="" fehérje="" expressziója="" csökkent="" az="" eh="" csoporthoz="" és="" az="" m="" csoporthoz="" képest,="" és="" a="" különbségek="" statisztikailag="" szignifikánsak="" voltak="" (p="">< 0,01,="" illetve="" p="">< 0,05)="" (amint="" azt="" az="" 5b.="" ábra="">
Echinakozidgyógyulásra jóth
A Substantia Nigra ultrastruktúrájának és az autofagoszómáknak transzmissziós elektronmikroszkóppal megfigyelt változásai
A substantia nigra ultrastruktúrájának megfigyelése során azt találták, hogy az N csoport kivételével az egerek különböző mértékű substantia nigra ultrastruktúrális sérülést mutattak, ami mitokondriumok duzzanatában, durva endoplazmatikus retikulum kitágulásában, Golgi expanziójában, lizoszómák, és kettős membrán szerkezetű autofagoszómák kialakulása. Az autofagoszómák száma az EH-csoportban, az RA-csoportban és a CQ-csoportban szignifikánsan nőtt a többi csoporthoz képest. Az autofagoszómák száma a CQ csoportban magasabb volt, mint az M csoportban, ami összhangban volt az LC3II fehérje expressziójának növekedésével a fluoreszcens kettős festés és a Western blot során. Azt is feltételezte, hogy az LC3II és az autofagoszómák száma bizonyos mértékig korrelált. Nem volt nyilvánvaló növekedés az autofagoszómák számában a WO csoportban, ami arra utal, hogy ebben a csoportban az autofágia növekedésétechinakozidgátolt volt (amint azt a 7. ábra mutatja).
7. ábra Az ultrastrukturális változások és az autofagoszóma kialakulása a jelentős nigrában az egyes csoportok egereiben.
(A) A normál sóoldat kontroll csoport, a substantia nigra normál szerkezetével;
(B) a modellcsoport, a mitokondrium duzzanatával, az endoplazmatikus retikulum durva expanziójával, valamint a lizoszóma és autofagoszóma képződésével:
(C és D) aechinakozidmunka. viszonylag több lizoszóma és autofagoszóma képződéssel:
(E) a rapamicin csoport, a mitokondriumok duzzadásának megnyilvánulásaival, valamint lizoszóma és autofagoszóma képződésével;
(F) a klorokin csoport, a mitokondriumok duzzadásával, valamint lizoszóma és autofagoszóma képződésével:
(G és H) a wortmannin csoport. észrevehetően duzzadt mitokondriumokkal, kitágult rouch edopbs mik reticulummal
(G) és a mitokondriumok duzzanata2. a durva endoplazmatikus retikulum expanziója, a Gds nyilvánvaló kiterjedése és a mysosomes növekedése.
Az echinakozid hatása az AKT és mTOR fehérje expressziójára a Substantia Nigrában MPTP-indukált PD egerekben
Western blotot használtunk az AKT és mTOR fehérje expressziójának kimutatására minden csoportban. Az eredmények azt mutatták, hogy az N csoporthoz képest a p-AKT/AKT fehérje expressziója észrevehetően csökkent az M csoportban (P < 0.01).="" a="" p-akt/akt="" fehérje="" expressziója="" az="" eh="" csoportban="" és="" az="" ra="" csoportban="" észrevehetően="" nőtt="" az="" m="" csoporthoz="" képest="" (p="">< 0.{{10}}1),="" és="" a="" fehérje="" expressziója="" a="" p-akt/akt="" az="" eh="" csoportban="" magasabb="" volt,="" mint="" az="" ra="" csoportban="" (p="">< 0.01).="" az="" eh="" csoporttal="" összehasonlítva="" a="" p-akt/akt="" fehérje="" expressziója="" a="" cq="" csoportban="" és="" a="" wo="" csoportban="" észrevehetően="" csökkent="" (p="">< 0,01)="" (amint="" a="" 8.="" ábrán="" látható).="" azt="" is="" megállapították,="" hogy="" a="" p-mtor/mtor="" fehérje="" expressziója="" az="" m="" csoportban="" valamivel="" alacsonyabb="" volt,="" mint="" az="" n="" csoportban="" (p="">< 0,05),="" de="" a="" p-mtor/mtor="" fehérje="" expressziójának="" csökkenése="" szignifikánsabb="" volt="" az="" eh="" csoport="" és="" az="" ra="" csoport,="" mint="" az="" m="" csoportban="" (p="">< 0,01).="" az="" eh="" csoporthoz="" képest="" a="" p-mtor/mtor="" fehérje="" expressziója="" nőtt="" a="" cq="" csoportban="" és="" a="" wo="" csoportban="" (p="">< 0,01)="" (amint="" azt="" a="" 8.="" ábra="" alsó="" része="">
8. ábra Az AKT és mTOR fehérje expressziójának változása a jelentős nigrában az egyes csoportok egereiben.
Megjegyzések: *P < {{0}},05,="" **p="">< 0,01,="" összehasonlítva="" a="" modellcsoporttal;="">< 0.01,="" compared="" with="" the="" high-dose="">echinakozidcsoport, n= 6.
Echinakozidgyógyulásra jóth
Ⅲ RÉSZÉHEZ KATTINTSON IDE
