Ⅰ rész A vaskelátor, PBT434, modulálja a transzcelluláris vas kereskedelmet az agy mikrovaszkuláris endothel sejtjeiben

Absztrakt

A vas és más átmeneti fémek, például a réz és a mangán nélkülözhetetlenek az agyműködés támogatásához, a túlzott felhalmozódás azonban citotoxikus. A fémek, különösen a vas túlzott felhalmozódása számos neurológiai rendellenességre jellemző; ezek közé tartozik az Alzheimer-kór, a Parkinson-kór, a Friedrich-féle ataxia és egyéb idegrendszeri degenerációval és a kapcsolódó agyi vasfelhalmozódással járó rendellenességek. A vasfluxus vér-agy gát általi kezelése jelenti az első védelmi vonalat a vas túlzott felhalmozódása ellen normál fiziológiában és ezekben a kóros állapotokban. Ebben a tanulmányban megállapítottuk, hogy a PBT434 vaskelátor, amelyet jelenleg a Parkinson-kór és a többszörös rendszersorvadás kezelésére fejlesztenek ki, az extracelluláris Fe kelátképzésével modulálja az emberi agy mikrovaszkuláris endothel sejtek (hBMVEC) vasfelvételét.^{2 plusz}. A hBMVEC PBT434-gyel történő kezelése a transzferrin receptor (TfR) és ceruloplazmin (Cp) transzkriptumainak bőségének növekedését eredményezi. A Western blot és ELISA analízisek a fehérjék megfelelő növekedését is kimutatták. A sejten belül a PBT434 növeli a jótékony, labilis Fe kimutatható szintjét^{2 plusz}; adatok azt mutatják, hogy ez a Fe^{2 plusz}felszabadul a ferritinből. Ezen túlmenően, a PBT434 fokozza a vas kiáramlását, valószínűleg a citoszolos vas (vas) mennyiségének növekedése miatt, amely a vasexportőr, a ferroportin szubsztrátja. A PBT434 gyorsan és kétirányú egyensúlyba kerül a hBMVEC vér-agy gáton keresztül. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a PBT434-vaskomplex nem szubsztrátja a hBMVEC felvételének, és így támogatják azt a modellt, amelyben a PBT434 kelátot képez az intersticiális vasban, és gátolja a vas újrafelvételét a vér-agy gát endothel sejtjeiben. valamint gátolja annak felvételét a neurovaszkuláris egység többi sejtje által. Összességében ez egy új és ígéretes mechanizmus a terápiás vaskelátképzéshez.

Kattintson ide a letöltéshezmilyen előnyei vannak a Cistanche-nak

Bevezetés

A fémkelátképző terápiát (MCT) régóta alkalmazzák átmenetifém-mérgezés kezelésére, valamint az esszenciális fémionok metabolizmusának genetikai rendellenességeire, amelyek a fém túlzott felhalmozódásához vezetnek [1–3]. Ez utóbbira két példa a réz hiperakkumulációja Wilson-kórban [4] és a vas örökletes hemochromatosisban [5]. Mind a réz, mind a vas az oxidatív stressz katalizátora, ezért olyan koncentrációban citotoxikus, amely meghaladja a sejt és a szervezet azon képességét, hogy „kísérje” ezeket a redox-aktív átmeneti fémeket [6, 7]. Különösen a vas felhalmozódása nagyjából idiopátiás; Valójában a vasszint növekedése az öregedő agy fémjelzi [8–10]. Patológiailag ez az agyi vasfelhalmozódás a vasanyagcserével nem kapcsolatos gének mutációinak jellemzője [11–15], valamint számos más neurodegeneratív betegség, amelyek közül néhányban hiányzik a specifikus genetikai kapcsolat, például az öregedés [16], az Alzheimer-kór [16]. 17], Friedreich-ataxia [18] és Parkinson-kór [19]. Az ilyen rendellenességek csoportjaként az agyi vasfelhalmozódással (NBIA) járó neurodegenerációnak tekinthetők, bár ez a mozaikszó általában azokra korlátozódik, amelyeknél genetikai kapcsolatot azonosítottak [11, 13, 14].

Vastúlterhelés esetén a cél a szervezet „megtisztítása” a felesleges vastól a sejt vasfelvételének vagy kiáramlásának hibája miatt. Itt a cél az, hogy a fiziológiás vaskelátképzőket felülmúlják a gyógyszerrel; egy jó farmakokinetikával és a vashoz való nagy affinitással rendelkező vegyület a célgyógyszer. Mivel a szervezet túlságosan tele van az alapvető fémekkel, kevés aggodalomra ad okot, hogy a kezelés során hiányt idézzen elő. Az agyi betegségek vaskelátképző terápiával történő kezelése más stratégiát igényel. Ez nem a szisztémás vas-túlterhelés, hanem a vas felhalmozódása a patológiás területeken, és káros következményekkel jár. Az életkorral összefüggő vasfelhalmozódás például Parkinson-kórban (PD) potenciálisan hozzájárul az oxidatív stresszel összefüggő sejtkárosodáshoz [20]. A túlzott mértékű labilis vas elősegíti a -synuclein hibás feltekeredését a substantia nigrális neuronokban. A nagy affinitású kelátképzők használata az agy vasterhelésének némi csökkenéséhez vezethet, de minden bizonnyal vashiányt idéz elő, amely legalábbis az idős populációban ellenjavallt, tekintettel az adott korcsoportra jellemző szisztémás vashiányra [21]. . Az optimális affinitással rendelkező kelátképző potenciálisan csökkentheti a vas felhalmozódását, valamint az ezzel járó oxidatív stresszt a túlzott labilis vas és az alapbetegségek miatt.

Cistanche tubulosaésCistanche hatásai

Az egyik kelátképző, amelyet a transzfúzió által kiváltott vastúlterhelés kezelésére engedélyeztek talaszémiás betegeknél, a deferipron (DFP, Ferriprox márkanév) [5, 22]. A DFP-t Friedreich-ataxia [23] és Parkinson-kór [24, 25] kezelésére is alkalmazták. Egy metaanalízis kimutatta, hogy a DFP jelentős mértékben csökkenti a szívizom vastartalmát, és nagyobb szívvédelmet biztosít talaszémiás betegeknél, mint a deferoxamin, a klasszikus vaskelátképző szer [5]. Másrészt a DFP gyorsan metabolizálódik a májban [26], és újabb kutatások kimutatták, hogy a vasfüggő hiszton lizin-demetilázok aktív helyén kelátot képez a Fe2 pluszban, amely aktivitás korrelál egy korábban fel nem ismert citotoxicitással [27]. Ez a megállapítás rávilágít a vaskelátképző terápia alkalmazásának kulcsfontosságú korlátaira, nevezetesen a gyógyszer versengésére a fiziológiailag esszenciális vasért, akár vasraktárban, akár egy protetikus vasfajtát tartalmazó fehérjében. Ennek ellenére a DFP például hatékonynak bizonyult a Parkinson-kór 2. fázisú vizsgálati kezelésében, amit mind analitikus (csökkent agyi vasterhelés a T2- súlyozott MRI-vel), mind viselkedési mutatók (kognitív és motoros neuronok működése) mutatnak [ 24, 25].

A DFP Fe3 plus iránti affinitása azonban továbbra is aggodalomra ad okot. A stabil DFP-vasfaj a trisz-komplex, [Fe(DFP)3] 0 [28]. Míg ennek a komplexnek a semlegessége ideális a vas mobilizálására a sejtből, a stabilitási állandó (~1037) a DFP-t igazi vasfogóvá teszi; ebben az összefüggésben egy vasenzim, például a lizin-demetiláz gátlása megjósolható [27]. Ez az aggodalom azt tükrözi, hogy olyan vaskelátképzőket kell kifejleszteni, amelyek rendelkeznek a DFP membránpermeabilitásával, de lényegesen gyengébb affinitást mutatnak mind a Fe2 plus, mind a Fe3 plus iránt. Ez utóbbi tulajdonság korlátozza a protézisfémek gyógyszerelszívását és a kelátképző ágens termodinamikai potenciálját, hogy katalizálja a vas (vas) autooxidációját, amely reaktív oxigénfajták képződését eredményezi. Lényegében az erős vas-vas kelátképzők katalizálják a Fe2 plus prooxidáns tulajdonságát [29]. Ebben a tanulmányban beszámolunk arról, hogy egy ilyen, mérsékelt vas- és vas-affinitással rendelkező vaskelátor hogyan modulálja a vas áramlását a vér-agy gátat (BBB) ​​alkotó agyi mikrovaszkuláris endoteliális sejtekben.

Cistanche tabletták

Ez a gyógyszer, PBT434 [5,7-diklór-2-((metilamino)metil)-8-hidroxi-3-metilkinazolin-4 (3H)-on, 1A. ábra] , bisz-vas komplexet képez, amelynek logaritmikus stabilitási állandója ~11 és ~15 Fe esetében^{2 plusz}és Fe^{3 plusz}, illetve [30]. A PBT434 megakadályozta a substantia nigra pars compacta (SNpc) neuronok elvesztését, csökkentette a nigrális szinuklein felhalmozódást, csökkentette a PD-betegség modelljéhez kapcsolódó vastartalmat a középagyban, és megmentette a motoros teljesítményt a Parkinson-kór két egérmodelljében a szisztémás vasraktárak nyilvánvaló kimerülése nélkül. [30]. A PBT434 a Multiple System Atrophia (MSA) egérmodelljeiben is hatékony [30, 31]. Ez a motoros rendellenesség megjelenésében hasonló a Parkinson-kórhoz, de amelyet a szinuklein hibás feltekeredése és ezt követő felhalmozódása jellemez, ami glia citoplazmatikus zárványok kialakulását okozza. a betegség patológiája [32]. Jelentős, hogy a PBT434 csökkentette az oxidatív stressz markereit az egér PD modellekben [30], ami azt jelzi, hogy 1) a PBT434 megcélozta azokat a vasraktárakat, amelyek egyébként prooxidánsként működtek, és 2) a PBT434 nem fokozta ezt a kialakulóban lévő oxidáción alapuló citotoxicitást. A PBT434 kielégítően fejezte be az 1. fázisú vizsgálatot [33].

Az itt bemutatott munka célja annak vizsgálata volt, hogy a PBT434 milyen hatással van az agy gátsejtekben történő vaskereskedelemre, a mikrovaszkuláris endotélsejtekre, amelyek a mögöttes gliasejtekkel együtt alkotják a vér-agy gátat. Ezek a vizsgálatok jól validált immortalizált endothel sejtvonalat használtak mind egyrétegű, mind transzwell tenyészet formátumban [34–37]. E vizsgálatok elsődleges célja az volt, hogy meghatározzák a vasfelvétel és -kiáramlás kinetikáját ezekből a sejtekből, valamint ezek PBT434 általi modulációját. A transzwell BBB modellt arra is használták, hogy demonstrálják a kétirányú PBT434 transzcelluláris fluxust az endotélsejt gáton keresztül. A modell molekuláris értelemben kimutatta, hogy a PBT434 gátolja a vasfelvételt kelátképzéssel, miközben serkenti a vas kiáramlását. A sejtképalkotási vizsgálatok azt mutatják, hogy a PBT434 ugyanahhoz a labilis vaskészlethez fér hozzá, amelyet klasszikus Fe-vel vizsgáltak.^{2 plusz}kelátképző ágens, 2,2'-bipiridin vagy bipiridil, valamint egy fluoreszcens szonda a vas vashoz. Az eredmények a PBT434 lehetséges hatásmechanizmusára utalnak, amely magában foglalja a szisztémás vas felvételének gátlását a BBB-ben, és ezt követően az agyi vas megkötését az intersticiális térben.

Eredmények

1. A PBT434-nek nincs citotoxikus hatása az agyi mikrovaszkuláris endotélsejtekre

A PBT434 munkakoncentrációinak megfelelő tartományának meghatározásához in vitro sejttenyészetünkben az MTT vizsgálatot használtuk a hBMVEC mitokondriális funkciójának monitorozására a PBT434-re adott válaszként. Korábbi jelentések [30] alapján PBT434 koncentrációtartományban kezelték 100 μM-ig 24 órán keresztül. Nem tapasztaltunk szignifikáns változást a hBMVEC életképességében egyetlen vizsgált koncentrációnál sem (2. ábra).

2. A PBT434 gyorsan felszívódik és átjut a hBMVEC gáton

A PBT434 egy orálisan biológiailag hozzáférhető gyógyszer, amely könnyen behatol a BBB-be, amint az egereken és embereken végzett vizsgálatokból is kiderül [30, 38, 39]. Monitoroztuk a PBT434 felhalmozódását egyrétegű hBMVEC-ben, radioaktív nyomkövetőként 14C-vel jelölt PBT434-et használva. Az adatok azt mutatták, hogy az első fázisban a 14C-PBT434 gyorsan egyensúlyba került a felvételi közeg és a sejt között. Ezt a kezdeti felvételt további lassú felhalmozódás követte 3 órán keresztül, amely 30,1 ± 9,8 pmol/mg/h sebességet mutatott (3A. ábra). A felvételi protokollban a felvételt leállítjuk, és a sejteket 4 °C-on mossuk a 14C-PBT434 felhalmozódása céljából történő feldolgozás előtt (Módszerek). Egy külön kísérletben megvizsgáltuk a 14C-PBT434 kiáramlását a hBMVEC-ből 30 perces töltési periódus után. Az efflux protokoll szerint a sejteket 25 °C-on mossuk. A 3B. ábra adatai azt mutatják, hogy a 25 °C-os mosás során a sejtben felhalmozódott 14C-PBT434 körülbelül 92 százaléka elveszett (vö. 550 pmol 14C-PBT434/mg fehérje a 3A-ban 30 percnél és 43 pmol 14C-PBT34343434). fehérje t=0-nál a 3B-ben). A fennmaradó 14C-PBT434 további lassú vesztesége (3B. ábra). Az adatok a PBT434 hBMVEC általi felhalmozódásának és kiáramlásának két aspektusára utalnak. A plazmamembránon áthaladó fluxus gyorsan eléri az egyensúlyi állapotot, akár a felvétel, akár a kiáramlás során. Azonban mindkét folyamatban megjelenik egy másik lassabb folyamat. Ez arra utal, hogy a sejten belül a PBT434 sejt egy része olyan lokális/állapotban van, amely kinetikai egyensúlyi kapcsolatban van az extracelluláris közeggel egyensúlyban lévő frakcióval. A 3B. ábrán látható kinetikai analízis becslése szerint a PBT434 ezen készletét 27±4 pmol/mg fehérje képviseli a sejtlizátumban, amikor a sejteket 20 μM reagenssel kezelték.

A PBT434 transzcelluláris fluxusának vizsgálatához egy jól validált in vitro BBB modellt alkalmaztunk, melyben a transzwell membrán apikális oldalán növesztettük [35, 36, 40, 41]. Ezeknek a transzwell-tenyészeteknek a barrier tulajdonságait a transzendoteliális elektromos ellenállás (TEER) és a FITC-jelölt dextránnal szembeni átjárhatatlanságuk mennyiségi meghatározásával ellenőriztük (S1 ábra). Összehasonlítottuk a 14C-PBT434 felvételét a luminalis (vagy apikális, véroldalon) (4A. ábra) az abluminális (vagy bazolaterális, agyi oldali) membrán felvételével (4C. ábra). Ugyanebben a kísérletben a megfelelő kiáramlást (transzcelluláris fluxust) a 14C-PBT434 kiáramlási kamrában való megjelenésével határoztuk meg (4. ábra B és D panelek). E folyamatok sebességét az 1. táblázat tartalmazza. A 4. ábrán látható tömegadatok (B és D panelek) azt mutatják, hogy a PBT434 nettó fluxusa ezen a modell vér-agy gáton át mindkét irányban azonos volt. A bazális kamrában 976±185 pmol 14C-PBT434 halmozódott fel (4B. ábra), és 1033±210 pmol a bazális kamrában (4D. ábra). Ez a közeli ekvivalencia a PBT434 kiáramlásának közel hasonló sebességében is megmutatkozott a két gátmembránon (1. táblázat). Azonban ebben a gátmodellben a PBT434 szignifikánsan nagyobb volt a bazolaterális membránon, amit a bazális kamrából származó kb. 50%-kal nagyobb vegyületveszteség szemléltet (4C. ábra), ami kb. 40%-kal nagyobb látszólagos sejtfelvételnek felel meg. (Asztal 1). A robusztusabb felvétel várhatóan nagyobb felhalmozódást eredményez. A sejtek 3 órás elemzése azt mutatta, hogy a fluxus irányától függetlenül ~6 μM PBT434-et tartottak meg. Az értékek 8,1±1,3 μM (apikálistól bazálisig) és 4,7±1,2 μM (bazálistól apikálisig) voltak. Amint fentebb megjegyeztük, ez az elemzés a sejtek lízis előtti mosását, valamint a teljes sejtfehérje és a 14C-PBT434 mennyiségi meghatározását követi. Ezenkívül az apikális kamrában lévő tápközeg RPMI-t, plusz 10% FBS-t és 10% NuSerum-ot tartalmazott, míg a bazális, „agykamra” csak RPMI-t (Módszerek) tartalmazott. Egy ésszerű következtetés az volt, hogy a bazális membránnál tapasztalható nagyobb „felvétel” a PBT434 sejtfelszíni adszorpcióját tükrözte, amelyet az apikális kamrában korlátoztak a szérumban lévő fehérjekomponensek. A sejteknek a PBT434 felhalmozódása céljából történő mosása után ezt az adszorbeált anyagot (amely „felvételként” regisztrálták) eltávolítottuk. A fluxuskísérlet megismétlése, de az alapkamrában lévő szérummal azt mutatta, hogy a szérum valóban elnyomta ezt a valószínű sejtfelszíni PBT434 adszorpciót (S2 ábra).

3. A PBT434 a bipiridiltől eltérően nem korlátozza a labilis vas intracelluláris hozzáférhetőségét

Mivel a PBT434 mérsékeltebb affinitással rendelkezik a vashoz, mint a klasszikus vaskelátképzők, például a deferipron vagy a bipiridil, megvizsgáltuk, hogy ez a különbség hogyan tükröződik a PBT434-hatásban a hBMVEC celluláris labilis vaskészletére (LIP). Ehhez kihasználtuk az áteresztő, Fe^{2 plusz}-specifikus fluoreszcens festék FerroOrange, amely reagál a jótékony citoplazmatikus vassal. A bipiridillal kezelt sejtekben a fluoreszcencia szignifikáns ablációját láttuk, ami összhangban van a LIP e nagy affinitású vas-kelátképző kelátképzésével, és így blokkolja a fluoreszcens vasindikátor hatását (5A. ábra). Ezzel szemben a PBT434 nem versenyzett a FerroOrange-szal a Fe-ért^{2 plusz}, mérsékeltebb affinitásának megfelelő viselkedés [30]. Az eredmények azt mutatták, hogy a PBT434, de a PBT434-met inaktív származéka nem, 34 ± 9 százalékos növekedést indukált a FerroOrange által hozzáférhető vasban.^{2 plusz}arra utal, hogy ez a kelátképző szer mobilizálta a vasat a sejtben anélkül, hogy egyidejű toxicitást okozott volna. Az alábbiakban bemutatott adatok arra utalnak, hogy ez a vas a ferritinből származik.

Korábban kimutatták, hogy a PBT434 visszaállítja a kimerült ferroportin fehérje expressziót MPTP-vel kezelt egerekben a nem sérült egerekéhez hasonló szintre [30]. Ez az eredmény, valamint a PBT434-re adott válaszként az intracelluláris vas-vas festődés növekedése potenciális hatást feltételez a celluláris vas válaszrendszerére és a vashoz kapcsolódó fehérjék működésére. Ennek felmérésére először kvantitatív PCR (qPCR) analízist végeztünk a PBT434 hatásának számos vaskezelő fehérje transzkriptumainak mennyiségére gyakorolt ​​​​hatására (6. ábra). Míg a vaskiáramlás fehérje, a ferroportin (Fpn) és a két citoplazmatikus vaschaperon, a PCBP1 és a 2 transzkriptumai nem változtak, a transzferrin receptor (TfR) és a ferroxidáz, a ceruloplazmin (Cp) mRNS-einek bősége igen. változás. A TfR és Cp transzkriptumok 2,8, illetve 3.{13}}szeresére nőttek. A transzferrin receptor (TfR) expressziója a vas-reszponzív elem (IRE)/vasszabályozó fehérje (IRP) rendszerhez kapcsolódik [42–44]. A TfR mRNS növekedése arra utal, hogy a PBT434 verseng a PCBP1-függő vasszállítással a Fe, S klaszter összeállításában, amely a szabályozó IREBP-t RNS-kötő fehérjéből citoszol akonitázzá alakítja [45]. Így a PBT434 ezt a szabályozó modulációt az RNS-kötés és a TfR mRNS lebomlásának megfelelő gátlása felé tolja el. A sejt vashiányában a Cp expresszióját részben a HIF-1 szabályozza [46]. A HIF-1 funkció növekedése annak következménye, hogy a hidroxileződést a prolil-hidroxiláz aktivitással leállítják egy vasfüggő reakcióban [47]. Az IREBP-hez hasonlóan úgy tűnik, hogy a PBT434 csökkenti a vaskészletet, amely a HIF-1 hidroxilációjában és lebontásában kofaktorként szolgál. Ebben a modellben ennek a transzkripciós aktivátornak a steady-state szintjének növekedése növeli a Cp transzkripciót.

ELISA analízis és Western blot kombinációjával megvizsgáltuk a vas-kezelõ fehérjék expresszióját PBT434-ben vagy PBT434-mettel kezelt hBMVEC-ben; A WB-analízis példái a 7A. ábrán láthatók. Az adatok azt mutatták, hogy a TfR monomer és dimer mennyisége szignifikánsan megnőtt 24 órával, csakúgy, mint a Cp (7B. és 7C. ábra). Mindkét növekedés párhuzamos volt a megfelelő transzkriptumok PBT434-függő növekedésével (6. ábra). Ezzel szemben a vaskiáramlási fehérje, az Fpn expressziója érzéketlen volt a PBT434 kezelésre (7D. ábra).

Kiegészítő módszerként ELISA-t használtunk a Western blot adatok által jelzett fold-változások számszerűsítésére. Így a hBMVEC-t PBT434-gyel kezeltük 24 órán át, és a sejtlizátumokat ELISA-val vizsgáltuk TfR-re (8A. ábra). A TfR-nek a PBT434-kezelésre adott válaszában ELISA-val számszerűsített többszörös növekedése ekvivalens volt a Western-blot-analízissel kapott értékkel (7B. ábra). ELISA-t is alkalmaztunk a szekretált és GPI-hez kötött Cp fehérje mennyiségének meghatározására, pozitív kontrollként HepG2 sejteket használva. A tápközegbe szekretált Cp tekintetében ez a megközelítés korlátozott volt, mivel az sCp mennyisége mind a HepG2, mind a hBMVEC kondicionált tápközegben a vizsgálat alsó érzékenységi határa alatt volt (S3 ábra). Ez azonban lehetővé tette a GPI-Cp abundancia értékelését. Ebben a módszerben a sejteket foszfatidil-inozitol-specifikus foszfolipáz C-vel (PI-PLC) kezeltük, amely lehasítja a GPI horgonyját; az így kondicionált tápközeget koncentráltuk és Cp-ELISA-val analizáltuk. Noha ez a megközelítés azt mutatta, hogy a PBT434 növelte a GPI-Cp mennyiségét a HepG2 sejtekben, ismét nem sikerült kimutatnia a PI-PLC által felszabaduló Cp-t (8B. ábra). Az ELISA közvetlen módszert is kínált a ferritin mennyiségi meghatározására. Ennek érdekében a hBMVEC-t 1 uM Fe-citráttal töltöttük fel 24 órán át, majd további 1 órán keresztül kezeltük PBT434 nélkül vagy jelenlétében. A kapott sejtlizátumokat ferritinre vonatkozó ELISA-analízisnek vetettük alá (8C. ábra). A TfR növekedésével ellentétben a PBT434 kezelés a ferritin (Ft) fehérjét körülbelül 18 százalékkal lenyomta. Valójában ez a Ft fehérje elvesztése már 1 órás reagens kezelés után nyilvánvaló volt. Ennek az eredménynek az időbeli természete korrelálható a jótékonysági Fe2 plusz fent említett növekedésével, miután 30 perces PBT434-kezelést végeztünk. Amint azt a későbbiekben tárgyaltuk, a ferritin leütését más sejtpermeáns Fe2 plusz kelátképző szerekkel végzett kezelés után is kimutatták [48].

4. ⁵⁵Fe^{2 plusz}a felvételt gátolja a PBT434-gyel való komplexképződés

Tekintettel a PBT434 gyors kiegyensúlyozására hBMVEC-ben 30 percen belül, összehasonlítva a Fe2 plusz 24 órán keresztüli lassú, kétfázisú felvételével és kiegyensúlyozásával [49], azt feltételeztük, hogy a PBT434 és a Fe2 plus nem rendelkezik ugyanazzal a felvételi mechanizmussal. Ennek tesztelésére az egyrétegű rétegeket radioaktívan jelölt 55Fe2 plusszal inkubáltuk PBT434 vagy PBT{10}}met hiányában vagy jelenlétében, és az 55Fe2 plusz felvételét 3 órán keresztül követtük (9A. ábra). A PBT434 szignifikánsan csökkentette az 55Fe2 plusz felvétel sebességét, valamint csökkentette az 55Fe2 plusz általános felhalmozódását a sejtlizátumokban (9C. ábra). Ez a hatás nem volt látható a PBT{21}}met esetében. A PBT434 és az 55Fe-felvételi arányok összehasonlítása azt mutatja, hogy a PBT434 és a Fe2 plus külön szállítási utak veszik fel. Ezenkívül az 55Fe-felvétel gátlása PBT434 jelenlétében, de PBT{30}}met nem, arra utal, hogy egy extracelluláris PBT434-vaskomplex nem liganduma a hBMVEC-ben található vas-vas transzportereknek, nevezetesen a ZIP8-nak. ZIP14.

Cistanche kiegészítők

A PBT434 vas-felhalmozódásban betöltött szerepének további vizsgálatához megvizsgáltuk, hogy az előzetes expozíció milyen hatással volt az 55Fe2 plusz felvételére. A PBT434-gyel előkezelt sejtek, amelyeket mosás után 55Fe2 plusz hatásnak tettek ki, 3 óra elteltével megnövekedett az 55Fe2 plusz felvételi sebessége és felhalmozódása (9. ábra, B és D panel). Ez a megnövekedett felhalmozódás legalább 24 órán át fennmaradt. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a sejtek előzetes PBT434-nek való kitétele átmenetileg fokozza a vasfelvételt. Váratlanul a PBT{14}}met előkezelés is növekedést mutatott mind a felvételben, mind a felhalmozódásban (9B. ábra), de ez a hatás nem volt olyan jelentős vagy tartós, mint a PBT434 esetében.

Kimutattuk, hogy az 59Fe-transzferrinből származó vas felvételét támogatja a ferri-redukció és a ferro-permeáció a has plazmamembránján [50, 51]. Az egyik kísérleti eredmény a TBI vasfelvételi modell alátámasztására az volt, hogy ezt a vasfelvételt az extracitoplazmatikus ferrireduktáz aktivitás gátlása révén csökkentették; egy másik eredmény a TBI vasfelvétel 60%-os gátlása volt a ferrozin, egy erős vas-vas kelátképző szer által [50]. Ez utóbbi stratégiát használták annak bizonyítására, hogy a PBT434, de a PBT{10}}nem találkozott, szintén gátolta a TBI vasfelvételét (10. ábra).

5. A PBT434 stimulálja az Fpn-függő 55Fe2 plusz kiáramlást

A PBT434 a deferipron azon képességének körülbelül 20 százalékával rendelkezik, hogy a Fe2 és az idegsejtekből való kiáramlás látszólagos stimulálását idézi elő [30]. Megvizsgáltuk az 55Fe2 plusz kiáramlását a hBMVEC-ből PBT434 hiányában vagy jelenlétében kontrollsejtekben vagy mini-hepcidinnel, PR73-mal kezelt sejtekben. A hepcidin egy peptidhormon, amely szisztémásan és az agy interstitiumában is megtalálható, és amely az Fpn-hez kötődik, és a transzportert célozza meg a lebontás érdekében. A hepcidinnek az Fpn vasexport funkciójára gyakorolt ​​hatását alaposan tanulmányozták [52–54]. Korábban kimutattuk, hogy a Fe2 plusz hBMVEC-ből való kiáramlása Fpn-függő [35, 49]. A PR73 EC50 értéke ~4 nM az Fpn lebomlására GFP riporter vizsgálatban [55]. Az egyrétegű hBMVEC-et 55Fe2 plusz-val töltöttük fel 24 órán keresztül PR73 hiányában vagy jelenlétében. Az 55Fe-kiáramlást ezután 5 órán keresztül kvantifikáltuk PR73 folyamatos hiányában vagy jelenlétében, a PBT434 hiányával és jelenlétével kombinálva (11. ábra). Míg a PR73 mind a kontroll, mind a PBT{31}}kezelt tenyészetből leütötte az 55Fe kiáramlást, a PBT434 részben elnyomta a mini-hepcidin miatti gátlást. PBT434 hiányában a PR73-kezelt tenyészetekből a vaskiáramlás ~75%-kal csökkent, míg a PBT434-kezelt tenyészetekben csak ~50% volt (11. ábra és 2. táblázat). Ezekből az eredményekből két következtetés vonható le. Először is, az Fpn PR73 általi leállítása leszabályozza az 55Fe-kiáramlást PBT434 jelenlétében és hiányában. Másodszor, mindkét esetben a PBT434 támogatja a vaskiáramlás jelentős, bár kismértékű stimulálását.

Hivatkozások

1. Hatcher HC, Singh RN, Torti FM, Torti SV. Szintetikus és természetes vaskelátképzők: terápiás potenciál és klinikai felhasználás. Future Med Chem. 2009; 1(9):1643–70.

2. Nuñez MT, Chana-Cuevas P. New Perspectives in Iron Chelation Therapy for the Treatment of Neurodegenerative Diseases. Gyógyszeripar (Bázel). 2018; 11(4):109.

3. Tosato M, Di Marco V. Fémkelációs terápia és Parkinson-kór: A releváns fémionok és az ígéretes vagy ismert gyógyszerek közötti komplex képződés termodinamikájának kritikai áttekintése. Biomolekulák. 2019; 9. (7) bekezdése alapján.

4. Hedera P. Frissítés a Wilson-kór klinikai kezeléséről. App Clin Genet. 2017; 10:9–19.

5. Xia S, Zhang W, Huang L, Jiang H. A deferoxamin, a deferiprone és a deferasirox összehasonlító hatékonysága és biztonságossága súlyos thalassemia esetén: 16 randomizált kontrollált vizsgálat metaanalízise. PLoS One. 2013; 8(12):e82662.

6. Buettner GR, Jurkiewicz BA. Katalitikus fémek, aszkorbát és szabad gyökök: kerülendő kombinációk. Radiat Res. 1996; 145(5):532–41. PMID: 8619018

7. Singh A, Kukreti R, Saso L, Kukreti S. Oxidative Stress: A Key Modulator in Neurodegenerative Diseases. Molekulák. 2019; 24. (8) bekezdése alapján.

8. Ashraf A, Clark M, So PW. A vasember öregedése. Front Aging Neurosci. 2018; 10:65.

9. Ghadery C, Pirpamer L, Hofer E, Langkammer C, Petrovic K, Loitfelder M és munkatársai. R2* leképezés az agyi vas számára: asszociációk a kognícióval a normál öregedés során. Neurobiol öregedés. 2015; 36(2):925–32.

10. Zecca L, Youdim MBH, Riederer P, Connor JR, Crichton RR. A vas, az agy öregedése és a neurodegeneratív betegségek. Nat Rev Neurosci. 2004; 5(11):863–73.

11. Di Meo I, Tiranti V. Az NBIA szindrómák osztályozása és molekuláris patogenezise. Eur J Paediatr Neurol. 2018; 22(2):272–84.

12. Levi S, Finazzi D. Neurodegeneráció agyi vasfelhalmozódással: frissítés a patogén mechanizmusokról. Front Pharmacol. 2014; 5:99–.

13. Levi S, Tiranti V. Neurodegeneráció agyi vasfelhalmozódási zavarokkal: Értékes modellek, amelyek célja a vaslerakódás patogenezisének megértése. Gyógyszeripar (Bázel). 2019; 12. (1) bekezdése alapján.

14. Meyer E, Kurian MA, Hayflick SJ. Neurodegeneráció agyi vasfelhalmozódással: genetikai sokféleség és patofiziológiai mechanizmusok. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015; 16:257–79.

15. Tonekaboni SH, Mollamohammadi M. Neurodegeneráció agyi vasfelhalmozódással: áttekintés. Iran J Child Neurol. 2014; 8. (4):1–8. PMID: 25657764

16. Cozzi A, Orellana DI, Santambrogio P, Rubio A, Cancellieri C, Giannelli S és mások. A neuroferritinopátia őssejt-modellezése feltárja, hogy a vas az öregedés és a ferroptózis meghatározója a neuronok öregedése során. Őssejtjelentések. 2019; 13(5):832–46.

17. Liu JL, Fan YG, Yang ZS, Wang ZY, Guo C. Vas- és Alzheimer-kór: a patogenezistől a terápiás következményekig. Front Neurosci. 2018; 12:632.

18. Llorens JV, Soriano S, Calap-Quintana P, Gonzalez-Cabo P, Molto MD. A vas szerepe Friedreich ataxiájában: Az emberi szövetekkel, valamint a sejt- és állatmodellekkel kapcsolatos tanulmányok betekintése. Front Neurosci. 2019; 13:75.

19. Puschmann A. Örökletes Parkinson-kórt vagy Parkinson-kórt okozó új gének. Curr Neurol Neurosci Rep. 2017; 17. (9):66.

20. Crielaard BJ, Lammers T, Rivella S. Vas-metabolizmus megcélzása a gyógyszerkutatásban és -szállításban. Nat Rev Drug Discov. 2017; 16 (6): 400–23.

21. Guralnik JM, Eisenstaedt RS, Ferrucci L, Klein HG, Woodman RC. A vérszegénység előfordulása 65 éves és idősebb személyeknél az Egyesült Államokban: bizonyíték a megmagyarázhatatlan vérszegénység magas arányára. Vér. 2004; 104 (8): 2263–8.

22. Pepe A, Meloni A, Capra M, Cianciulli P, Prossomariti L, Malaventura C és mások. Deferasirox, deferipron és dezferrioxamin kezelés thalassemiás betegekben: a szív vas és a funkció összehasonlítása kvantitatív mágneses rezonancia képalkotással. Haematologica. 2011; 96 (1):41–7.

23. Pandolfo M, Arpa J, Delatycki MB, Le Quan Sang KH, Mariotti C, Munnich A és társai. Deferipron Friedreich ataxiában: 6-hónapos randomizált, kontrollált vizsgálat. Ann Neurol. 2014; 76(4):509–21.

24. Martin-Bastida A, Ward RJ, Newbould R, Piccini P, Sharp D, Kabba C és társai. Agyi vaskelátképzés deferipron által a 2. fázisú randomizált, kettős vak, placebo-kontrollos klinikai vizsgálatban Parkinson-kórban. Sci Rep. 2017; 7(1):1398.

25. Devos D, Moreau C, Devedjian JC, Kluza J, Petrault M, Laloux C és mások. A vaskelát megcélzása terápiás módszerként a Parkinson-kórban. Antioxid redox jel. 2014; 21(2):195–210. https://doi. org/10.1089/ars.2013.5593 PMID: 24251381

26. Singh S, Epemolu RO, Dobbin PS, Tilbrook GS, Ellis BL, Damani LA és mások. Az 1,2-dimetil- és 1,2-dietil-szubsztituált 3-hidroxi-piridin-4--ok vizelet metabolikus profilja emberekben és patkányokban. Droganyagcsere és hajlam. 1992; 20(2):256. PMID: 1352218

27. Khodaverdian V, Tapadar S, MacDonald IA, Xu Y, Ho PY, Bridges A, et al. Deferipron: Pán-szelektív hiszton-lizin-demetiláz gátlási aktivitás és szerkezeti aktivitás kapcsolati vizsgálat. Sci Rep. 2019; 9(1):4802.

28. Hider R. A legújabb fejlesztések középpontjában az orálisan aktív vaskelátképzők álltak. Thalassemia jelentések. 2014; 4 (2).

29. Kosman DJ. Vas anyagcsere aerobokban: a vas-vas hidrolízis és a vas-vas autooxidáció kezelése. Coord Chem Rev. 2013; 257 (1): 210–7.

30. Finkelstein DI, Billings JL, Adlard PA, Ayton S, Sedjahtera A, Masters CL és munkatársai. Az új PBT434 vegyület megakadályozza a vas által közvetített neurodegenerációt és az alfa-synuclein toxicitást a Parkinson-kór több modelljében. Acta Neuropathol Commun. 2017; 5(1):53.

31. Heras-Garvin A, Refolo V, Schmidt C, Bradbury M, Stamler D, Stefanova N, szerkesztők. A PBT434 megőrzi a dopaminerg neuronokat, csökkenti az alfa-synuclein oligomerizációt és javítja a motoros működést egy transzgénikus egér többszörös rendszerű atrófia modellben. Annals of Neurology; 2020: Wiley 111 River St, Hoboken 07030–5774, NJ USA.

32. Heras-Garvin A, Stefanova N. MSA: Az alapvető mechanizmusoktól a kísérleti terápiákig. Parkinsonizmussal kapcsolatos rendellenesség. 2020; 73:94–104.

33. Dawson VL, Dawson TM. Ígéretes betegségmódosító terápiák a Parkinson-kór kezelésére. Tudomány Translációs gyógyászat. 2019; 11(520):eaba1659.

34. Eigenmann DE, Xue G, Kim KS, Moses AV, Hamburger M, Oufir M. Négy immortalizált humán agyi kapilláris endothel sejtvonal, a hCMEC/D3, hBMEC, TY10 és BB19 összehasonlító vizsgálata és a tenyésztési körülmények optimalizálása egy in vitro vér-agy gát modell gyógyszer-permeabilitási vizsgálatokhoz. A központi idegrendszer folyadékai és akadályai. 2013; 10. (1):33.

35. McCarthy RC, Kosman DJ. A gliasejtek ceruloplazminja és hepcidinje eltérően szabályozza a vas kiáramlását az agyi mikrovaszkuláris endotélsejtekből. PLoS One. 2014; 9(2):e89003.

36. Steimle BL, Smith FM, Kosman DJ. A ZIP8 és ZIP14 oldott anyag hordozók szabályozzák a mangán felhalmozódását az agy mikrovaszkuláris endothel sejtjeiben, és szabályozzák az agy mangánszintjét. J Biol Chem. 2019; 294(50):19197–208.

37. Stins MF, Badger J, Sik Kim K. Bakteriális invázió és transzcitózis transzfektált humán agy mikrovaszkuláris endothelsejtekben. Microb Pathog. 2001; 30. (1):19–28.

38. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. A PBT434, a szinuklein aggregáció új kis molekula gátlója (S4.001) humán tanulmányában először. Ideggyógyászat. 2019; 92(15. kiegészítés):S4.001.

39. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. A PBT434, a szinuklein aggregáció új kis molekula gátlója, 1. fázisú vizsgálata felnőtt és idősebb felnőtt önkénteseknél (4871). Ideggyógyászat. 2020; 94(15. kiegészítés):4871.

40. McCarthy RC, Kosman DJ. A C6 glioblasztóma sejt ceruloplazmin expressziójának aktiválása a szomszédos emberi agyi endotéliumból származó interleukinekkel egy in vitro vér-agy gát modellrendszerben. Cell kommunikáció és jelzés: CCS. 2014; 12:65.

41. McCarthy RC, Park YH, Kosman DJ. Az sAPP modulálja a vas kiáramlását az agyi mikrovaszkuláris endothel sejtekből azáltal, hogy stabilizálja a vas-exportőr ferroportint. EMBO jelentések. 2014; 15(7):809–15. https://doi. org/10.15252/embr.201338064 PMID: 24867889

42. Hentze MW, Muckenthaler MU, Galy B, Camaschella C. Two to Tango: Regulation of Mammalian Iron Metabolism. Sejt. 2010; 142. (1):24–38. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.06.028 PMID: 20603012

43. Zhou ZD, Tan EK. Vasszabályozó fehérje (IRP) - vas-reszponzív elem (IRE) jelátviteli útvonala humán neurodegeneratív betegségekben. Molekuláris neurodegeneráció. 2017; 12. (1):75. https://doi.org/10. 1186/s{10}} PMID: 29061112

44. Crichton RR, Dexter DT, Ward RJ. Az agyi vasanyagcsere és annak zavarása neurológiai betegségekben. J Neurális transzm. 2011; 118(3):301–14. https://doi.org/10.1007/s00702-010-0470-z PMID: 20809066

45. Patel SJ, Frey AG, Palenchar DJ, Achar S, Bullough KZ, Vashisht A és mások. A PCBP1-BolA2 chaperon komplex vasat szállít a citoszolos [2Fe-2S] klaszter összeállításához. Nat Chem. Biol. 2019; 15(9):872–81. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0330-6 PMID: 31406370

46. ​​Mukhopadhyay CK, Mazumder B, Fox PL. A hipoxia-indukálható faktor-1 szerepe a ceruloplazmin vashiányos transzkripciós aktiválásában. J Biol Chem. 2000; 275(28):21048–54.

47. Strowitzki MJ, Cummins EP, Taylor CT. Fehérje-hidroxiláció Hypoxia-indukálható faktor (HIF) hidroxilázokkal: egyedi vagy mindenütt jelen lévő? Sejtek. 2019; 8. (5) bekezdése alapján.

48. De Domenico I, Vaughn MB, Li L, Bagley D, Musci G, Ward DM és munkatársai. A ferritin vas ferroportin által közvetített mobilizálása megelőzi a ferritin proteaszóma általi lebomlását. Embo j. 2006; 25(22):5396–404.

49. McCarthy RC, Kosman DJ. Ferroportin és exocitoplazmatikus ferroxidáz aktivitás szükséges az agy mikrovaszkuláris endoteliális sejtjeiből történő vaskiáramlásához. The Journal of Biological Chemistry. 2013; 288(24):17932–40.

50. McCarthy RC, Kosman DJ. A BBB endoteliális sejtjei vasfelhalmozódásának mechanikai elemzése. Biofémek. 2012; 25(4):665–75.

51. Kosman DJ. A fémredukció és a metallooxidáció telói az eukarióta vas- és rézkereskedelemben. Metallomika. 2018; 10. (3):370–7. https://doi.org/10.1039/c8mt00015h PMID: 29484341

52. Aschemeyer S, Qiao B, Stefanova D, Valore EV, Sek AC, Ruwe TA és társai. A ferroportin szerkezet-funkció elemzése meghatározza a hepcidin kötőhelyét és egy alternatív hatásmechanizmusát. Vér. 2018; 131(8):899–910.

53. Ganz T, Németh E. Hepcidin és vas homeosztázis. Biochim Biophys Acta. 2012; 1823(9):1434–43.

54. Qiao B, Sugianto P, Fung E, Del-Castillo-Rueda A, Moran-Jimenez MJ, Ganz T és mások. A ferroportin hepcidin által kiváltott endocitózisa a ferroportin ubikvitinációjától függ. Cell Metab. 2012; 15(6):918–24.

55. Fung E, Chua K, Ganz T, Németh E, Ruchala P. A tiol-derivatizált minihepcidinek megtartják biológiai aktivitásukat. Bioorg Med Chem Lett. 2015; 25(4):763–6.

Danielle K. BaileyID, Whitney Clark, Daniel J. Kosman

Biokémiai osztály, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, New York Állami Egyetem, Buffalo, Buffalo, NY, Amerikai Egyesült Államok