1. rész: Újszerű megközelítés az endothel progenitor sejtek keringési potenciáljának javítására végstádiumú vesebetegségben szenvedő betegeknél

További információért. kapcsolatba lépnitina.xiang@wecistanche.com

Absztrakt: A keringő csontvelőből származó endoteliális progenitor sejtek (EPC) elősegítik az érrendszeri helyreállítást számos szervben, beleértve a vesét is, de a végstádiumban fokozatosan csökkennekvesebetegség(ESKD) betegek, ami korrelál a kardiovaszkuláris kimenetelekkel és a kapcsolódó mortalitással. Megállapítottuk tehát, hogy a humán csontvelőből származó mesenchymalis stromasejtek (BM-MSC) szövetreparatív hatásának fokozása a rekombináns humán relaxin (RLX) vasculogenic hatásaival elősegítheti-e az EPC proliferációt és működését. A CD34 plusz EPC-ket egészséges és ESKD-betegek véréből izoláltuk, a késői EPC-k kialakulásáig tenyésztettük, majd BM-MSC-eredetű kondicionáló tápközeggel (CM; 25% o), RLX-szel (1 vagy 10 ng/ml) vagy mindkettővel stimuláltuk. kombinált kezelések. Míg az RLX önmagában stimulálta az EPC proliferációt, a kapilláris tubusok képződését és a sebgyógyulást in vitro, ezeket az intézkedéseket gyorsabban és jelentősebben fokozta a BM-MSC-eredetű CM és az RLX együttes hatása egészséges és ESKD betegek EPC-jeiben. Ezeknek az eredményeknek fontos klinikai vonatkozásai vannak, mivel olyan új kombinációs terápiát azonosítottak, amely helyreállíthatja és javíthatja az EPC-számot és -funkciót ESKD-betegekben.

Kulcsszavak: endoteliális progenitor sejtek; végstádiumú vesebetegség; csontvelőből származó mezenchimális őssejtek; relaxin; sebgyógyulás; angiogenezis; regeneráció

Kattintson ide, ha többet szeretne megtudni az eladó cistanche-ról

1. Bemutatkozás

Krónikus vesebetegség(CKD) egy globális egészségügyi probléma, amelyet a glomeruláris filtrációs ráta (GFR) 60 ml/perc/1,73 m²-nél kisebb vagy azzal egyenlő csökkenéseként határoznak meg, ami gyakran végstádiumú (V. stádiumú) vesebetegséghez (ESKD) vezet. GFR kisebb vagy egyenlő, mint 15 ml/perc/1,73 m2)[2]. A CKD kóros jellemzői közé tartozik a tubuláris atrófia, amely a vesekapillárisok és podociták számának csökkenésével, a vese endothelsejtek pusztulásával és avesefibrózis[3,4]. E folyamatok során a vese endotéliuma károsodik, ami az angiogenezis és a vesefunkció károsodásához vezet [5]. Következővesekárosodás, a csontvelőből származó endoteliális progenitor sejteket (EPC) a sérülés helyére toborozzák, hogy megkönnyítsék a szövetek helyreállítását [6]. Az EPC-k kulcsszerepet játszanak a vese endothel sejtjeinek érésében és proliferációjában, a vaszkuláris integritásban és a sérült endotélium helyreállításában. A keringő EPC-számok azonban fokozatosan csökkennek az ESKD-s betegekben [7-9], ami korrelál a káros kardiovaszkuláris kimenetelekkel [9,10] és a hosszú távú mortalitással.

A mesenchymális stromasejtekről (MSC) számoltak be, hogy az EPC programozás stimulálásával elősegítik az angiogenezist. Míg azonban az MSC-ket különböző klinikai vizsgálatokban értékelték [13], a vese endotél regenerációját elősegítő képességüket nem vizsgálták. Laboratóriumunk legújabb tanulmányai kimutatták a humán csontvelőből (BM) származó MSC-k és egy antifibrotikus szer, nevezetesen a rekombináns humán(gén-2)relaxin (serelaxin; RLX[14) kombinálásának megnövelt terápiás potenciálját a javulás érdekében. vesekárosodás,gyulladásés fibrózis preklinikai betegségmodellekben. Míg az RLX önmagában serkentheti a humán vérből származó EPC proliferációt és a nitrogén-monoxid (NO) termelődését in vitro, valamint az egerekben az in vivo vaszkulogenezist[18], továbbra sem ismert, hogy a BM-MSC-kkel kombinált hatásai felgyorsíthatják és/vagy fokozhatják az EPC-t. származtatott angiogenezis és sebgyógyulás. Ez a tanulmány tehát értékelte az RLX és a BM-MSC-eredetű kondicionált tápközeg (CM) kombinálásának terápiás potenciálját az egészséges, illetve az ESKD betegektől származó EPC proliferáció, angiogenezis és in vitro sebgyógyulás terén.

2. Anyagok és módszerek

2.1. EPC izolálás és tenyésztés perifériás vérből

A páciens aláírt beleegyező nyilatkozatának kézhezvételekor körülbelül {{0}} ml vért gyűjtöttek az egészséges férfi kontrolloktól az Ausztrál Vöröskereszt Vérellátó Szolgálatától. Ezzel szemben a férfi ESKD-betegek véréből egészségi állapotuk miatt mindössze ~5 ml-t gyűjtöttek be a Monash Medical Centerből. Minden vérmintát a gyűjtést követő 24 órán belül feldolgoztunk. Minden vérmintát 1× Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldattal (HBSS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) hígítottunk 20 ml össztérfogatra. Ezután a vért óvatosan 15 ml Ficoll-Paque Plus-ra (GE Healthcare, Uppsala, Svédország) rétegeztük egy 50 ml-es Falcon csőbe (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), és 400-szor centrifugáltuk. g 40 percig szobahőmérsékleten, hogy a buffy coat elválassza a többi komponenstől a korábban leírt sűrűséggradiens elválasztási módszerrel [19,20]. A gradiens elválasztást követően a plazmát és a vérlemezkéket tartalmazó felső réteget szerológiai pipetta óvatos behelyezésével eltávolítottuk, így a perifériás vérből (PBMC) származó mononukleáris sejteket tartalmazó buffy coat zavartalan maradt, amely endothel progenitor sejtekből (EPC) állt. A pelletet 2 ml Endothel Cell Growth Media (EGM)-2 Microvascular (MV) Bullet Kitben (termékszám: CC-3162, Lonza, Hayward, CA, USA) szuszpendáltuk; kiegészítve 5 százalék borjúmagzati szérummal (FBS), 0,04 százalék hidrokortizonnal, 0,4 százalék humán fibroblaszt növekedési faktorral (hFGF) és 0,1 százalék vaszkuláris endoteliális növekedési faktorral (VEGF), R3-inzulinszerű növekedési faktorral (IGF) )-1, aszkorbinsav, humán epidermális növekedési faktor (hEGF) és gentamicin-szulfát/amfotericin (GA-1000) izolált EPC-k tenyésztéséhez. A sejteket CountessM Automated Cell Counter (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) segítségével megszámláltuk, mielőtt fibronektinnel bevont tenyésztőlemezekre/lombikokra oltottuk volna.

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>50 sejt/telep) a kolóniaképző egység (CFU) vizsgálattal.

2.2. Kondicionált tápközeg (CM) előállítása tenyésztett BM-MSC-ből

Mivel a BM-MSC-k hozzáadása az EPC-tenyészetekhez veszélyeztetné az EPC-hez kapcsolódó mérendő végpontokat, úgy döntöttek, hogy jobb lenne a BM-MSC-eredetű CM-nek az EPC-funkcióra gyakorolt ​​hatásait elemezni, ahogyan korábban az elemzéshez használtuk. más végpontok [19]. Röviden, a BM-MSC-ket Alpha-Minimum Essential Media (-MEM; Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Ausztrália) tenyésztésében 16 százalék borjúmagzati szérummal (FBS) és 1 százalék 200 mM L-glutamin és 1% penicillin/sztreptomicin. Miután a sejtek elérték a ~80 százalékos összefolyást, a BM-MSC-ket tovább tenyésztettük, és egy 12-lyuk lemezre szélesztettük ~0,5 × 10 fok/lyuk sűrűséggel, és a tenyészetben tartottuk 24-48 órán keresztül. hogy biztosítsák a sejtek kötődését. A kondicionált táptalaj (CM) előállításához BM-MSC-kből a sejteket rövid ideig háromszor mostuk előmelegített 1 ml 1× HBSS-sel. A mosási lépéseket követően 500 μL szérum és növekedési faktor mentes endothel sejtes bazális táptalaj (EBM); A #CC-3121.Lonza, Hayward, CA, USA) terméket a sejtekhez adtuk, és további 24 órán keresztül tenyészetben tartottuk 5% CO-n, 37 °C-on. Az inkubációs időszak végén a CM-et összegyűjtöttük, és 400 × g-vel centrifugáltuk 10 percig, hogy eltávolítsuk a sejttörmeléket. A CM-et 500 μl-es alikvotokban -80 fokon tároltuk a jövőbeni felhasználásig.

2.3. Funkcionális vizsgálatok

2.3.1. Tenyésztett késői EPC-k kezelése

Miután a késői EPC-ket begyűjtöttük, funkcionális vizsgálatokat végeztünk. Minden kísérletet a(z) 3-6 szakaszokban végeztek. Funkcionális vizsgálatokat végeztünk az (i) 25 százalék BM-MSC eredetű kondicionált tápközeg (25 százalék CM)[20]; (ii) 1 [RLX-1] vagy 10 [RLX-10 hatásának vizsgálatára. ]ng/mL [18] RLX (a H2 relaxin keringő szintjét jelenti terhes nőkben [21]); vagy(i) 25% CM és 1 vagy 10 ng/ml RLX együttes hatása; (iv) 20% FBS-t használtak pozitív kontrollként a kontroll betegekből származó késői EPC-k proliferációs és tubusképződési (angiogén) potenciáljára . A kezelt csoportokat a kezeletlen sejtekkel hasonlítottuk össze.

2.3.2. Életképességi és proliferációs vizsgálat

A késői EPC-k életképességét és proliferációs potenciálját a {{0}}(4,5-dimetitiazol-2-il)-2,5- difenil-tetrazólium-bromid (MTT) assay a gyártó utasításai szerint (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Ausztrália). Röviden, üregenként ~5×103 sejtet oltottunk 96-lyuklemezekre (BD Falcon, North Ryde, NSW, Ausztrália), majd a sejteket BM-MSC-eredetű CM-mel, RLX-vel (10 ng/ ml), vagy CM és RLX 1 vagy 10 ng/ml kombinációja 24 órán keresztül. Az inkubációs periódus végén 10 μl MTT jelölőreagenst (0,5 mg/ml, Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Ausztrália) adtunk hozzá, és további 4 órán keresztül inkubáltuk 37°C-on, 5 százalékos CO2 mellett. A sejteket 100 μl szolubilizációs oldat (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC Australia) hozzáadásával szolubilizáltuk, és a késői EPC-k proliferációs potenciálját úgy határoztuk meg, hogy az egyes minták abszorbanciáját 590 nm-en mértük Micro-plate segítségével. olvasó (Bio-strategy, Balwyn North, VIC, Ausztrália), és SoftMax Pro szoftverrel elemeztük Windows operációs rendszerhez (7.3-as verzió, Molecular Devices LLC, CA, USA). Mindegyik kezelési csoportot hat ismétlésben végeztük el és elemeztük.

2.3.3. Tube Formation Assay

A különböző kezelések hatását a késői EPC-k angiogén potenciáljának elősegítésére csőképződési vizsgálattal a μ-angiogenezis vizsgálattal (Abidi, Fitchburg, WI, USA) határoztuk meg. Röviden, 10 μl növekedési faktor-csökkentett (GFR) Matrigel-t (termék #356231, Corning, Tewksbury, MA, USA) adtunk az angiogenezis vizsgálati készlet μ-Slide (Abidi, Fitchburg, WI, WI, USA) belső üregébe. ). A késői EPC-k konfluens tenyészeteit a bevont sejtekre oltottuk, és BM-MSC-eredetű CM-mel, RLX-szel (10 ng/ml) vagy CM és RLX kombinációjával kezeltük 10 ng/ml koncentrációban. Mindegyik lyukba összesen 50 μl sejtszuszpenziót vittünk fel, amely ~1 × 104 sejtet tartalmazott. A képeket azonnal rögzítettük, és 0-óra időpontként jelöltük meg. A sejtek azon képessége, hogy különféle kezelések alatt

alakcsöveket figyeltek meg, és a képeket 2-24 órával a sejtoltás után fénymikroszkóppal rögzítettük. A csövek számát, hosszát és az elágazási pontok számát az ImageJ szoftverrel határoztuk meg.

2.3.4. Sebgyógyulási vizsgálat

A különböző kezelések hatását a késői EPC-k regenerációs potenciáljára sebgyógyulási vizsgálattal határoztuk meg. A vizsgálat elvégzéséhez ~ 1 × 10 sejtet szuszpendáltunk 50 μl tápközegben, és 35 mm-es edényben 2 lyukú szilikonba oltottuk be a sebgyógyulási vizsgálathoz (Abidi Inc., Fitchburg, WI, USA). Az edényekben mesterséges sebek keletkeztek a szilikon lyukak óvatos eltávolításával steril csipesszel (réstávolság =500±100 μm）). Az edényeket 2 ml 50 százalékos EGM-mel-2 pótoltuk, különféle anyagok hozzáadásával. kezelések, beleértve a BM-MSC-eredetű CM-et, RLX-et (10 ng/ml), vagy a CM és RLX kombinációját 1 vagy 10 ng/ml koncentrációban. A sebet lezáró sejtek számát fénymikroszkóppal határoztuk meg. A migrált sejteket a kezelés utáni 0-24 órával rögzítettük. A részáró terület százalékos arányát az Image] szoftverrel határoztuk meg.

2.3.5.Képelemzések

A funkcionális vizsgálatokhoz szükséges összes képelemzést ImageJ for MacOS (Ver. 1.8, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA) segítségével végeztük. A késői EPC-k csőképződési potenciáljára vonatkozóan a képeket az angiogenesis assay plugin segítségével elemeztük, és négy különböző paramétert rögzítettünk, beleértve a teljes hosszt, a hálók számát, a csomópontok számát és az ágak számát. A sebgyógyulási vizsgálathoz a sebzáródási területet úgy elemeztük, hogy minden időpontban manuálisan megjelöltük a sejtmentes területet. Minden mérést legalább 3 alkalommal végeztünk el a változás ellenőrzésére.

2.3.6. Immunfluoreszcencia

A Relaxin Family Peptide Receptor 1 (RXFP1; a rokon RLX receptor) fehérje lokalizációját tenyésztett késői EPC-kben immunfluoreszcens festéssel határoztuk meg. Először egy 13 mm-es (poli-D-lizinnel bevont) üveg fedőlemezen tenyésztett ~1×1{{20}} fokos sejteket egy 12-üreges lemezen rögzítettük 4 százalékos PFA-ban. 15 percig szobahőmérsékleten. A rögzített sejteket blokkoltuk a nem specifikus fehérjekötődéshez 1%-os szarvasmarha szérum albumin (BSA) alkalmazásával 60 percig szobahőmérsékleten. Az inkubációs időszak végén a sejteket PBS-ben mostuk 5 percig (3-szor), és nyúl poliklonális RXFP1 antitesttel (aa 609-624; A 9227; 1:2000; Immunodiagnostic AG, Bensheim, Németország) inkubáltuk. ) 0,01 százalékos BSA-ban éjszaka 4 fokon. A sejteket PBS-sel mostuk, és kecske-anti-nyúl Alexa-fluor 594 másodlagos antitesttel (1:500; Invitrogen, Scoresby, Victoria, Ausztrália) 0,01%-os BSA-ban inkubáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten. A nukleáris ellenfestést 40 μl DAPI hozzáadásával végeztük Vectashield rögzítőközegben (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), és fedőlemezzel. Az immunreaktív RXFP1 fehérjét fluoreszcens mikroszkóppal tettük láthatóvá 40-szeres nagyítással (Olympus BX51), és a képeket ImageJ szoftverrel egyesítettük.

2.4. Statisztikai elemzések

Az összes adatot átlag ± SEM-ként mutatjuk be, és minden statisztikai elemzést GraphPad Prism'M (9. verzió; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) segítségével végeztünk. Egy way-ANOVA-t használtunk a különböző kezelések hatásának összehasonlítására a késői EPC-k proliferációjára (MTT vizsgálat) és angiogén (csőképződési vizsgálat) potenciáljára, majd egy Tukey-féle post-hoc tesztet alkalmaztunk, hogy lehetővé tegyük a kezelési csoportok többszöri összehasonlítását. Ismételt mérési kétutas ANOVA-t alkalmaztunk a különböző kezelések késői EPC-k általi sebzáródásra gyakorolt ​​hatásának időbeli összehasonlítására, majd Tukey post-hoc tesztjét az egyes kezelési csoportok összehasonlítására. A 0,05-nél kisebb p-értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.