Első rész|Az NF-κB gátlója és az AMPK agonistája: Hálózati előrejelzés és multi-Omics integráció az Alzheimer-kór elleni akteozid jelzési útvonalainak kialakításához

Első rész|Acteosides: hogyan kezeljük az Alzheimer-kórt, mint a Cistanche egyik hatékony összetevőjét?

Ying-Qi Li1†, Yi Chen1†, Si-Qi Jiang1, Yuan-Yuan Shi2, Xiao-Li Jiang1, Shan-Shan Wu1, Ping Zhou1, Hui-Ying Wang1, Ping Li1* és Fei Li1,2 * 1 állapotkulcs Laboratory of Natural Medicines, Kínai Gyógyszerészeti Egyetem, Nanjing, Kína, 2 College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi, Kína

Az Alzheimer-kór (AD) a demencia leggyakoribb típusa.Acteozid (TÖRVÉNY) egy vegyület, amelyből izoláltCistanche tubulosa, amely kiváló neuroprotektív tulajdonságokkal rendelkezik. Azonban a mögöttes mechanizmusTÖRVÉNYA mikroglia polarizációjának szabályozása továbbra is rosszul definiált. Ezért egy számítógépes hálózati modellt hoztak létre a hajtócélok azonosításáraTÖRVÉNYés több rendelkezésre álló adatbázis integrálásával megjósolni annak mechanizmusát. Az AlCl3-indukált AD modellt zebradán lárvákban sikeresen létrehozták az ACT terápiás hatékonyságának demonstrálására. Ezt követően az LPS-indukált BV-2 sejtek feltárták az ACT pozitív szerepét az M1/M2 polarizációban. Az NF-κB és AMPK útvonalakat tovább erősítették transzkriptomikai analízissel, metabolomikai analízissel, molekuláris biológiai technikákkal és molekuláris dokkolással. A kutatás bemutatta az ACT infúziós mechanizmusát, és feltárta az anyagcsere és a mikroglia polarizáció közötti összefüggést a mitokondriális működés szempontjából. Ennél is fontosabb, hogy szisztematikus és átfogó megközelítést biztosított a gyógyszercélpontok felfedezéséhez, beleértve a génekben, metabolitokban és fehérjékben bekövetkező változásokat.

Kulcsszavak: akteozid, BV-2 sejtek, anyagcsere, RNS-seq, mitokondriumok, ideggyulladás

További információért forduljon: ali.ma@wecistanche.com

Kattintson a Cistanche DHT elemre a memóriaért

BEVEZETÉS

A népesség elöregedésével és gyors növekedésével a világban a demenciás esetek száma emelkedő tendenciát mutat.Alzheimer kórAz (AD) egy gyakori neurodegeneratív betegség, amelyet kognitív károsodás és diszkinézia kísér (Perea et al., 2020), amely a demencia leggyakoribb típusa. Súlyos neuronveszteség, szenilis plakkok és neurofibrilláris gubancok jellemzik (Shiao et al., 2017). A patogenezis aAlzheimer kórtöbbdimenziós, és a neuroinflammációhoz kapcsolódik. A neurogyulladás hátterében a gliasejtek aktiválódása áll, ami szorosan összefügg az AD előfordulásával és kialakulásával (Hanslik és Ulland, 2020; Linnerbauer és Rothhammer, 2020). A neuroinflammáció progressziója és exacerbációja során a mikroglia kulcsfontosságú tényezőnek számít. A mikrogliák a központi idegrendszer elsődleges immunsejtjei, amelyek szorosan kapcsolódnak olyan folyamatok kaszkádjához, mint az agy fejlődése, az idegi környezet fenntartása, valamint a sérülésekre és javításokra adott válaszok (Perea et al., 2020). Ezenkívül a mikroglia M1 fenotípusra stimulálható, és növelheti a gyulladást elősegítő citokinek expresszióját, ha neuroinflammációval kapcsolatos betegségek, például AD fordul elő (Tsukahara et al., 2020). Tanulmányok azt is kimutatták, hogy az M1 fenotípusra való polarizációt gyakran anyagcserezavarok kísérik (Li L. et al., 2020), ami energia-anyagcsere-egyensúly- és mitokondriális diszfunkcióhoz vezet (Agrawal és Jha, 2020). Ezek a káros változások a neurodegenerációból, sőt az Alzheimer-kórból erednek.

Akteozid (ACT), a feniletanoid glikozid, elsősorban abból származikCistanche tubulosa. Egyre több bizonyíték utal arra, hogy az ACT számos farmakológiai hatással rendelkezik, beleértveneuroprotektív(Wei et al., 2019),gyulladáscsökkentő(Lai et al., 2019), illantioxidáns(Ji et al., 2019) hatását. Különösen bebizonyosodott, hogy az Acteoside képesjavítja a tanulást és a memóriátrontja, valamint szabályozza az energia-anyagcserét streptozotocinnal indukált patkányokban (Chen J. et al., 2020). Ezenkívül gátolja a neuronális apoptotikus sejthalált és a mitokondriális károsodást kísérleti autoimmun encephalomyelitises egerekben (Li W. et al., 2020). Azonban az ACT hatásáról a mikroglia M1/M2 polarizációjára és annak mechanizmusára ritkán számolnak be. Ez idáig az olyan mechanizmusok, mint a mitokondriumok működésének helyreállítása és a sejtanyagcsere szabályozása nem tisztázottak, és további tudományos kutatások szükségesek a pontos mechanizmus tisztázásához.

Jelen jelentés célja, hogy megvizsgálja az ACT terápiás hatékonyságát, valamint az ACT mögöttes molekuláris mechanizmusát az AD-re. Ebben az összevont adatbázisok alapján szisztematikus in silico módszert hozunk létre a gyógyszercélpont azonosításra. Tovább vizsgáljuk az ACT lehetséges mechanizmusait molekuláris biológiai szinten az RNS-szekvenálás (RNA-seq) metabolomikai módszerekkel és molekuláris biológiai technikákkal történő integrálásával. Az in silico, in vivo és in vitro szisztematikus szűrési stratégiák kombinációja új protokollt biztosít a hagyományos kínai orvoslás többcélú vegyületeinek objektív felfedezésére.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Hálózati modellezés

Négy online platformot kombináltak a célpontok előrejelzésére és felfedezéséreActeozid, nevezetesen a GeneCards1, a hasonlósági ensemble megközelítés (SEA2), a SwissTargetPrediction3 és a PharmMapper4. Az AD összes génasszociációját egymástól függetlenül gyűjtöttük össze a DisGeNET5-ből és a GeneCards-ból. A String adatbázissal6 végzett cél-cél interakcióelemzés után a hálózatot a Cytoscape (3.8.2-es verzió) szoftverrel tovább integrálták. A GO és KEGG dúsítási analízist a DAVID adatbázison7 végezték el a hálózat megjegyzéseihez és bányászásához.

Állatok és modellek csoportosítása

Ebben a vizsgálatban a vad típusú zebrahalat (AB törzs, 4 hónapos) választottuk (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). 14/10-órás fény/sötét ciklus alatt tartották őket 28°C-on, az előző módszert követve (Li YQ et al., 2020). Az összes zebrahal-kísérletet a Kínai Gyógyszerészeti Egyetem Állat-etikai Bizottságának felügyelete alatt végezték. A zebrahal lárvákat hat csoportra osztották, és a megtermékenyítés utáni 3 nappal (dpf) 7 dpf-ig kezelték: kontrollcsoport, modellcsoport, modell plusz donepezil-hidroklorid (DPZ, Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.) csoport, és modell pluszActeozid(HPLC tisztaság 98 százalék vagy annál nagyobb, Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.) csoportok. A kontrollcsoportot 0,2 százalék DMSO-t tartalmazó tápközegben tartottuk, a modellcsoportot pedig 150 µM AlCl3-mal (pH 5,8) kezeltük. A modell plusz DPZ csoportot AlCl3-mal és 8 µM DPZ-vel együtt kezeltük. A modell pluszActeozidA csoportokat AlCl3-mal és különböző koncentrációjú ACT-vel (200, 100 és 50 µM) együtt kezeltük.

Viselkedési elemzés

A zebrahal lárvák mozgását ViewPoint viselkedéselemzővel (Zebralab, 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) rögzítettük 28 ◦C-on. Röviden, a viselkedési paraméterek és az eredmények feldolgozása összhangban volt az általunk korábban kialakított módszerrel (Li YQ et al., 2020). Itt az átlagos sebességet (AS), a sebességváltozást (1S), a diszkinézia felépülési arányát (DRR) és a válasz hatékonyságát (RE, százalék) választottuk ki a zebradániában tapasztalható diszkinézia felépülésének értékelésére.

Az acetil-kolinészteráz és a kolin-acetil-transzferáz aktivitás meghatározása

3-7 dpf kezelés után zebrahal lárvákat gyűjtöttünk az acetilkolinészteráz (AChE) és kolin-acetiltranszferáz (ChAT) aktivitásának mérésére. A gyártó protokollja alapján az aktivitást az enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) kitekkel (MLBIO Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Kína) mutatták ki.

Sejttenyészetek és kezelések

A BV-2 sejtvonalat az American Type Culture Collection-től (ATCC, Manassas, VA, Egyesült Államok) vásároltuk. DMEM-ben (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Kína) tenyésztettük. A táptalajt 10% FBS-sel (Gibco, Grand Island, NY, Egyesült Államok), 100 U/ml penicillinnel és 100 mg/ml sztreptomicinnel egészítettük ki, 95% levegő/5% CO2-val 37 °C-on. A BV{8}} sejteket ACT-vel (50, 25 és 12,5 µM) inkubáltuk, vagy lipopoliszachariddal (LPS, 1 µg/ml; Sigma Aldrich, St Louis, MO, Egyesült Államok) stimuláltuk 24 órán keresztül. A sejteket fordított mikroszkóp alatt figyeltük meg (Nikon ECLIPSE Ti2, Japán).

Sejtéletképességi vizsgálat

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) tesztet (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kína) használtunk a sejtek életképességének értékelésére. Röviden, az abszorbanciát 450 nm-en mértük mikrolemez-leolvasóval (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, Egyesült Államok).

Nitrogén-oxid termelési vizsgálat

A nitrogén-oxidot (NO) a BV-2 tenyészet felülúszójának nitritszintjének Griess-reagens segítségével történő mérésével határoztuk meg. Röviden, a táptalajt (100 µl) egy új 96-lyukú lemezre vittük át, minden lyukba ugyanannyi Griess-reagenst adtunk, és 15 percig sötétben reagáltattuk. Az abszorpciót 540 nm-en Microplate Reader készülékkel határoztuk meg.

Gyulladásos citokinek szintje a felülúszóban

A TNF-, IL-1 és IL-10 koncentrációját a BV-2 sejtfelülúszóban ELISA kittel határoztuk meg a gyártó utasításai szerint.

A sejtmetabolizmus meghatározása HPLC-Q-TOF-MS analízissel

A BV{{0}} sejteket egy hatlyukú edénybe külön-külön oltottuk be (n=6/csoport). A kezelés után a tápközeget eltávolítottuk, és a sejteket háromszor mostuk hideg PBS-sel. Ezután azonnal folyékony nitrogénnek tették ki őket, hogy elnyomják a sejtanyagcserét. A sejteket 8{{30}} százalékos hideg metanollal gyűjtöttük be. A fehérjekicsapódás megkönnyítése érdekében a sejteket erőteljesen vortexeltük 1 percig, és 13, 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk (15 perc, 4 °C). A sejtszuszpenziót nitrogénáram alatt szárítottuk. A szárított maradékot 15 0 µl előhűtött 25%-os acetonitrilben oldottuk fel. A szekvenciaanalízis stabilitásának és pontosságának biztosítása érdekében minden azonos térfogatú (10 µl) sejtmintát minőség-ellenőrző mintaként egyesítettünk. A metabolitok kimutatása során ezeket a mintákat minden hatodik minta után injektálták stabilitásuk megerősítésére. A HPLC-Q-TOF-MS vizsgálathoz egy 1-µl-es alikvot részt injektáltunk. Az analízist Agilent 1290 HPLC rendszeren végeztük, amely az Agilent 6530 Quadrupol Time-of-Flight (Q-TOF) tömegspektrométerhez volt csatlakoztatva (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Egyesült Államok). Az elválasztást ACQUITY UPLC BEH C18 oszlopon (2,1 perc × 100 mm, 1,7 µm) végeztük. A mozgófázis 0,1% hangyasav-víz (v/v; A) és acetonitril (B) elegyből állt. A társsebességet 0,4 ml/perc értékre állítottuk be a következő optimális gradienselúciós feltételek mellett: 0-2 perc, 5% B; 2-20 perc, 5-95 százalék B (pozitív ion üzemmód); 0-2 perc, 5% B; 2-20 perc, 5-95 százalék B (negatív ion mód). A tömegspektrométer működési paramétereit a következőképpen állítottuk be: gázhőmérséklet, 320◦C; szárítógáz, 10 l/perc; porlasztó, 35 psi; VCap, 4, 000 V; fragment, 120 V. A nyers adatokat a MassHunter Workstation Software B.07.00 verziójával (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Egyesült Államok) kezeltük. A nyers adatokat az XCMS platform előfeldolgozta. A normalizált adatok főkomponens-analízisét (PCA) és részleges legkisebb négyzetek diszkriminancia analízisét (PLS-DA) a MetaboAnalyst8 segítségével végeztük. Az irodalommal kombinálva a különböző metabolitokat (VIP > 1, t-teszt p < 0,05)="" azonosították="" a="" hmdb9-en.="" végül="" az="" útvonalelemzést="" a="" metaboanalyst="" segítségével="">

A mitokondriális membránpotenciál mérése

A mitokondriális membránpotenciált (MMP) a JC-1 FL fluoreszcens szondával (Beyotime, Kína) detektáltuk a gyártó utasításainak megfelelően. Röviden, a különböző csoportokból származó sejteket PBS-sel öblítettük, és JC-1 festőoldattal inkubáltuk 20 percig 37 °C-on. A festés után a sejteket kétszer mostuk festőpufferrel. Ezután az FL fluoreszcens jeleket társcitometriával (BD Accuri C6) detektáltuk.

Mitokondriális adenozin-50 -trifoszfát mérése

Az adenozin 50 -trifoszfát (ATP) koncentrációját a mitokondriumokban egy ATP Assay Kit (Beyotime, Kína) segítségével mutatták ki. Röviden, a különböző csoportokból származó BV-2 sejtek tápközegét eldobtuk, és a sejteket jégen lízispufferrel homogenizáltuk. A centrifugálás után kapott felülúszót (12, 000 g, 5 perc) használtuk az ATP-koncentráció meghatározására. A lumineszcenciát EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer) segítségével detektáltuk.

Az intracelluláris reaktív oxigén fajok szintjének mérése

Reaktív oxigénfajták (ROS) Assay Kit (Beyotime, Kína) segítségével mértük a ROS-szinteket. A különböző csoportokból származó sejteket DCFH-DA-val (10 µM) 20 percig 37°C-on inkubáltuk. A próba betöltése után a sejteket háromszor mostuk DMEM-mel. Ezután az FL fluoreszcens jeleket társcitometriával (BD Accuri C6) detektáltuk.

Transzmissziós elektronmikroszkópia

A BV-2 sejteket hatlyukú edénybe oltottuk. A tápközeget eltávolítjuk, és gyorsan 1 ml 2,5%-os glutáraldehidet adunk minden egyes lyukba. Ezután a sejteket összegyűjtöttük és új 2,5 százalékos glutáraldehiddel fixáltuk 4 °C-on egy éjszakán át. Rögzítés, dehidratálás és beágyazódás után a sejteket HT7800 transzmissziós elektronmikroszkóppal (Hitachi, Tokió, Japán) figyeltük meg.

RNA-Seq és bioinformatikai adatelemzés

A BV{0}} sejtekből a teljes RNS-t Trizol reagenssel (Vazyme Biotech, Kína) extraháltuk. Az összes analitikai mintát elküldtük Majorbio-nak (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) az RNS-szekvencia vizsgálathoz. Az adatok elemzése a Majorbio Cloud Platform10 online platformján történt. Az RSEM11-et a génbőség számszerűsítésére használták. Lényegében differenciált kifejezés

az elemzést a DESeq2/DEGseq/EdgeR segítségével végeztük, ahol a Q érték kisebb vagy egyenlő, mint 0.05; DEG|log2FC| > 1 és Q érték Kisebb vagy egyenlő, mint 0.05 (DESeq2 vagy EdgeR)/Q érték A 0,001-nél kisebb vagy egyenlő (DEGseq) értéket szignifikánsan eltérő expresszált géneknek tekintették. Ezenkívül funkcionális dúsítási elemzéseket végeztek, beleértve a GO-t és a KEGG-t, hogy azonosítsák, mely DEG-k dúsultak fel szignifikánsan a GO kifejezésekben és útvonalakban a Bonferroni-korrigált p-érték 0,05-nél kisebb vagy azzal egyenlő a teljes transzkriptom háttérhez képest. Az eredeti szekvenciaadatokat beküldtük az NCBI Sequence Read Archive adatbázisába.

Kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció

A BV-2 sejtek teljes RNS-ét az RNA-easyTM Isolation Reagent (Vazyme Biotech, Kína) segítségével gyűjtöttük be, és a reverz transzkripciós reakciót FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, Kína) segítségével hajtottuk végre. A reakciókat a gyártó protokollja szerint végeztük. A cDNS-t kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakciós (qRT-PCR) vizsgálatnak vetettük alá specifikus primerekkel és TransStart TOP Green qPCR SuperMix-szel (TransGen Biotech, Kína). A primereket az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza, és -aktint használtunk belső kontrollként. A kvantitatív elemzéshez a 22 1 1 CT módszert alkalmaztuk.

Western Blot analízis

A BV-2 sejteket RIPA lízispufferrel (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Kína) lizáltuk, amely 1% proteázinhibitor koktélt (Thermo Fisher) tartalmazott, hogy összfehérjét kapjunk. A fehérjéket 10%-os SDS-PAGE-val választottuk el, és NC membránokra vittük át. 5 százalékos fölözött tejjel/BSA-val való blokkolást követően a membránokat AMPK-val (Proteintech), p-AMPK-val (Affiffinity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-κB-vel (Proteintech), p-NF-κB-vel inkubáltuk. (ABklonális) vagy GAPDH (ABklonális) antitestek 5 százalékos TBST-ben 4 °C-on egy éjszakán át. A membránokat másodlagos torma-peroxidázzal konjugált antitesttel (ABclonal) inkubáltuk szobahőmérsékleten 1 órán át. A vizualizációhoz és a mennyiségi meghatározáshoz a nagy jelzésű ECL Western blotting szubsztrátot (Tanon, Kína), a gél képalkotó rendszert (Tanon, Kína) és az ImageJ szoftvert használtuk.

Molekuláris dokkolás

A molekuláris dokkolás elemzését Autodock szoftverrel (4.2-es verzió) végeztük. Az ACT és a fehérjék közötti affinitást az AutodockTools szoftver figyelte meg. Az AMPK (PDB ID: 5g5j) és az NF-κB (PDB ID: 4q3j) háromdimenziós (3D) fehérjeszerkezetét a Protein Data Bank12-ből nyertük ki.

Statisztikai analízis

Az összes adatot átlag ± szórásként fejezzük ki, és a GraphPad Prism Software (8.{1}}.1 verzió) elemzi. A csoportok közötti különbségeket egyutas varianciaanalízissel (ANOVA), majd Tukey többszörös összehasonlító tesztjével elemeztük. p < 0,05="" volt="" statisztikailag="">

EREDMÉNYEK

Az ACT-AD az interakciós hálózatot és az útvonal előrejelzését célozza meg

Több adatbázis összevonásával 253 ACT célpontot sikerült megszerezni, míg összesen 1697 AD-hoz kapcsolódó célpontot gyűjtöttek össze. A célhálózat feltérképezése után összesen 70 célpont került az ACT-AD célinterakciós hálózatba (1A. ábra). A KEGG dúsítási elemzés azt sugallta, hogy az ACT széles spektrumú és többszörös célhatású lehet (1B. ábra). Azt is javasolta, hogy az ACT-nek több útja, célpontja és eleme van az AD kezelésében. Osztályozza ezeket az útvonalakat a mechanizmusok pontos értelmezéséhez. Az ACT főként a jelátvitellel, az endokrin rendszerrel, az immunrendszerrel, valamint a sejtek növekedésével és halálával korrelálhat, hogy konfrontatív szerepet játszhasson az AD-vel szemben (1C. ábra). Érdemes megjegyezni, hogy ezen utak túlnyomó többsége gyulladásos reakciókhoz kapcsolódik. Feltételezik, hogy az ACT gyulladáscsökkentő hatása elválaszthatatlan része lehet az AD elleni konfrontációs szerepének.

Az ACT enyhítette a diszkinéziát és javította a kolinerg rendszer működését AD Zebrafish lárvákban

A hálózati modell ellenőrzéséhez az AlCl3-indukált AD modellt zebradán lárvákban használták az ACT hatásának demonstrálására. Megfigyelték a zebrahal lárváinak világos/sötét ciklusokon belüli mozgását, és rögzítették úszási nyomaikat (1D. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy az ACT hatékonyan növelte a zebrahal AS és 1S értékét, és a szinergikus hatás a dózisok növelésével nőtt (1E. ábra). A DRR és RE az ACT és a DPZ intuitívabb összehasonlítását tárta fel (1F ábra). Ennek megfelelően az ACT enyhítette a diszkinéziát, hasonló hatásokat mutatva, mint a DPZ. Általánosan elfogadott, hogy a kolinerg rendszer fontos szerepet játszik a tanulási és memóriafolyamatokban. Így az AChE és a ChAT tevékenységeit használták fel az ACT hatásának feltárására. A zebrahal AlCl3-expozíciója az agy kolinerg elváltozását eredményezte (1G. ábra). Jelentős volt, hogy az ACT kezelés elnyomta az AChE aktivitását. Ezenkívül a ChAT aktivitása csökkenést mutatott az ACT kezelés után. Ezért az ACT mélyreható hatást mutatott az AlCl3-indukált AD zebrahal lárvákban.

Az ACT elnyomta az M1 polarizációt és elősegítette az M2 polarizációt LPS-indukált BV-2 sejtekben

A hálózat további megerősítésére az ACT gyulladáscsökkentő hatását in vitro vizsgálták BV-2 mikrogliasejtek segítségével. 24 órás LPS kezelés után a BV-2 sejtek életképessége szignifikánsan csökkent. Szerencsére az ACT növelte az LPS-indukált BV{5}} sejtek életképességét (2A. ábra). Ezenkívül megfigyelték a BV-2 sejtek morfológiáját. 24 órás LPS-stimuláció után kimutatta, hogy a BV-2 sejtek M1 polarizációs állapoton mentek keresztül. A morfológiai változásokat az ACT-együttes kezelés megakadályozta (2B. ábra).

Ezenkívül az eredmények azt mutatták, hogy az LPS-sel stimulált BV-2 sejtekkel ellentétben az ACT-vel együtt kezelt BV-2 sejtek jelentősen elnyomták a TNF-, IL-1 és NO expressziót (2C. ábra). sejtfelülúszóban. Ezek klasszikus gyulladást elősegítő citokinek, amelyek az M1 mikroglia polarizációjának indikátorai. Az ELISA eredményeihez hasonlóan a qPCR eredményei azt mutatták ki, hogy a TNF-, nitrogén-monoxid-szintáz (iNOS), IL-1 és CD86 mRNS expresszióját szignifikánsan gátolta az ACT-kezelés az LPS-csoporthoz képest. (2D. ábra). Ezenkívül ELISA-val (2C. ábra) és qPCR-rel (2E. ábra) mértük az M2 mikroglia polarizációs szintjét, és az eredmények azt mutatták, hogy az ACT szignifikánsan növelte az M2 mikroglia marker expressziós szintjét (IL-10, CD206, TGF- és Arg-1). Egyszóval ezek az eredmények azt mutattákTÖRVÉNYelnyomta az M1 mikroglia polarizációját és elősegítette az M2 fenotípust.

ACT által szabályozott M1/M2 polarizáció az NF-κB útvonal gátlásán keresztül

A transzkriptomikus analízist az RNA-seq segítségével végeztük, hogy átfogó szintről feltárjuk az ACT mechanizmusát BV-2 sejtekben. A PCA szemléltette, hogy a kontroll-, az LPS- és az ACT-csoport jól elkülöníthető (3A. ábra). 899 differenciálisan expresszált gént (DEG) mutatott ki a kontrollcsoport és az LPS-csoport között, és 49 DEG-et az LPS-csoport és az ACT-csoport között (3B. ábra). Következetesen a GO (3C. ábra) és a KEGG dúsítási elemzés (3D. ábra) feltárta, hogy az ACT hatása szerepet játszik az NF-κB útvonalban. Az NF-κB útvonalhoz kapcsolódó génkészlet további megerősítést nyert, és ezek homeosztázisát minden bizonnyal befolyásolta az LPS. Ahogy az várható volt, az ACT jelentősen befolyásolta a kifejezéseiket (3E. ábra). Az NF-κB útvonal egy klasszikus út a gyulladás progressziójának szabályozására, amely végső soron gyulladást elősegítő faktorok felszabadulását eredményezi. A mechanikai támogatás megszerzése érdekében az NF-κB útvonal kulcsfontosságú fehérjét Western blot segítségével értékeltük ki. Az LPS-stimuláció az NF-κB aktiválásához vezetett, ami az M1 polarizációt elősegítette. Az RNS-seq analízissel összhangban az ACT gátolta az LPS-stimulált NF-κB foszforilációt (3F. ábra). Ezért az ACT enyhítheti az LPS által kiváltott M1 polarizációt az NF-κB útvonalon keresztül a BV-2 sejtekben.

ACT károsodott arginin bioszintézis, valamint pantotenát és CoA bioszintézis

Az ACT hálózati előrejelzése feltárta, hogy az arginin (Arg) és prolin metabolizmussal függ össze (1B. ábra). Az RNS-seq kimutatta, hogy az ACT által érintett útvonalak magukban foglalják az Arg bioszintézist, valamint a pantotenát és a CoA bioszintézist (3D ábra). Feltételezték, hogy a BV-2 sejtek LPS-stimuláció által kiváltott anyagcserezavarai az M1 polarizációval függnek össze (Orihuela et al., 2016). Így a HPLC-Q-TOF-MS módszerrel egy nem célzott sejtmetabolomot használtunk az ACT sejtmetabolizmusra gyakorolt ​​hatásának azonosítására. A PCA és a PLS-DA (3G. ábra) azt mutatta, hogy a kontroll, az LPS és az ACT csoport jól elkülöníthető az intracelluláris metabolitok alapján. Az LPS-indukált BV{11}} sejtekben a különböző metabolitok szintje megváltozott az ACT-kezelés után (3H. ábra). A kontrollcsoporthoz képest 11 metabolit volt szignifikánsan megváltozott az LPS-csoportban (2. kiegészítő táblázat), míg 14 metabolit egyértelműen megváltozott az ACT kezelése után (3. kiegészítő táblázat), 11 metabolikus útvonalat érintve (3I. ábra). Az ACT hatása elsősorban az aminosav-anyagcsere, a nukleotid-anyagcsere, az energia-anyagcsere, valamint a kofaktorok és vitaminok metabolizmusának szabályozásában állt. Érdekes módon a metabolom által nyert metabolikus útvonalak összhangban voltak a hálózati előrejelzéssel és az RNS-szekvenciával, beleértve az Arg bioszintézist, valamint a pantotenát és CoA bioszintézist. A fentiek azt mutatták, hogy az ACT szabályozhatja az Arg bioszintézist, valamint a pantotenát és CoA bioszintézist LPS-stimulált BV- 2 sejtekben.

TÖRVÉNYEnyhített LPS-indukált BV-2 mitokondriális diszfunkció

A mitokondriumok a metabolikus utak központi elemei. A folyamatosan fejlődő bizonyítékok azt mutatják, hogy a mitokondriumok kulcsszerepet játszanak a mikroglia M1/M2 polarizációjában. A mitokondriumok morfológiai és sejteloszlási állapotának áttekintését a TEM értékelte. LPS-stimuláció után a BV-2 sejtek kromatinja kondenzálódott, és a citoplazma és a mitokondriumok csökkentek (4A. ábra). Ezenkívül az LPS-csoport mitokondriális cristae-i elrendezõdtek, vagy el is tűntek, részleges krisztolízist, méretcsökkenést és kerek alakú morfológiát mutatva. Érdekes módon az ACT-kezelés enyhítheti az LPS által kiváltott morfológiai változásokat a mitokondriumokban. Felváltva vizsgáltuk az LPS-sel kezelt BV-2 sejtek mitokondriumfunkcióit, beleértve az MMP- és ATP-termelést. Az MMP (4B. ábra) és az ATP-termelés a mitokondriumokban (4C. ábra) szignifikánsan javult az ACT-csoportban az LPS-csoporthoz képest. A mitokondriális diszfunkció összefüggésben állhat a sejtben megnövekedett ROS-szinttel. Az áramlási citometriás elemzés kimutatta, hogy a ROS-tartalom túlterhelt volt az LPS-csoportban (4D. ábra). Szerencsére az ACT megszüntette a túlzott ROS-t. Azt sugallja, hogy az ACT helyreállíthatja a mitokondriumok működését a ROS törlésével.

ACT visszaállította a mitokondriumok funkcióját a PGC-1 és az UCP-2 fokozásával

A peroxiszóma proliferatív aktiválású receptor-koaktivátor-1 (PGC-1) fontos szerepet játszik a mitokondriális biogenezisben (Bi et al., 2019). Az LPS stimulálása csökkentette a PGC-1 expresszióját, ami a mitokondriumok diszfunkcióját mutatta. Figyelemre méltó, hogy a PGC-1 gén mRNS és fehérje expressziója szignifikánsan megfordult az ACT kezelés hatására LPS-sel kezelt BV-2 sejtekben (4E. ábra).

A mitokondriális szétkapcsoló fehérje-2 (UCP-2) a mitokondriális funkciót is szabályozza. A PGC-1 downstream fehérjeként képes szabályozni az LPS által kiváltott MMP depolarizációt és a ROS termelést. A legújabb jelentések azt mutatják, hogy központi szerepet játszik a mikroglia aktiválódási folyamatában, az M1 és M2 polarizáció ellentétes szabályozásával (De Simone et al., 2015). A Western blot eredmények azt mutatták, hogy az UCP-2 fehérjeszint csökkent LPS stimuláció után. Az LPS és az ACT együttes kezelése felerősítheti az UCP-2 expresszióját az LPS-kezeléshez képest. Az UCP{10}} mRNS expressziós szintje is hasonló változásokat mutatott (4F. ábra). Összefoglalva, az ACT helyreállította a mitokondriumok működését a PGC-1 és az UCP-2 fokozásával.

ACT Repressed Microglia M1

Polarizáció AMPK aktiválással

Kulcsfontosságú sejtenergia-érzékelőként az AMP-aktivált protein-kináz (AMPK) fontos szerepet játszik a sejtanyagcsere egyensúlyának fenntartásában. Ugyanakkor a PGC-1 az AMPK egy downstream fehérje. Amint azt a hálózati modell elemzése mutatja,TÖRVÉNYszabályozhatja az AMPK útvonalat (1B. ábra). Az eredmények feltárták, hogy az LPS gátolta az AMPK aktiválódását, ami sejtanyagcsere zavarokat és mitokondriális diszfunkciót eredményezett. Figyelemre méltó, hogy az ACT dózisfüggően növelheti a p-AMPK fehérje expresszióját (5A. ábra). Feltételezik, hogy az ACT fokozhatja a PGC-1 expresszióját és helyreállíthatja a mitokondriális funkciót az AMPK jelátviteli útvonal aktiválásával. Ebben a tanulmányban annak vizsgálatára, hogy az AMPK aktiválása hozzájárult-e a szabályozó hatásáhozTÖRVÉNYAz M1/M2 polarizációnál a C vegyületet (CC) alkalmaztuk az AMPK hatásának gátlására. Az ACT-kezelésben részesült csoportban a csökkentett NO-szinttel ellentétben a CC részben blokkolta az ACT NO-szintre gyakorolt ​​hatását (5B. ábra). Ezen eredmények alapján az ACT az AMPK aktiválásával szabályozhatja a BV-2 sejtek M1/M2 polarizációját.

TÖRVÉNYKötődik és gátolja az NF-κB-t, valamint aktiválja az AMPK-t

Molekuláris dokkolást alkalmaztunk annak igazolására, hogy az ACT kötődik-e az NF-κB és AMPK fehérjékhez. Az eredmények azt mutatták, hogy a kötési energia aTÖRVÉNYés az NF-κB -8,4 kcal/mol volt, míg aTÖRVÉNYaz AMPK pedig -10,8 kcal/mol volt. Szignifikáns affinitások igazolták, hogy az ACT közvetlenül kötődik az NF-κB-hez és az AMPK-hoz (5C, D, F, G ábra). Ezt követően tovább vizsgálták a lehetséges kötődési módokat és kölcsönhatásokat az aminosavzsebeken belül, beleértve az NF-κB 11 aminosavát (5E. ábra), valamint az AMPK 12 aminosavát (5H. ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az ACT közvetlenül befolyásolhatja az NF-κB-t és az AMPK-t, hogy gyengítse a BV{10}} mikroglia M1 polarizációját és elősegítse az M2 fenotípust.