Ⅰ rész A Herba Cistanches adjuváns értéke sztatinnal kombinálva egérmodellekben

Elaine Wat, Chun Fai Ng, Chi Man Koon, Cheng Zhang, Si Gao, Brian Tomlinson és Clara Bik San Lau

1 Kínai Orvostudományi Intézet, Hongkongi Kínai Egyetem, Shatin, New Territories, Hong Kong.

2 Állami Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, The Chinese University of Hong Kong, Shatin, New Territories, Hong Kong.

3 Klinikai Farmakológiai Osztály, Orvosi és Terápiás Osztály, Hongkongi Kínai Egyetem, Shatin, New Territories, Hong Kong. Elaine Wat és Chun Fai Ng egyaránt hozzájárult ehhez a munkához. A levelezést és az anyagokra vonatkozó kéréseket a CBSL-nek kell címezni (e-mail: claralau@cuhk.edu.hk)

További információ: emily.li@wecistanche.com

Kattintson ide, ha többet szeretne megtudni Cistanche-ról

Absztrakt

A sztatinokról köztudott, hogy izomtoxicitási problémáik vannak.HerbaCistanches(HC) egy kínai gyógynövény, amelyet hagyományosan ágyék- és térdfájdalmakra használnak. Korábbi in vitro vizsgálatunk azt sugallta, hogy védelmet nyújthat a sztatinok által kiváltott izomtoxicitás ellen. In vivo védő hatását azonban soha nem vizsgálták. A vizsgálat célja annak meghatározása volt, hogy a vizes kivonat aHerbaCistanche(HCE) megakadályozhatja a szimvasztatin által kiváltott izomtoxicitást patkányokban, valamint azt, hogy a Herba Cistanche E jótékony hatást fejthet-e ki a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott hiperkoleszterinémia és az emelkedett májkoleszterinszint csökkentésében, ezáltal csökkentve a szimvasztatin adagját kombinált terápia során. Eredményeink szerint a Herba Cistanche E szignifikánsan helyreállította a szimvasztatin által kiváltott izomtömeg-csökkenést, és csökkentette a plazma kreatin-kinázszint emelkedését patkányokban.HerbaCistancheAz E javította a szimvasztatin által kiváltott izom-glutationszint-csökkenést, az izom mitokondriális membránpotenciálját és csökkentette a szimvasztatin által kiváltott izomgyulladást. Ezenkívül a HCE csökkentheti a máj tömegét, a teljes májlipidszintet és a plazma lipidszintjét magas zsírtartalmú egerekben. Összefoglalva, tanulmányunk in vivo bizonyítékot szolgáltatott arra, hogyHerba CistancheAz E potenciálisan védő hatást fejt ki a szimvasztatin által kiváltott izomtoxicitásra, valamint jótékony hatással van a diéta által kiváltott, nem alkoholos zsírmájra és a hiperlipidémiára, ha önmagában vagy szimvasztatinnal kombinálva, csökkentett dózisban alkalmazzák.

A HMG-CoA reduktáz gátlók, más néven sztatinok, jól dokumentáltak, hogy jótékony hatásúak a hiperkoleszterinémiás betegeknél, akiknek közepes és magas szív- és érrendszeri kockázata van1. A sztatinok, az egyik legkelendőbb vényköteles gyógyszercsoport a világon, a HMG-CoA mevalonsavvá történő redukálásán keresztül gátolják a mevalonát reakcióút korai szakaszában az endogén koleszterinszintézist2, 3. Bár a sztatinok általában jól tolerálhatók. , az egyik legfontosabb és legismertebb klinikai mellékhatás a vázizom-rendellenességek, amelyek a jóindulatú izomfájdalmaktól a súlyos myopathiáig terjedhetnek4, 5. Egy 10 409 francia alany körében, telefonos interjún keresztül végzett nagy felmérésben a kapott betegek 10 százaléka A sztatinkezelés izomtünetekről számolt be, amelyekből a tünetekkel járó betegek 30 százaléka a kezelés abbahagyását eredményezte6. A National Lipid Association Statin Safety Task Force ajánlásokat fogalmazott meg a sztatinterápiában részesülő betegek izomzattal kapcsolatos tüneteinek kezelésére. Általánosságban elmondható, hogy azoknál a betegeknél, akiknél súlyos tünetek jelentkeznek, mint például az emelkedett kreatin-kináz (CK) szintje több mint 5×ULN, a sztatinok szedését fel kell függeszteni, amíg a CK-szint ismét normalizálódik5. Ezen mellékhatások előfordulása, valamint az, hogy a sztatinok által kiváltott izomtoxicitásra nem létezik hatékony kezelés, ezért késztetés van új terápiák keresésére a sztatinok által kiváltott izomproblémák kezelésére.

Bár számos mechanizmust javasolnak, amelyek felelősek lehetnek a sztatin káros hatásaiért, a mitokondriális mechanizmusok vélhetően szerepet játszanak a statin izomtoxicitási káros hatásaiban1. A mevalonát nemcsak koleszterin-prekurzor, hanem fontos vegyületek, például szelenoproteinek, dolichol és ubikinon előanyaga is7, 8. A statin csökkentheti a szelenoprotein, például a glutation-peroxidáz (GPx) szintjét, ami veszélyezteti az antioxidánsok sűrűségét, és hozzájárul a káros hatásokhoz. hatások4. A sztatinok az ubikinon kimerüléséhez is vezethetnek, ami csökkenti az oxigénfogyasztást és az ATP szintézist9. Ezenkívül a növekvő in vitro és in vivo vizsgálatok azt mutatták, hogy a sztatin közvetlenül a szöveti mitokondriumokra is hathat, megnövekedett reaktív oxigénfajtákat (ROS) és mitokondriális oxidatív stresszt okozva, ami sejthalálhoz vezet, és ezáltal hozzájárul a máj- és izomkárosodáshoz10, 11.

HerbaCistanches, az egész szárított növény aCistanchedeserticolaAz YC Ma (Orobanchaceae család) parazita növények, amelyek túlnyomórészt Észak- és Északkelet-Kína sivatagi területein nőnek12. A kínai orvoslás elmélete szerint a Herba Cistanches édes, meleg és sós ízű13. Ez egy Yang-élénkítő kínai tónusos gyógynövény, amelyet elsősorban a veseelégtelenség kezelésére használnak olyan tünetekkel, mint az impotencia, a meddőség, a korai magömlés. Ez egy kínai gyógynövény is, amelyet hagyományosan ágyék- és térdfájdalmakra írnak fel betegeknek, és általában kínai készítményekben használják izomproblémák kezelésére12, 14. Érdekes módon ez összhangban van a modern tudományos tanulmányokkal is, amelyek kimutatták -A Herba Cistanches poliszacharidban és fenil-etanolban gazdag kivonatának fáradékony hatása patkányokban edzés után az izomkárosodás csökkentésével és az ATP raktározás javításával15. Emellett a közelmúltban végzett kutatások kimutatták, hogy a Herba Cistanches metanolos kivonata fokozhatja a mitokondriális ATP-termelést16.HerbaCistanchesErős antioxidánsnak és szabad gyökfogónak is bizonyult különböző szervekben, csökkentve az oxidatív stresszt és a ROS aktivitást in vivo vizsgálatok17, 18. A laboratóriumunk által nemrégiben végzett vizsgálat során kimutattuk, hogyHerbaCistanchesA vizes kivonat szignifikánsan megakadályozta a szimvasztatin által kiváltott toxicitást az L6 vázizomsejtekben, valamint a dózisfüggően helyreállított szimvasztatin által kiváltott ATP termelés csökkenését L6 sejtekben, ami arra utal, hogyHerbaCistanchesvizes kivonat a sztatinok által kiváltott izomtoxicitás elleni védelemben19. Ennek ellenére hiányoznak az in vivo bizonyítékok.

Ezért azt feltételeztükHerbaCistanchesvizes kivonat (HCE) jótékony hatással lehet a szimvasztatin által kiváltott izomtoxicitásra. Így ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy meghatározza, hogy a HCE alkalmazása csökkentheti-e a szimvasztatin által kiváltott izomtoxicitást in vivo állatmodell segítségével, és emellett, hogy a HCE jótékony hatással lehet-e a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott hiperkoleszterinémia és az emelkedett májkoleszterinszint csökkentésére. , ezáltal csökkentve az alkalmazott szimvasztatin adagját.

Anyagok és metódusok

Növényi anyagok hitelesítése és kinyerése.

Nyers növényi anyag aHerbaCistanches(Cistanche deserticola, Belső-Mongóliából származik) a Zi Xin-től, egy neves beszállítótól vásárolták a kínai Kantonban. A Herba Cistanchest kémiailag hitelesítették vékonyréteg-kromatográfiával és ultra-teljesítményű folyadékkromatográfiával a 201013. számú Kínai Gyógyszerkönyvnek megfelelően, a korábban leírtak szerint19.verbascosideésechinakozid(a Kínai Nemzeti Gyógyszerészeti és Biológiai Termékek Ellenőrzési Intézettől vásárolva) vegyi markerként. Kémiai hitelesítéskor herbáriumi utalványmintaHerbaCistanchesletétbe helyezték a Hongkongi Kínai Egyetem Kínai Orvostudományi Intézetének Múzeumában, 2014-3434 számú utalványmintával.

HerbaCistanchesvizes kivonatot készítettünk a korábban leírtak szerint19. Röviden, 1 kg nyers fűszernövényt áztattunk 1 órán át, majd kétszer extraháltunk 1 órán át 100 fokos visszafolyató hűtő alatt, 10x desztillált vízzel. A vizes extraktumokat (HCE) egyesítjük, szűrjük, és a szűrletet csökkentett nyomáson 60 °C-on bepároljuk. A koncentrált extraktumot szárazra liofilizáljuk. A hozam 50,1 tömegszázalék volt. Az összes extrahált port vákuumcsomagoltuk és felhasználásig tároltuk.

Kísérleti állatok.

A szimvasztatint az SR Pharmasolutions Ltd.-től vásároltuk. A hím Sprague Dawley patkányokat (180–200 g) és a hím C57Bl/6J egereket (8- hetes) a Hongkongi Kínai Egyetem Laboratory Animal Services Centre szállította. Az állatkísérleteket a Hongkongi Kínai Egyetem Állatkísérletek Etikai Bizottsága hagyta jóvá (hivatkozási szám: 12/074/MIS). Minden kísérleti módszert a Hongkongi Kínai Egyetem Állatkísérletek Etikai Bizottsága által meghatározott jóváhagyott irányelvek szerint végeztünk. Minden patkányt (ketrecenként 3 állatot) és egeret (ketrecenként 5 állatot) normál standard ketrecekben tartottunk állandó, 21 fokos hőmérsékleten, 12-órás világosság-sötét ciklussal. Mindegyik standard ketrecben nyárfa volt alomanyagként. Minden állat ad libitum hozzáférést kapott a táplálékhoz és a vízhez.

A statinok által kiváltott izomtoxicitás vizsgálata patkányokon.

Az összes patkányt véletlenszerűen 5 csoportra osztották (n=5–10). Minden állat normál chow diétán volt. Desztillált vizet vagy szimvasztatint is kaptak naponta, intragasztrikusan HCE-kezeléssel vagy anélkül. Azoknak az állatoknak, amelyeknek szimvasztatint és HCE-t is kapniuk kell, a HCE-t a szimvasztatin beadása után 3 órával adták be, hogy megakadályozzák a közvetlen gyógynövény-gyógyszer kémiai kölcsönhatásokat. A gyógynövénykivonatot vagy szimvasztatint 0,5 százalékos metilcellulózban oldottuk fel desztillált vízben ismert koncentrációban. Minden állatnak intragasztrikusan egy előre kiszámított térfogatot adtunk be az egyed súlyának megfelelően, így a számított térfogat tartalmazza a javasolt adag szükséges mennyiségét. A csoportok adatai a következők:

a) csoport normál étkezési étrend plusz desztillált víz (normál kontrollcsoport)

b) csoport normál étkezési étrend plusz szimvasztatin (640 mg/kg)

c) csoport normál étkezési étrend plusz szimvasztatin (640 mg/kg) plusz alacsony dózisú HCE (1,1 g/kg állat)

d) csoport normál étkezési étrend plusz szimvasztatin (640 mg/kg) plusz nagy dózisú HCE (2,2 g/kg állat)

e) csoport normál étkezési étrend plusz nagy dózisú HCE (2,2 g/kg állat)

A táplálékfelvételt naponta rögzítettük, és a testsúlyt hetente kétszer mértük. A kezelést 4 hétig végezték. Ezt követően az állatokat ketamin (100 mg/kg) és xilazin (10 mg/kg) keverékével intraperitoneálisan elaltattuk. A vért szívpunkcióval vettük le, és hagytuk megalvadni. A plazmát ezután centrifugálással (3, 000 fordulat/perc 10 percig) elválasztottuk. Különféle izmokat (quadriceps, gastrocnemius, soleus, tibialis anterior és extensor digitorumlongus) kimetszettünk és -80 fokon tároltuk az elemzésig.

Plazma kreatin-kináz mérése. A plazma kreatin-kináz (CK) aktivitását a Stanbio CK Liqui-UV® kit (2910-430, Stanbio Laboratory, USA) segítségével határoztuk meg a gyártó utasításai szerint.

Izom-glutation-peroxidáz mérés. Az izom-glutation-peroxidázt (GPx) a kereskedelemben kapható készlettel (703102, Cayman Chemical, USA) mértük a gyártó utasításai szerint. Röviden, az izomszöveteket 7,4-es pH-jú PBS-sel öblítettük, hogy eltávolítsuk a vörösvértesteket, majd 5-10 ml hideg lízispufferben homogenizáljuk, majd a homogenizátumot 10, 000 g-vel 15 percig 4 fokon centrifugáljuk. A felülúszót ezután eltávolítottuk, és a GPx-aktivitást vizsgáltuk a kereskedelmi készlettel.

Izom-mitokondriális és citoszolos frakciók előkészítése. Az izommintákból származó mitokondriális és citoszolos frakciókat Mitochondria Isolation Kit (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, USA) segítségével állítottunk elő a gyártó utasításai szerint. Röviden, a friss izommintákat extrakciós vajjal előkezeltük, apró darabokra vágtuk, és extrakciós pufferben homogenizáltuk. A szövethomogenizátumokat ezután centrifugáltuk. A felülúszót összegyűjtöttük, és citoszolos frakcióanalízishez tartottuk fenn. A mitokondriális pelleteket ezután mostuk és ismét centrifugáltuk, és a mitokondriális frakció elemzéséhez használtuk.

Muscle Mitochondrial Reactive Oxygen Species (ROS) mérés. A ROS mérése a korábbi irodalomból módosított protokoll szerint történt20. Röviden, a ROS-t a mitokondriális frakcióból (50 µg fehérje/ml) mértük DCFDA oldattal (C6827, Invitrogen, USA). Az elegyet 37 fokon 10 percig sötétben inkubáltuk, majd szubsztrát oldattal (10 mM piruvát, 15 mM malát) inkubáltuk fotoaktiválás céljából. A fluoreszcencia intenzitását 5 percenként 60 percig mértük BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader készülékkel 485 nm-es gerjesztés és 520 nm emisszió mellett. A fluoreszcencia intenzitást a ROS képződés mérésére számoltuk.

Az izom mitokondriális membránpotenciálja. Az izommintákból származó mitokondriális frakció mitokondriális membránpotenciálját a Manufacturer's protokoll (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, USA) szerint határoztuk meg. Ez az eljárás egy fixpontos vizsgálat, amely a JC-1 felvételét méri a J-aggregátumok képződésével. Röviden, a mitokondriális szuszpenziót úgy hígítottuk, hogy 20 µg fehérjét tartalmazzon, és a JC-1 festéssel 7 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ez a 7-perc a gyártó által különféle vegyületek felhasználásával optimalizált és validált idő (a gyártói protokoll szerint), mivel az oldat megfigyelt fluoreszcenciája 5-10 perc elteltével platóba emelkedik, amit drasztikus csökkenés követ. a JC-1 fluoreszcenciája a JC-1 koncentrációinak kiegyenlítődése miatt a mitokondriális mátrixon belül és kívül. A fluoreszcencia intenzitását BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader készülékkel mértük 490 nm-es gerjesztésnél és 590 nm-es emissziónál. A potenciál gradiensek mérésére fluoreszcencia intenzitást számoltunk.

Izomszövettani és gyulladásos felmérés. A gyulladásos sejtek immunhisztokémiáját az izmokban CD68 és CD163 festéssel értékeltük a korábban leírtak szerint 21–23. 5 μm-es parafnmetszeteket vágtunk, amelyeket Superfrost™ Plus üveglemezekre ragasztottak (Menzel-Gläser, Németország). Az elsődleges egér anti-patkány CD68, ED1 és CD163 antitesteket, az ED2-t (Bio-Rad, USA) 1:100 hígításban vittük fel a metszetekre. A specifikus festődést az EnVision™ Systems (Dako, Dánia) detektálta a másodlagos antitest, az EnVision-HRP polimerrel konjugált anti-egér IgG 1:200 hígítással, majd DAB-oldattal (Dako, Dánia), majd ezt követte. hematoxilinnel ellenfestéssel. A metszeteket ezután hisztonban lévő dibutil-ftalátba (DPX) szereltük fel. A neutrofilek jelenlétét az izmokban kvantitatív immunhisztokémiával, ImageJ szoftverrel detektáltuk.

Izomgén expressziós elemzés. Az oxidatív stresszel kapcsolatos géneket profilozó PCR vizsgálatot Rat Oxidative Stress és Antioxidant Defense PCR-tömbök (PARN-065Z, SABiosciences, Frederick, USA) segítségével végeztük. A PCR array-t a gyártó utasításai szerint végeztük. Röviden, a teljes RNS-t szilikagél alapú membránhoz való szelektív kötéssel izoláltuk az izomminták lízisét és homogenizálását követően denaturáló guanidin-tiocianát pufferben (RNeasy kit, Qiagen). Az RNS-t az RT2 First Strand Kit (SABiosciences, Frederick, USA) segítségével cDNS-vé fordítottuk át. Ezt a cDNS-t azután hozzáadtuk az RT2 SYBR Green qPCR Master Mix-hez (SABiosciences, Frederick, USA). Ezt követően minden mintát Rat Oxidative Stress és Antioxidant Defense PCR-tömbökön (SABiosciences, Frederick, USA) osztottunk szét. Minden lépés a gyártó protokollja szerint történt.

A magas zsírtartalmú étrend által kiváltott hiperlipidémia és májzsugorodás vizsgálata egerekben.

Az összes egeret véletlenszerűen 5 csoportra osztották (n=8–10), és a következőket kapták: a csoport) Normál étkezési étrend (1. táblázat); B–e csoportok) Magas zsírtartalmú étrend (21 százalék zsírt és 0,15 százalék koleszterint tartalmaz) (2. táblázat). Az állatokat 8 hétig diétázták az elhízás előidézésére. 8 hét elteltével minden magas zsírtartalmú táplált csoport desztillált vizet vagy szimvasztatint kapott naponta, és/vagy HCE-kezelést intragasztrikusan, 3 órával a szimvasztatin beadása után. A gyógynövénykivonatot vagy szimvasztatint 0,5 százalékos metil-cellulózban (Sigma-Aldrich Corporation, USA) desztillált vízben oldottuk fel ismert koncentrációban. Minden állatnak intragasztrikusan egy előre kiszámított térfogatot adtunk be az egyed súlyának megfelelően, így a számított térfogat tartalmazza a javasolt adag szükséges mennyiségét. A csoportok adatai a következők:

a) csoport normál étkezési étrend plusz desztillált víz

b) csoport magas zsírtartalmú étrend plusz desztillált víz

c) csoport magas zsírtartalmú étrend plusz szimvasztatin (50 mg/kg)

d) csoport magas zsírtartalmú étrend plusz HCE (4,4 g/kg)

e csoport) Magas zsírtartalmú étrend plusz szimvasztatin (25 mg/kg) plusz HCE (4,4 g/kg)

A táplálékfelvételt naponta rögzítettük, és a testsúlyt hetente kétszer mértük. A 16-hetes vizsgálat végén az összes egeret 16-órás éjszakai koplalás után leöltük. Az állatokat ketamin (100 mg/kg) és xilazin (10 mg/kg) keverékével érzéstelenítettük intraperitoneálisan. A vért szívpunkcióval vettük le, és hagytuk megalvadni. A plazmát centrifugálással választottuk el (3, 000 fordulat/perc 10 percig). A májat kimetsszük és -80 fokon tároljuk az elemzésig.

Plazma és máj lipidmérés.

Plazma triglicerid, koleszterin (11488872216 és 11489232216, Roche Diagnostics, Svájc), nagy sűrűségű és alacsony sűrűségű lipoprotein koleszterin (L-típusú HDL-C és L-típusú LDL-C, Wako Pure Chemicals, a koncentrációt a Japans mérte) enzimatikus módszerek a kereskedelemben kapható készlet felhasználásával a gyártó utasításai szerint. A plazma kreatin-kináz (CK) aktivitását Stanbio CK Liqui-UV® kit (2910-430, Stanbio Laboratory, USA) segítségével határoztuk meg. A teljes májlipideket gravimetriásan határoztuk meg extrakció után Bligh és Dyer24 módszerével. Az egyes májlipideket izopropanolban (Sigma-Aldrich, USA) történő szolubilizálás után enzimatikusan (a fent leírtak szerint) kvantifikáltuk25.

Májszövettani és gyulladásos felmérés. Hematoxilin és eozin festés (H&E festés). A paraffinba ágyazott szövet kullancsmetszeteit (5 μm) mikrotommal vágtuk, és SuperFrost Plus® mikroszkóp tárgylemezekre helyeztük (Thermo Scientific, USA). A metszeteket H&E festésnek vetettük alá Harris és munkatársai módszere szerint. 26. ábra, és dibutil-ftaláttal szerelve hisztonban (DPX) (Sigma-Aldrich, USA)25.

Mac-3 festés és számszerűsítés. A paraffinba ágyazott szövetből vastag metszeteket (5 μm) vágtunk le mikrotom segítségével, és SuperFrost Plus® mikroszkóp tárgylemezekre helyeztük (Thermo Scientific, USA). Megtörtént az antigén visszanyerése, majd a peroxidáz blokkolással való blokkolás (Dako Cytomation, Dánia). Elsődleges tisztított egér elleni Mac-3 antitestet (BD Pharmingen, USA) vittünk fel a metszetekre 1:50 hígításban. A specifikus festődést az EnVision™ Systems (Dako, Dánia) segítségével detektáltuk. A tárgylemezeket a másodlagos antitesttel, az EnVision-HRP polimerrel konjugált anti-nyúl IgG-vel inkubáltuk 1:200 hígításban. A Mac-3-t DAB-oldattal (Dako, Dánia) detektáltuk, és hematoxilinnel ellenfestettük. A szakaszokat ezután DPX-be szerelték fel. A makrofágok jelenlétét a májban kvantitatív immunhisztokémiával, ImageJ szoftverrel detektáltuk.

Statisztikai analízis. A kezelési és kontrollcsoportok közötti különbségeket egyutas varianciaanalízissel (ANOVA), majd a posthoc Bonferroni-féle többszörös összehasonlító teszttel teszteltük. Minden statisztikai elemzést a GraphPad Prism 6-os verziójával végeztünk.0 (GraphPad, USA). A valószínűsége p<0.05 would="" be="" considered="" statistically="">

Eredmények

HatásaHerbaCistancheE a szimvasztatin által kiváltott izomtoxicitásról patkányokban. Izomtömeg és plazma kreatin-kináz mérés. Öt különböző típusú izmot (négyfejű izom, gastrocnemius, soleus, tibialis anterior és extensor digitorum longus izom) izoláltunk minden kezelt patkányból. A különböző kezelések izomtömegre gyakorolt ​​hatásait az 1a. ábra mutatja. A szimvasztatin (640 mg/kg) szignifikáns súlycsökkenést indukált a négyfejű izomzatban, a gastrocnemiusban és a tibialis anterior izmokban patkányokban, míg ezeket a csökkenéseket a HCE szignifikánsan helyreállította a quadriceps és a gastrocnemius izmokban dózisfüggő módon. HabárHerbaCistancheE tendenciát mutatott a sípcsont elülső izomzatának visszaállítására szimvasztatinnal kezelt patkányokban, e kezelési csoportok egyike sem érte el a statisztikai szignifikanciát. A HCE önmagában végzett kezelésének nem figyeltünk meg szignifikáns hatást az izomtömegre a kontroll patkányokkal összehasonlítva (1a. ábra).

Az 1b. ábra a különböző kezelések hatását mutatja a plazma kreatin-kináz (CK) szintjére patkányokban. A szimvasztatin a kreatin-kináz aktivitásának szignifikáns növekedését idézte elő patkányokban, amit mindkét dózisnál szignifikánsan csökkent a HCE együttes kezelés. A HCE önmagában végzett kezelésnek sem volt szignifikáns hatása a CK-szintekre a kontrollcsoporthoz képest. Mivel úgy tűnt, hogy a gastrocnemius érzékeny a szimvasztatin-kezelésre, és ez a legnagyobb tömeg szerint izolált izom, ezért ezt az izmot választottuk további elemzésekhez, beleértve az izomglutation-peroxidáz mérést (GPx), a mitokondriális MMP és ROS mérést, valamint az izomszövettani és gyulladásos vizsgálatokat. .

Izom-glutation-peroxidáz (GPx) mérés. Az izom-glutation-peroxidáz szinteket mértük, és a 2a. ábrán mutatjuk be. A szimvasztatin beadása az izom-glutation-peroxidáz (GPx) mérésének csökkenését idézte elő patkányokban. A HCE azonban tendenciát mutatott, hogy javítsa a szimvasztatin által kiváltott izom GPx csökkenését mind 1,1 g/kg, mind pedig 2,2 g/kg dózisban. Szintén nem volt szignifikáns hatása a HCE-kezelés önmagában az izom GPx szintjére, összehasonlítva a normál kontroll patkányokkal.

Mitokondriális membránpotenciál (MMP) és ROS mérés. A szimvasztatin (640 mg/kg) kezelés az izom MMP jelentős csökkenését idézte elő (2b. ábra). Ez a csökkenés dózisfüggően javult a HCE-vel és szimvasztatinnal együtt kezelt patkányokban (2b. ábra). Másrészt érdekes módon a szimvasztatin egyedül kezelt csoportban szignifikánsan csökkent az izom mitokondriális ROS szintje a normál kontrollcsoporthoz képest (2c. ábra). A szimvasztatinnal kezelt patkányoknak adott HCE-kezelés azonban dózisfüggő tendenciát mutatott az izom mitokondriális ROS szintjének normál szintre való visszaállítására. A HCE önmagában végzett kezelésének sem volt szignifikáns hatása patkányokban a normál kontrollcsoporthoz képest sem a mitokondriális MMP, sem a ROS mérés során.

Izomszövettani és gyulladásos felmérés. A különböző kezelésekkel kezelt patkányokból származó gastrocnemius izmokat szövettanilag tovább elemeztük, és a reprezentatív festett metszeteket a 3a. ábra mutatja. A kontrollcsoport állatai a normál izmok szövettani metszeteit mutatták ki. Ezzel szemben a szimvasztatinnal kezelt állatok H&E metszetei gyulladásos markerek (sárga nyilak) beszűrődését mutatták ki, ami szignifikánsan csökkent a patkányok izomrészein a szimvasztatin és a HCE kombinációja mellett. Immunhisztokémiai elemzéseket is végeztünk a 4a. és 5a. ábrán látható CD68 és CD163 makrofágok jelenlétére, a megfelelő makrofágok mennyiségi meghatározását a 4b. és 5b. ábrán mutatjuk be. Az izommetszetek immunhisztokémiai analízise makrofág (CD68) jelenlétét tárta fel szimvasztatinnal kezelt patkányokban (barna elszíneződés), ami szignifikánsan csökkent patkányokban a HCE együttes kezelés hatására mindkét dózisnál (4b. ábra). Szignifikáns gyulladást sem figyeltek meg a csak HCE-vel kezelt állatokban. Hasonlóképpen, az izommetszetek immunhisztokémiai elemzése CD163-pozitív makrofágok jelenlétét mutatta ki szimvasztatinnal kezelt patkányokban (barna elszíneződés), ami szignifikánsan csökkent patkányokban a 2,2 g/kg HCE együttes kezelés hatására (5b. ábra). ). Szignifikáns gyulladást sem figyeltek meg a csak HCE-vel kezelt állatokban.

Izomgén expressziós elemzés. A szimvasztatin és a HCE izomzaton belüli oxidatív stresszel kapcsolatos génekre gyakorolt ​​hatásának meghatározására PCR vizsgálatot végeztünk, amely az oxidatív stresszhez kapcsolódó géneket profilálja, Patkány Oxidatív Stressz és Antioxidáns Védelmi PCR-tömbök segítségével. A szimvasztatin-kezelés által szignifikánsan érintett géneket elemeztük és bemutattuk a 6. ábrán. Az antioxidánsokat szabályozó gének expressziós profilja tekintetében a szimvasztatinnal (640 mg/kg) kezelt patkányok növelték az antioxidánsokat szabályozó gének expresszióját. A Tese magában foglalja a glutation-peroxidázokat (GPx) GPx1 és GPx7, valamint más peroxidázokat, beleértve a Serpinb1b-t és a clubot (6a. ábra). A HCE mindkét dózisban (1,1 vagy 2,2 g/kg) normál szintre csökkentette a szimvasztatin által kiváltott GPx-ek és más peroxidázok növekedését. Másrészt a HCE-kezelés önmagában szignifikánsan növelte a GPx1 expressziós szintjét. Ami a ROS metabolizmust szabályozó gének expresszióját illeti, a szimvasztatin szignifikánsan indukálta más szuperoxid metabolizmus gének, köztük a Cyba, Ncf1, Ncf2, Scd1 és Ucp2 expresszióját. Hasonlóképpen, a HCE mindkét dózisban szignifikánsan csökkentette ezeket a növekedéseket (6b. ábra). Ezenkívül a szimvasztatin oxidatív stresszre reagáló gének expresszióját indukálta, beleértve az Apoe-t, a Ccl5-öt és a Txn1-et, míg ezek az expressziók szignifikánsan csökkentek a HCE-vel együtt kezelt állatokban mindkét dózisnál (6c. ábra). Másrészt a szimvasztatin jelentős csökkenést okozott a Txnip génexpressziójában. A HCE-nek nem volt szignifikáns hatása a szimvasztatin által kiváltott Txnip génexpresszió csökkenésére (6c. ábra). A szimvasztatin az oxigéntranszportereket szabályozó gének, köztük az Slc38a1 és a Vim expresszióját is jelentősen megnövelte. A HCE együttes kezelés mindkét dózisnál csökkentette e gének expresszióját (6d. ábra).

A szimvasztatin és a HCE kombinált használatának hatása az egerek táplálékfelvételére és testtömegére. A 7a. ábra az egerek napi táplálékfelvételét mutatja az összes kezelési csoportban. A magas zsírtartalmú étrend szignifikánsan megnövelte az állatok napi táplálékfelvételét a táplált állatokhoz képest (p<0.001). there="" was="" however="" no="" significant="" effect="" of="" the="" herb="" or="" drug="" treatments="" among="" all="" high-fat-fed="" groups="" (fig.="">

Heti testsúlymérés. 16 hét magas zsírtartalmú etetés után a HF-vel táplált állatok szignifikánsan nagyobb súlyt híztak, mint az étkezéssel táplált állatok (7b. ábra). Azonban nem volt szignifikáns hatás a HF-vel táplált egerek és az összes HF-et kapott kezelési csoport között. Szintén nem volt szignifikáns különbség a szimvasztatinnal és HCE-vel együtt kezelt HF-vel táplált egerek, illetve a csak HCE-vel vagy szimvasztatinnal kezelt HF-vel táplált egerek között (7b. ábra).

A szimvasztatin és a HCE kombinált alkalmazásának hatásai a hiperlipidémiára és a máj steatosisára egerekben. Plazma lipid és kreatin kináz aktivitás mérése. Az összes egér plazma lipidszintjei a 8. ábrán láthatók. A normál étkezéssel táplált egerekhez képest a HF-vel táplált egerekben szignifikánsan megemelkedett a plazma összkoleszterin (TC) szintje, amely minden kezelési csoportban szignifikánsan csökkent (8a. ábra). . A HF-vel táplált, szimvasztatinnal és HCE-vel kezelt egerek plazma TC-értéke szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a csak szimvasztatint vagy csak HCE-t kapó HF állatoké (p<0.001 and=""><0.01, respectively)="" (fig.="" 8a).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" simvastatin="" alone="" treatment="" group,="" suggesting="" hce="" has="" comparable="" effects="" as="" simvastatin.="" besides,="" hf-fed="" mice="" also="" had="" significantly="" higher="" plasma="" triglyceride="" (tg)="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" a="" normal="" chow="" diet=""><0.05) (figure="" 8b).="" there="" was="" a="" trend="" for="" a="" reduction="" in="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" on="" plasma="" tg="" in="" hf-fed="" animals,="" though="" this="" did="" not="" reach="" statistical="" significance.="" however,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" significantly="" reduced="" plasma="" tg="" compared="" to="" control="" hf-fed="" animals=""><0.001 and=""><0.01, respectively).="" when="" comparing="" between="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" with="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" group,="" hce="" co-treatment="" with="" simvastatin="" had="">

alacsonyabb plazma TG, mint a HF-vel táplált egerekhez képest, amelyek csak szimvasztatint kaptak (p<0.01) (fig.="" 8b).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" the="" simvastatin="" treatment="" group,="" though="" hce="" had="" a="" slightly="" better="" reduction="" in="" tg="" levels.="" in="" addition,="" high-fat-diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" high-density="" lipoprotein="" (hdl)="" cholesterol="" and="" plasma="" low-density="" lipoprotein="" (ldl)="" cholesterol="" in="" mice="" compared="" to="" normal="" chow-fed="" animals="" (fig.="" 8c="" and="" d).="" simvastatin="" treatment="" alone="" significantly="" reduced="" both="" lipids="" in="" high-fat-fed="" mice.="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" also="" significantly="" reduced="" both="" types="" of="" plasma="" lipids="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone.="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" both="" lipids="" among="" all="" treatment="" groups.="" figure="" 8e="" showed="" the="" effect="" of="" different="" treatments="" on="" plasma="" creatine="" kinase="" (ck)="" levels.="" interestingly,="" hf="" diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels="" in="" mice="" compared="" to="" normal-chow-fed="" mice="" (fig.="" 8e).="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" the="" co-treatment="" of="" simvastatin="" significantly="" reduced="" plasma="" ck="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone=""><0.01 and=""><0.01, respectively).="" simvastatin="" treatment="" alone="" also="" significantly="" reduced="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels.="" there="" was="" also="" no="" significant="" difference="" in="" plasma="" ck="" levels="" among="" all="" active="" treatment="" groups="">iver lipid mérés.

A különböző kezelési csoportok szívelégtelenség által kiváltott hepatomegáliára (megnagyobbodott máj) gyakorolt ​​hatásai a májonkénti lipid milligrammban kifejezve jelentős csökkenésével jártak együtt (9a. ábra). A máj teljes lipidtartalma szignifikánsan magasabb volt a HF-vel táplált egerekben, mint a normál étkezéssel táplált egerekben (3{5}}szer magasabb, p<0.001). simvastatin="" exerted="" no="" significant="" effect="" on="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" total="" liver="" lipid.="" interestingly,="" hce="" significantly="" reduced="" such="" a="" diet-induced="" increase="" in="" liver="" lipid=""><0.05). on="" the="" other="" hand,="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" exerted="" a="" trend="" to="" reduce="" the="" liver="" lipid="" content="" though="" did="" not="" reach="" statistical="" significance="" (p="0.15)." however,="" when="" comparing="" the="" liver="" lipid="" content="" among="" all="" treatment="" groups,="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" among="" all="">

Amint a 9b. és c. ábrán látható, a máj összkoleszterin (TC) és máj triglicerid (TG) mérése azt mutatta, hogy a HF-vel táplált egerekben mindkét lipid szintje megemelkedett a normál étkezéssel táplált egerekhez képest (azaz 3.{{4} }szeres növekedés a TC-ben, p<0.001; and="" 3.4-fold="" increase="" in="" tg,=""><0.001). simvastatin="" treatment="" significantly="" reduced="" liver="" total="" cholesterol="" levels=""><0.05) but="" not="" triglyceride="" levels.="" on="" the="" other="" hand,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment,="" significantly="" reduced="" both="" liver="" total="" cholesterol="" and="" triglyceride="" levels="" in="" high-fat-fed="" mice.="" when="" comparing="" the="" effects="" among="" all="" groups,="" we="" observed="" no="" significant="" difference="" in="" liver="" total="" cholesterol,="" but="" there="" was="" a="" significant="" reduction="" in="" liver="" tg="" for="" the="" hce="" treatment="" group="" as="" compared="" to="" the="" simvastatin="" treatment="" group="" (fig.="" 9b="" and="">

Májgyulladás értékelése. Immunhisztokémiai festést végeztünk a makrofágok jelenlétének megfestésére (Mac-3) (10a. ábra). A májmetszetek immunhisztokémiai analízise kimutatta a Mac-3 jelenlétét magas zsírtartalmú és normál étkezéssel táplált egerekben is (barna elszíneződés). Ez a gyulladás tovább fokozódott a szimvasztatinnal kezelt állatokban, bár ez a növekedés nem érte el a statisztikai szignifikanciát. Érdekes módon a HCE-kezelés, szimvasztatin együttes kezeléssel vagy anélkül, jelentősen csökkentette a gyulladást a magas zsírtartalmú egerekben. Összehasonlítva az összes kezelési csoportot, a HCE-kezelés, szimvasztatin egyidejű kezeléssel vagy anélkül, szintén szignifikánsan alacsonyabb gyulladást mutatott, mint a szimvasztatin-kezelési csoportban (p<0.001 and=""><0.001, respectively).="" these="" data="" are="" also="" presented="" as="" percentage="" areas="" in="" fig.="">

Olvasson tovább ...